ĆWICZENIE 7
Metabolizm drobnoustrojów
Zad. 1. Oznaczanie aktywności dehydrogenazowej drobnoustrojów testem TTC.
W procesie utleniania związków organicznych zużycie każdego atomu tlenu wiąże się
z pobraniem od substratu dwóch atomów wodoru. Pomiar ilości wodoru może być miarą
pobranego tlenu, w związku z czym skorzystano z możliwości oznaczania aktywności
dehydrogenaz za pomocą sztucznego akceptora atomów wodoru, który zmienia swoje
zabarwienie na skutek redukcji. Substancją taką jest chlorek trójfenylotetrazolowy - TTC,
który jest akceptorem atomów wodoru bezpośrednio ze zredukowanych układów
flawinowych. Bezbarwny TTC ulega redukcji do czerwonego formazanu (trójfenylofurazonu
– TF).
Badanie aktywności dehydrogenazowej
Do czterech probówek wlać pipetą po 1 cm
3
buforu Tris o pH 8,4 i po 1 cm
3
zawiesiny
drobnoustrojów. Następnie do jednej probówki dodać 0,5 ml 1% roztworu glukozy, do drugiej
0,5 ml 2% sacharozy, do trzeciej 0,5 ml 0,1% roztworu skrobi, a do czwartej 0,5 ml 0,9%
roztworu NaCl (czwartą probówkę „K” włożyć do 100
0
C na 5 minut po czym schłodzić w
strumieniu wody z kranu do temp. pokojowej). Następnie do wszystkich 4 probówek
wprowadzić pipetą 0,4 cm
3
roztworu TTC i umieścić probówki w termostacie o temp. 37
°C.
Próby pozostawić na 30 min. Po 30 min. inkubacji określić aktywność dehydrogenazową
drobnoustrojów.
Zad. 2. Wykrywanie aktywności katalazowej drobnoustrojów
Katalaza, podobnie jak dehydrogenaza, należy do oksydoreduktaz. Jest to enzym
powszechnie występujący w komórkach organizmów tlenowych i jest jednym z najszybciej
działających enzymów (rozkłada truciznę – H
2
O
2
.). Mechanizm działania katalazy polega na
oderwaniu tlenu od jednej cząsteczki H
2
O
2
i przeniesieniu go na drugą cząsteczkę H
2
O
2
.
W efekcie dochodzi do rozpadu obu cząsteczek nadtlenku wodoru i wytworzenia dwóch
cząsteczek H
2
O oraz wydzielenia tlenu. Reakcja przebiega więc następująco:
