1

MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI ĆWICZENIA 1

Sterylizacja i dezynfekcja to nie są synonimy!

Sterylizacja – całkowite usunięcie drobnoustrojów łącznie z formami przetrwalnikowymi.

Dezynfekcja – zniszczenie form wegetatywnych drobnoustrojów chorobotwórczych lub psujących
ż

ywność, nie musi niszczyć przetrwalników.

Pasteryzacja – działanie na drobnoustroje temperaturą poniżej 100˚C.

Sterylizacja - działanie na drobnoustroje temperaturą powyżej 100˚C.

Upperyzacja – w przypadku mleka, momentalne ogrzanie mleka do temperatury 135-150˚C i
natychmiastowym jego ochłodzeniu.

podstawowa aparatura mikrobiologiczna

Urządzenia do jałowienia w wysokiej temperaturze:
- autoklaw:

• metalowy kocioł
• podwójne ściany, podwójne dno, szczelna pokrywa, docisk na śruby
• system grzewczy (elektryczny lub gazowy)
• przyrządy kontrolne (manometry, termometry, wodowskazy)
• zawór bezpieczeństwa
• kurek odpowietrzający
• czynnik jałowiący – przegrzana para wodna pod zwiększonym ciśnieniem
• etapy sterylizacji: 1. nagrzewanie
2. sterylizacja właściwa temperatura na stałym poziomie
3. chłodzenie do temperatury otoczenia

• parametry: temperatura: 110-121˚C
czas: 15 – 60 minut (zależy od objętości pożywki)

• używanie autoklawu wymaga szczególnych zasad ostrożności
• do jałowienia pożywek, sprzęt itp.

- aparat Kocha:

• budowa prostsza niż autoklawu
• czynnik jałowiący – bieżąca para wodna o temp. 100˚C
• do sterylizacji pożywek, które nie mogą być sterylizowane w wyższej temp.
• czas sterylizacji: 15 – 60 minut (zależy od objętości i rodzaju materiału)
• w takich warunkach giną jedynie formy wegetatywne
• do całkowitej sterylizacji stosuje się tyndalizację (3-krotne ogrzewanie w 100˚C)

- suszarki:

• do prac analitycznych, do jałowienia szkła laboratoryjnego
• czynnik jałowiący suche, gorące powietrze
• dla lepszych efektów temperatura: 160 – 170˚C przez 1-2 h
• swobodny obieg powietrza

2

urządzenia do hodowli drobnoustrojów

- termostat (cieplarka):

• urządzenia do hodowli drobnoustrojów na pożywkach
• utrzymują stałą, określoną temperaturę wewnątrz komór
• optymalna temperatura

bakterie i promieniowce – 32˚C
drożdże i grzyby - 28˚C

- wytrząsarki:

• do hodowli wgłębnej drobnoustrojów w warunkach tlenowych
• do hodowli dynamicznej
• posiadają regulowane drgania, mogą być połączone z łaźnią wodną
• vortexy do pojedynczych prób

- łaźnie wodne:

• do hodowli w probówkach lub kolbkach, krótkotrwałe hodowle
• łatwiej osiągnąć wymagana temperaturę

- anaerostaty:

• do hodowli w warunkach beztlenowych
• próżnia lub atmosfera gazów obojętnych (N

2

, CO

2

), lub stosując odpowiednie substancje

pochłaniające tlen

- wirówki:

• różne typy, wielkość, regulowane obroty, praca okresowa lub ciągła
• do oddzielania komórek mikroorganizmów od pożywki płynnej
• 3000 – 4000 obrotów

- szafy chłodnicze i zamrażarki:

• do przechowywania kultur komórkowych, jałowych podłoży, roztworów witamin itp. w

warunkach chłodniczych

- szafy laminarne:

• umożliwiają zachowanie jałowości, przeprowadzanie różnych prac mikrobiologiczncyh bez

użycia palnika

• wyposażone w filtr bakteriologiczny, nawiew powietrza

- urządzenia do rozdrabiania prób:

• homogenizatory, stomacher, młynki, rozdrabniacze

3. Ogólne zasady mycia oraz jałowienia szkła, sprzętu, podłoży i powierzchni.

Szkło laboratoryjne powinno być czyste w sensie chemicznym i mikrobiologicznym.
Szkło nowe nie używane – wykazuje często odczyn alkaliczny – gotowanie 15-30 min. w 1% HCl,
płukanie, gotowanie 30 min. w 1% Na

2

CO

3

, płukanie w bieżącej, destylowanej wodzie.

Szkło używane – autoklawowanie, usunięcie hodowli, mycie pod bieżącą wodą z detergentem,
płukanie w wodzie bieżącej i destylowanej, suszenie w suszarce lub powietrzu.
Szkło bardzo zabrudzone i pipety w chromiance.
Sprzęt plastikowy – woda z detergentem.
Szkło umyte i wysuszone, owinięte w papier jałowi się w suszarce.

3

Szalki Petriego, pipety dodatkowo zabezpieczone korkami z waty w ustnikach, grupuje się do

jałowienia w metalowych tubusach.
Sterylizacja w suszarkach 2-4 godzin, 160˚C.
Ezy i igły przed użyciem wyjaławia się w płomieniu palnika gazowego.
Pożywki wyjaławia się w autoklawie lub w parze bieżącej w aparacie Kocha, lub przez sączenie.
Pasteryzacja dotyczy środków żywnościowych (mleko, piwo, moszcz owocowy)
Pomieszczenia wyjaławia się promieniami UV, filtrami bakteriologicznymi.

4. Mikroskop, budowa i technika mikroskopowania.

BUDOWA MIKROSKOPU ŚWIETLNEGO
a) części mechaniczne:

- podstawa (zawiera oświetlacz)
- statyw
- tubus
- stolik mikroskopowy
- śruba makrometryczna – zakres przesuwu kilkadziesiąt mm, pełny obrót śruby przesuwa układ

o 18 mm

- śruba mikrometryczna – zakres przesuwu 2 mm, skok 0,1 mm
- pokrętła śrub

b) części optyczne:

- aparat oświetlający (zwany aparatem Abbego) – kondensor i przysłona irysowa (diafragma),

kondensor zbudowany jest z 2-3 soczewek silnie skupiających światło na preparacie, a w
konsekwencji na soczewce czołowej obiektywu
przesłona irysowa reguluje ilość światła wpadającego do kondensora

- oświetlenie aparatu
- obiektywy:

• jest ich zwykle od 3 do 5, umieszczone są w tzw. rewolwerze
• powiększenia: 5, 10, 20, 40, 60, 100 razy (opisane na obudowie)
• zbudowany jest z kilku lub kilkunastu soczewek skupiających sklejonych balsamem kandyjskim,

umieszczonych w metalowej oprawce, najbliższa preparatu to soczewka czołowa

• obiektywy suche (powietrzne) i zanurzeniowe (immersyjne)

obiektywy suche (5-60 razy) – duże mikroorganizmy (algi, grzyby i pierwotniaki)

obiektywy zanurzeniowe (100 razy) – barwione preparaty bakteryjne i inne obiekty

wymagające dużego powiększenia

zasada działania

- obiektyw suchy – promienie trafiają do ośrodka optycznie rzadszego (powietrza) ulegają w nim

załamaniu oraz odbiciu i nie wszystkie trafiają do soczewki czołowej obiektywu

- obiektyw immersyjny – przestrzeń robocza pomiędzy preparatem a soczewka czołową

wypełnia płyn immersyjny (olejek cedrowy, rycynowy), o współczynniku załamania światła
zbliżonym do szkła, promienie świetlne przechodząc przez preparat trafiają na ośrodek
optycznie jednorodny, nie następuje zatem zjawisko rozproszenia światła, wszystkie promienie
ś

wietlne dochodzą do obiektywu

- okulary

• zbudowane są z soczewek płasko-wypukłych i powiększają na zasadzie lupy
• mają powiększenia od 2 do 30 razy
• soczewka bliżej oka to soczewka oczna, ta bliżej obserwowanego przedmiotu to soczewka

polowa

• stosuje się okulary Huygensa i Ramsdena)
• mikroskopy binokularne (dwa okulary) i monokularne (jeden okular)

4

• może być dodatkowa soczewka należy o niej pamiętać przy obliczaniu powiększenia

mikroskopu)

Zasada działania mikroskopu

- promienie świetlne (lusterko lub źródła światła sztucznego) zostają skierowane ze źródła

ś

wiatła poprzez aparat Abbego na preparat

- wiązka światła z aparatu Abbego przechodzi najpierw przez otwór przysłony irysowej, a

następnie zostaje skupiona w soczewkach kondensora

- z kondensora światło przechodzi przez otwór w stoliku na preparat, przy tym przejściu część

promieni ulega ugięciu na preparacie, a część przechodzi nie zmieniona dalej do ośrodka
znajdującego się między preparatem a soczewką czołową obiektywu

- promienie ugięte na preparacie i promienie oświetlenia tła trafiają do obiektywu – powstaje

pierwsze powiększenie przedmiotu (obraz rzeczywisty, powiększony i odwrócony)

- z obiektywu obraz trafia do okularu, otrzymujemy obraz powiększony, prosty i pozorny

Parametry charakteryzujące mikroskop:

- powiększenie mikroskopu – iloczyn powiększenia obiektywu i okularu, liczby oznaczające

powiększenie wyryte są na wymienionych elementach

- zdolność rozdzielcza mikroskopu określa, jak blisko siebie mogą leżeć dwa punkty, aby

patrząc na nie przez mikroskop można je było widzieć jako punkty oddzielne, zależy ona
wyłącznie od obiektywu

D = λ/2AN

D – najmniejsza odległość między punktami
λ

– długość fali światła

AN – apertura numeryczna obiektywu

apertura numeryczna – określa zdolność układu optycznego do przyjmowania światła

AN = n · sinα

n – współczynnik załamania światła środowiska między preparatem a obiektywem
α – kąt aperturowy utworzony przez skrajny promień wchodzący do soczewki czołowej
obiektywu a jego osią optyczną

• im krótsza jest fala światła i im większą aperturę liczbową posiada obiektyw, tym większa jest

zdolność rozdzielcza mikroskopu

• apertura numeryczna dla obiektywów suchych – poniżej 1,0
• apertura numeryczna dla obiektywu immersyjnego - powyżej 1,0 (1,2-1,6)
• zdolność rozdzielcza dla obiektywu immersyjnego – 0,2 µm (dł. fali 0.55 µm)
• zdolność rozdzielcza dla mikroskopu optycznego – 0,2 µm

- odległość robocza – odległość pomiędzy soczewką czołową obiektywu a preparatem w

momencie prawidłowego ustawienia ostrości obrazu, w miarę zwiększania powiększenia
odległość robocza maleje

- przestrzeń robocza – przestrzeń pomiędzy soczewką czołową obiektywu a preparatem w

chwili najlepszego widzenia

5

Zasady pracy z mikroskopem

- zapoznać się z budową i zasadą działania mikroskopu
- mikroskop w odległości 15-20 cm od skraju stołu
- w osi optycznej obiektyw o najmniejszym powiększeniu, odległość 2-3 cm od stolika
- przesłona irysowa całkowicie otworzona i włączone oświetlenie
- na stolik położyć preparat w zaciskach
- zbliżyć maksymalnie stolik do soczewki czołowej obiektywu (patrząc z boku), śrubą

makrometryczną ustawić kontur badanego preparatu, i jego obraz

- ostrość ustawić delikatnie za pomocą śruby mikrometrycznej
- przeglądać preparat, zmieniając obiektywy od najmniejszego do największego powiększenia,

ale przy każdej zmianie obiektywu oddalić najpierw obiektyw od preparatu i powtarzać
wszystkie czynności j/w

- preparat w immersji – obiektyw immersyjny w osi optycznej max podniesiony do góry, na

preparat nanieść kroplę olejku immersyjnego, patrząc z boku opuszczać obiektyw aż do
momentu zanurzenia soczewki czołowej w olejku, skorygować światło – aparat Abbego bardzo
blisko stolika, za pomocą śruby makro później mikro szukać obrazu preparatu, obiektyw cały
czas w olejku

- zasady porządkowe: nie pozostawiać resztek cieczy na soczewkach i stoliku

przykrywać mikroskop po skończonej pracy
soczewki czyścić specjalną szmatką
nic samowolnie nie wykręcać
olejek zetrzeć przy użyciu ściereczki i ksylenu.

Inne typy mikroskopów

Mikroskop do oglądania w ciemnym polu

- wykorzystano efekt Tyndalla – budując odpowiedni kondensor, który kieruje promienie światła

ukośnie do powierzchni szkiełka podstawowego, promienie odbijają się od tej powierzchni i
wracają do kondensora, a pole widzenia pozostaje ciemne; natomiast jeśli natrafia na obiekt
ulegają załamaniu lub ugięciu i wpadają do obiektywu)

- otrzymuje się jasny obraz obiektu na tle ciemnego pola, komórki wyglądają jakby same

emitowały światło

- do obserwacji żywych organizmów i ich ruchu, widać w nim nawet duże wirusy

niedostrzegalne w zwykłym świetlnym mikroskopie

Mikroskop do oglądania w ultrafiolecie

- fale światła UV są krótsze (180-400 nm)
- do oglądania komórek o wielkości 0,1 µm (w świetlnym o średnicy nie mniejszej niż 0,2 µm)
- soczewki wykonane z kwarcu, który przepuszcza promienie UV
- obrazy otrzymuje się na kliszy fotograficznej lub ekranie TV

Mikroskop fluorescencyjny

- związki fluorescencyjne (fluorochromy) – związki chemiczne absorbujące energię fal UV i

emitujące jako fale widzialne większej długości, mogą mieć określone zabarwienie w świetle
widzialnym

- nasycenie związkami fluorescencyjnymi mikroorganizmów spowoduje, że staną się one

widoczne w oświetleniu UV

- do wykrywania prątków gruźlicy czy różnicowania żywych i martwych komórek

Mikroskop kontrastowo-fazowy

- do badania żywych komórek dzięki zastosowaniu kontrastu fazowego bez konieczności

barwienia komórek

6

- specjalnie skonstruowany kondensor i obiektyw
- zasada działania: przesunięcie fali światła o 180˚ między promieniami przechodzącymi przez

obserwowany przedmiot a ugiętymi na preparacie, co zwiększa różnicę faz promieni
ś

wietlnych, które zostają przekształcone w różnice amplitudy

- dzięki takiemu stworzeniu kontrastu możliwe jest rozróżnienie szczegółów budowy obiektów

różniących się minimalnie grubością lub współczynnikiem załamania światła

Mikroskop konfokalny

- można uzyskać czytelny obraz struktur wnętrza całych nieskrojonych komórek podbarwionych

barwnikami fluorescencyjnymi

- stosuje się do zwykłego mikroskopu świetlnego przystawkę laserową
- światło laserowe oświetla preparat od strony okularu i skanuje pole widzenia, obraz jest

oświetlany punkt po punkcie wyłącznie w płaszczyźnie ostrości obrazu

- stosowany do badań cytologicznych

Mikroskop elektronowy

- rolę światła odgrywają wiązki elektronów o bardzo małej długości fali biegnących w wysokiej

próżni

- rolę soczewek spełniają soczewki elektrostatyczne lub elektromagnetyczne
- brak preparatów na szkiełkach podstawowych, są za to cienkie błony sporządzane z preparatów

za pomocą ultramikrotomu o grubości kilkuset nm, inne techniki przygotowywania preparatów
do tego mikroskopu to cieniowanie metalem lub barwienie negatywne

- możliwość obserwacji organizmów mniejszych od bakterii, wirusów i struktur wewnątrz

komórkowych

- wada – tylko preparaty martwe, specjalnie utrwalane w próżni co może powodować

uszkodzenia struktur i powstawanie artefaktów

Mikroskop skaningowy

- w tym mikroskopie wiązka elektronów przeczesuje powierzchnię preparatu i ulega odbiciu
- na monitorze jesteśmy w stanie zobaczyć jak wygląda powierzchnia badanego obiektu.

Dodatkowe informacje

- mikroskop optyczny
Najlepsze mikroskopy optyczne, działające na spolaryzowane światło ultrafioletowe osiągają
maksymalne powiększenie do ok. 3500x. Mikroskopy działające na zwykłe światło osiągają
maksymalne powiększenia rzędu 1500x.

- mikroskop elektronowy
Mikroskop elektronowy pozwala uzyskać powiększenia 250 000 razy. Powiększenie sięgające 5
mln razy można uzyskać w podobnych konstrukcjach, przy zastąpieniu elektronów wiązką jonów
(mikroskop jonowy), w szczególności jonów wodoru, czyli protonów (mikroskop protonowy).
Istnieją mikroskopy rentgenowskie, w których próbka oświetlana jest zogniskowaną wiązką
niskoenergetycznego promieniowania rentgenowskiego.