M

IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI

Ćwiczenie 11

WTŻ II rok

___________________________________________________________________________

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

1

M

IKROFLORA WODY

Woda jest naturalnym środowiskiem bytowania wielu organizmów żywych, w tym

drobnoustrojów. W zbiorniku wodnym organizmy można podzielić na 3 zasadnicze grupy:

-

producenci

– organizmy samożywne, wykorzystujące substancje nieorganiczne do budowy

związków organicznych, warunkują życie wszystkich pozostałych organizmów, należą tu

rośliny zielone, bakterie fotosyntetyzujące i chemosyntetyzujące,

-

konsumenci

– to mikroorganizmy zwierzęce żywiące się gotowymi substancjami

organicznymi w postaci żywych lub martwych organizmów,

-

reducenci

– to bakterie oraz grzyby, w większości saprofityczne, które żywią się ciałami

producentów, konsumentów i innych reducentów oraz organicznymi produktami metabolizmu

wszystkich organizmów, rozkładają związki organiczne do substancji prostych.

Mikroorganizmy pełnią w wodzie bardzo ważną rolę, należą tu przedstawiciele zarówno

producentów, jak i reducentów.

W wodach lądowych znaleźć można przedstawicieli prawie wszystkich grup

drobnoustrojów, obok form typowo wodnych występują tu także drobnoustroje bytujące

normalnie w glebie, powietrzu, przewodach pokarmowych ludzi i zwierząt.

Skład jakościowy i ilościowy drobnoustrojów w wodzie zależy od warunków przyrodniczych,

klimatycznych, meteorologicznych, rodzaju dna, pory roku, pory doby oraz charakteru,

jakości i głębokości wody.

Drobnoustroje występujące w wodzie można podzielić na 2 grupy.

1.

Mikroflora autochtoniczna

(tubylcza) to drobnoustroje naturalnie bytujące i

rozmnażające się w środowisku wodnym.

Najbardziej typowe mikroorganizmy wodne to autotrofy (foto- i chemotrofy) i heterotrofy,

zdolne do wzrostu nawet w obecności śladowych ilości substancji odżywczych. Do grupy tej

należą:

- bakterie siarkowe z rodzajów Beggiatoa, Thiothrix, Thiobacillus, Thiorhodaceae,

Chlorobium, wykorzystujące siarczany, siarczki, tiosiarczany i siarkę elementarną w swoich

procesach życiowych,

M

IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI

Ćwiczenie 11

WTŻ II rok

___________________________________________________________________________

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

2

Beggiatoa sp. – żółte kuleczki
w nitkach to siarka

Thiothrix

Chlorobium – zielone bakterie siarkowe, które utleniają

H

2

S, początkowo do siarki elementarnej (S

0

), a w

przypadku całkowitego wyczerpania siarkowodoru

utleniają siarkę S

0

do siarczanu (SO

4

2-

). Siarka jest

gromadzona w postaci zewnątrzkomórkowych białych

granulek, które powodują, że hodowla ma wygląd

mleczny.

M

IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI

Ćwiczenie 11

WTŻ II rok

___________________________________________________________________________

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

3

- bakterie żelaziste z rodzajów Leptothrix, Gallionella, Crenothrix, Clonothrix (mogą

powodować zatykanie i korozję przewodów wodnych),

Leptothrix – potrafią utleniać zarówno Fe(II), jak i Mn(II).

Gallionella – utlenia i akumuluje żelazo (w postaci

Fe(OH) lub FeOOH) wokół swoich spiralnie

skręconych nici

- inne bakterie, m.in. z rodzajów Vibrio, Pseudomonas, Achromobacter, Spirochaeta,

Aeromonas, Selenomonas, Spirillum,

M

IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI

Ćwiczenie 11

WTŻ II rok

___________________________________________________________________________

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

4

- grzyby z rodzajów Mucor, Leptomitus, Saprolegnia

Leptomitus lacteus

Saprolegnia – częsta

pleśń w środowisku wodnym, powoduje

infekcje ryb i pleśnienie jaj (ikry)

2.

Mikroflora allochtoniczna

(naniesiona) przedostaje się do wód (głównie

powierzchniowych):

 z powietrza i gleby,



ze ścieków przemysłowych (drożdżowni, browarów, zakładów mięsnych i

mleczarskich),



z przewodu pokarmowego człowieka i zwierząt bezpośrednio wraz z

odchodami lub za pośrednictwem ścieków komunalnych.

M

IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI

Ćwiczenie 11

WTŻ II rok

___________________________________________________________________________

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

5

Ze względu na znaczenie dla zdrowia i gospodarki człowieka mikroorganizmy można

podzielić na saprofityczne (nieszkodliwe, wyżej wymienione autotrofy i heterotrofy),

patogenne (chorobotwórcze) i szkodliwe w określonych gałęziach przemysłu.

Bakterie patogenne należą do drobnoustrojów allochtonicznych i dostają się do wody z

przewodu pokarmowego ludzi i zwierząt. W wodzie nie rozmnażają się, lecz są przenoszone

na następnego żywiciela. Drogą wodną przenoszone są:



cholera przenoszona przez przecinkowca cholery (Vibrio cholerae, w wodzie

powierzchniowej przeżywa do kilku tygodni, w wodociągowej kilka dni),



dur brzuszny powodowany przez pałeczkę duru

brzusznego (Salmonella Typhi),



czerwonka - pałeczki czerwonki (Shigella flexneri i

Shigella sonnei)



tularemia - Pasteurella (Francisella) tularensis.

Wystarczy 10 komórek Francisella tularensis, aby wywołać u ludzi ciężką, podobną do dżumy chorobę
– tularemię .Bakteria znajduje się na liście substancji biologicznych, co do których istnieją możliwości
użycia ich w ataku terrorystycznym.

Mogą być także tą drogą przenoszone brucelloza, żółtaczka zakaźna, gorączka błotna oraz

enterowirusy (wirusy Polio).

Podczas analiz mikrobiologicznych wody niemożliwe jest badanie wszystkich

organizmów chorobotwórczych, ze względu na ich niewielkie ilości w porównaniu z

pozostałą mikroflorą oraz specyficzne wymagania pokarmowe. Dlatego do wykrywania

zanieczyszczeń kałowych w wodzie wykorzystuje się badanie obecności tzw.

mikroorganizmów wskaźnikowych (tab. 1). Są to inne bakterie, występujące obficie w

przewodzie pokarmowym, łatwe w hodowli i zasadniczo nieszkodliwe w stosunku do ludzi,

które dostają się do wody z wydalinami ludzkimi lub zwierzęcymi. Badania mikroflory

jelitowej ustaliły stałe występowanie trzech różnych rodzajów

bakterii wskaźnikowych

,

świadczących o kontakcie wody z fekaliami lub ściekami:

- pałeczka okrężnicy (Escherichia coli) i Enterobacter aerogenes,

- paciorkowce kałowe z typowym gatunkiem Enterococcus faecalis,

- beztlenowce przetrwalnikujące Clostridium perfringens.

M

IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI

Ćwiczenie 11

WTŻ II rok

___________________________________________________________________________

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

6

Stwierdzenie zawartości bakterii z grupy coli powyżej normy (tab. 2) świadczy o

fekalnym zanieczyszczeniu wody, a tym samym o możliwości występowania bakterii

chorobotwórczych.

Tabela 1.

Wymagania mikrobiologiczne dla wody pitnej i na potrzeby gospodarcze

Wskaźnik jakości wody

Woda z wodociągów

sieciowych

dezynfekowana

Woda z wodociągów

sieciowych

niedezynfekowana

Woda z wodociągów

lokalnych, studni

publicznych i studni

zakładowych

Podawana

do sieci

W sieci

Podawana do

sieci

W sieci

Liczba bakterii grupy coli
typu kałowego w 100 cm

3

0

0

0

0

0

Liczba bakterii grupy coli
w 100 cm

3

0

1

1

2

2

Liczba kolonii bakterii na
agarze odżywczym po
24h, 37



C w 1 cm

3

10

20

20

40

40

Liczba kolonii bakterii na
agarze odżywczym po
24h, 20



C w 1 cm

3

50

100

100

200

X – nie oznacza się

Tabela 2.

Wskaźniki bakteriologiczne jakości wody do picia

Rodzaj oznaczenia

Objętość próbki [cm

3

]

Dopuszczalna ilość bakterii

Escherichia coli lub bakterie grupy coli
typu kałowego (termotolerancyjne)

100

0

Bakterie grupy coli

100

0

Paciorkowce kałowe

100

0

Clostridium sp. redukujące siarczany

20

0

Ogólna liczba bakterii w temp. 37°C

1

10

Ogólna liczba bakterii w temp. 20°C

1

100

Zgodnie z obowiązującymi w Polsce przepisami, sanitarna ocena wody polega na

określeniu liczby bakterii

psychrofilnych

oraz

mezofilnych

w 1

cm

3

badanej wody oraz

ustaleniu tzw.

miana coli

.

M

IANO COLI

Miano coli jest to najmniejsza objętość badanej wody lub ścieków (w cm

3

), w

której stwierdza się jeszcze obecność bakterii z grupy coli. Miano coli jest wartością

niemianowaną. Jeśli miano coli wynosi 10 to znaczy, że w 10 cm

3

znajduje się co najmniej

1 komórka bakterii z grupy pałeczki okrężnicy. Wartość miana coli jest odwrotnie

proporcjonalna do stopnia zanieczyszczenia wody!

M

IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI

Ćwiczenie 11

WTŻ II rok

___________________________________________________________________________

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

7

Za bakterie z grupy coli uważa się gramujemne pałeczki nie wytwarzające

przetrwalników, rozwijające się w warunkach względnie beztlenowych, mające zdolność

fermentowania laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu, w ciągu 48 h hodowli w temp.

35-37°C. Tryptofan redukują do indolu. Należą do niej bakterie z rodzaju Escherichia,

Citrobacter, Enterobacter i Klebsiella.

S

AMOOCZYSZCZANIE WODY

Z biologicznego punktu widzenia zanieczyszczeniami są czynniki działające

szkodliwie na organizmy ludzi i zwierząt w przypadku korzystania z wody do celów

konsumpcyjnych. Czynnikami tymi może być nadmierne stężenie soli, substancji

organicznych, zmieniona temperatura wody, radioaktywność, mętność i barwa, a także

obecność bakterii i wirusów chorobotwórczych.

Samooczyszczanie

jest

naturalnym procesem usuwania zanieczyszczeń

chemicznych

przy

udziale

czynników

biologicznych

i

fizykochemicznych.

Zanieczyszczenia po rozcieńczeniu wodą odbieralnika, po sedymentacji i adsorpcji zawiesin

ulegają mineralizacji przy udziale mikroorganizmów wodnych, jak bakterie, promieniowce,

grzyby, pierwotniaki, sinice i wiciowce. Przy wystarczającej ilości tlenu w wodzie, w wyniku

mineralizacji otrzymuje się wodę przejrzystą i pozbawioną zapachu. Przy braku wolnego

tlenu proces mineralizacji prowadzą bakterie beztlenowe, a produktami rozkładu

zanieczyszczeń są kwasy organiczne, aminy, amoniak, metan, siarkowodór, indol, skatol i

inne związki, które nadają wodzie przykry zapach (indol, skatol) lub mają właściwości trujące

(amoniak, siarkowodór). Woda uzyskana w drodze oczyszczania beztlenowego jest nadal

mętna i cuchnąca.

Poza czynnikami biotycznymi, czyli organizmami żywymi, wpływ na samooczyszczanie

wody mają również czynniki abiotyczne, jak zawartość tlenu, temperatura wody, odczyn

środowiska, obecność substancji toksycznych i radioaktywnych.

Zawartość tlenu jest związana z oddychaniem drobnoustrojów. Przy dużym

zanieczyszczeniu może dojść do całkowitego wyczerpania tlenu., Ilość tlenu (w mg na litr

wody), która zostanie zużyta przez mikroorganizmy (heterotrofy) na mineralizację

zanieczyszczeń nosi nazwę biochemicznego zapotrzebowania na tlen (BZT). W praktyce

oznacza się zwykle BZT

5

, czyli biochemiczne zapotrzebowanie na tlen w czasie 5 dni.

M

IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI

Ćwiczenie 11

WTŻ II rok

___________________________________________________________________________

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

8

O

KREŚLANIE LICZBY BAKTERII PSYCHRO

-

I MEZOFILNYCH W WODZIE

Posiewu bakterii na agar odżywczy dokonuje się w dwóch równoległych powtórzeniach.

Wodę wodociągową należy posiewać bezpośrednio, pobierając 1 cm

3

wody i przenosząc na

płytkę Petriego. Dodatkowo posiewu dokonuje się często z rozcieńczenia 10

-1

. Wodę

powierzchniową wysiewa się z rozcieńczeń 10

-3

i 10

-5

, a ścieki miejskie z rozcieńczeń 10

-6

i

10

-8

. Następnie płytki odwraca się do góry dnem i jedną z nich wstawia do cieplarki o temp.

20°C, drugą do cieplarki o temp. 37°C. Czas hodowli w pierwszym przypadku dla bakterii

psychrofilnych wynosi 72 h, a w drugim – dla bakterii mezofilnych wynosi 24 h.

O

ZNACZANIE BAKTERII GRUPY COLI METODĄ FERMENTACYJNO

-

PROBÓWKOWĄ

Bakterie grupy coli można wykryć metodą fermentacyjno-probówkową, a wynik podać jako

miano coli. Wykrywanie tych bakterii oparte jest na zdolności do fermentowania laktozy

z wytworzeniem w podłożu kwasu oraz gazu. Posiewów dokonuje się na podłoże

Eijkmana (LPB - zawiera laktozę i wskaźnik purpurę bromokrezolową) z rurką Durhama

wewnątrz, a następnie inkubuje w temp. 37°C przez 24 lub 48 godzin.

Za wynik dodatni posiewu (obecność bakterii z grupy coli)

przyjmuje się obecność gazu w probówce Durhama (nie mniej niż

1/10 objętości), zmętnienie pożywki i zmianę jej barwy z fioletowej

na żółtą. Jeśli po 24 godzinach powyższe zmiany nie wystąpią,

wówczas próbki inkubuje się dalej i ponownie odczytuje po 48 h.

Wodę wodociągową (pitną), której miano powinno być większe niż:

100 – wysiewa się systemem = 50 cm

3

i 5x10 cm

3

(ewentualnie 5x10

cm

3

i 1 cm

3

).

Jeśli dopuszczalne miano coli wody badanej wynosi:

50 – wysiewa się = 5x10 cm

3

, 1 cm

3

oraz 10

-1

cm

3

10 – wysiewa się = 2x10 cm

3

, 1 cm

3

oraz 10

-1

cm

3

.

Wykonuje się to w ten sposób, że do 5 probówek lub butelek zawierających po 10 cm

3

podwójnie stężonego podłoża wprowadza się po 10 cm

3

wody wodociągowej z kolejnych

M

IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI

Ćwiczenie 11

WTŻ II rok

___________________________________________________________________________

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

9

rozcieńczeń. Wodę powierzchniową posiewa się bezpośrednio oraz z kolejnych rozcieńczeń

(10

-1

, 10

-2

, 10

-3

, 10

-4

itd.).

Schemat rozcieńczeń i posiewów przy oznaczaniu miana coli: 5 x 10 cm

3

, 1 cm

3

, 10

-1

cm

3

, 10

-2

cm

3

, 10

-3

cm

3

Pojawienie się bardzo małej ilości gazu, przy

jednoczesnym bardzo słabym zakwaszeniu lub braku

zakwaszenia, uważa się za wynik wątpliwy. Hodowle,

których wyniki po 24 godzinach inkubacji uznano za

wątpliwe, poddaje się badaniu potwierdzającemu, a następnie

inkubuje dalej do 48 h. W przypadku wątpliwości wykonuje

się posiew na podłoże Endo oraz próby biochemiczne np. na

wytwarzanie indolu.

Badania potwierdzające należy wykonać przesiewając bakterie jałową ezą z podłoża

laktozowego na pożywkę Endo. Inkubację należy prowadzić w temp. 37°C w ciągu 24

godzin. Bakterie grupy coli rosną na pożywce Endo w postaci ciemnoczerwonych kolonii o

metalicznym (fuksynowym) połysku. W przypadku obecności chociażby jednej takiej kolonii

na pożywce Endo, wynik badania potwierdzającego należy uznać za dodatni.

Próba na indol

Probówki zawierające wodę peptonową z tryptofanem szczepi się 1 ml badanej wody

bezpośrednio lub z rozcieńczenia. Po 48-godzinnej inkubacji w temperaturze 37°C nanosi się

po ściance kilka kropel odczynnika Ehrlicha, który w obecności indolu barwi się na różowo.