ĆWICZENIE 7

Metabolizm drobnoustrojów

Zad. 1. Oznaczanie aktywności dehydrogenazowej drobnoustrojów testem TTC.

W procesie utleniania związków organicznych zużycie każdego atomu tlenu wiąże się

z pobraniem od substratu dwóch atomów wodoru. Pomiar ilości wodoru może być miarą

pobranego tlenu, w związku z czym skorzystano z możliwości oznaczania aktywności

dehydrogenaz za pomocą sztucznego akceptora atomów wodoru, który zmienia swoje

zabarwienie na skutek redukcji. Substancją taką jest chlorek trójfenylotetrazolowy - TTC,

który jest akceptorem atomów wodoru bezpośrednio ze zredukowanych układów

flawinowych. Bezbarwny TTC ulega redukcji do czerwonego formazanu (trójfenylofurazonu

– TF).

Badanie aktywności dehydrogenazowej

Do czterech probówek wlać pipetą po 1 cm

3

buforu Tris o pH 8,4 i po 1 cm

3

zawiesiny

drobnoustrojów. Następnie do jednej probówki dodać 0,5 ml 1% roztworu glukozy, do drugiej

0,5 ml 2% sacharozy, do trzeciej 0,5 ml 0,1% roztworu skrobi, a do czwartej 0,5 ml 0,9%

roztworu NaCl (czwartą probówkę „K” włożyć do 100

0

C na 5 minut po czym schłodzić w

strumieniu wody z kranu do temp. pokojowej). Następnie do wszystkich 4 probówek

wprowadzić pipetą 0,4 cm

3

roztworu TTC i umieścić probówki w termostacie o temp. 37

°C.

Próby pozostawić na 30 min. Po 30 min. inkubacji określić aktywność dehydrogenazową

drobnoustrojów.

Zad. 2. Wykrywanie aktywności katalazowej drobnoustrojów

Katalaza, podobnie jak dehydrogenaza, należy do oksydoreduktaz. Jest to enzym

powszechnie występujący w komórkach organizmów tlenowych i jest jednym z najszybciej

działających enzymów (rozkłada truciznę – H

2

O

2

.). Mechanizm działania katalazy polega na

oderwaniu tlenu od jednej cząsteczki H

2

O

2

i przeniesieniu go na drugą cząsteczkę H

2

O

2

.

W efekcie dochodzi do rozpadu obu cząsteczek nadtlenku wodoru i wytworzenia dwóch

cząsteczek H

2

O oraz wydzielenia tlenu. Reakcja przebiega więc następująco:

H

2

O

2

+

H

2

O

2

KATALAZA

2 H

2

O + O

2

Badanie aktywności katalazowej

Do 2 probówek wprowadzić po 1 cm

3

badanych drobnoustrojów. Jedną probówkę, opisaną

„K”, włożyć na 5 min. do łaźni wodnej o temp. 100

°C, po czym schłodzić w strumieniu wody

z kranu do temp. pokojowej. Następnie do obu probówek wprowadzić po 0,5 cm

3

roztworu

H

2

O

2

i obserwować pojawiające się zmiany.

Zad. 3. Wykrywanie aktywności oksydazowej drobnoustrojów

Oksydazy są również enzymami z grupy oksydoreduktaz. Enzymy te przenoszą elektrony

z utlenianego substratu bezpośrednio na tlen cząsteczkowy. Oksydazay (wraz

z dehydrogenazami) tworzą w mitochondriach tzw. łańcuch oddechowy i katalizują procesy

oddychania komórkowego. W omawianym ćwiczeniu będzie wykrywana pewna specyficzna

grupa oksydaz nie biorących udziału w łańcuchu oddechowym. Przenoszą one elektrony

i protony ze związków fenolowych na tlen, dlatego są określane jako oksydazy fenolowe.

Związki fenolowe (np.pirokatechina) w wyniku utlenienia przechodzą w chinony, które

ulegają spontanicznej polimeryzacji z wytworzeniem ciemno zabarwionych barwników

melaninowych.

Badanie aktywności katalazowej

Do 2 probówek wlać po 2 cm

3

osadu czynnego. Jedną probówkę wstawić do łaźni

z wrzącą wodą na 5 min., a następnie schłodzić do temp. pokojowej. Do obu probówek wlać

po 10 kropli 1% roztworu pirokatechiny. Próby inkubować w temp. 40

°C przez 30 min.

Pojawienie się brunatnej barwy świadczy o aktywności oksydazowej próby.