ELEKTROFOREZA
Technika analityczna, rzadziej preparatywna, stosowana w chemii i biologii molekularnej, zwłaszcza w
genetyce. Jej istotą jest rozdzielenie mieszaniny związków chemicznych na możliwie jednorodne frakcje
przez wymuszanie wędrówki ich cząsteczek w polu elektrycznym. Biocząsteczka (DNA) przemieszcza się
w polu elektrycznym od ujemnej elektrody katody ( – ) do dodatniej elektrody anody ( + ) i przeciskając
się przez pory żelu, rozdziela się pod względem wielkości i ładunku.
Cząsteczki różnych substancji różnią się zwykle ruchliwością elektroforetyczną. Parametr ten jest w
przybliżeniu wprost proporcjonalny do ładunku elektrycznego cząsteczki i odwrotnie proporcjonalny
do jej wielkości. Zależy także od kształtu cząsteczki.
Elektroforeza żelowa
W elektroforezie żelowej ośrodkiem, w którym przemieszczają się badane substancje jest żel
elektroforetyczny wykonany z agarozy, poliakrylamidów, agaru lub skrobi (metoda historyczna),
uformowany w płytkę długości kilkunastu - kilkudziesięciu centymetrów i grubości od ułamka do kilku
milimetrów (rzadziej jest to słupek - elektroforeza dyskowa). Kroplę analizowanej mieszaniny nanosi się
w zagłębienie w żelu - studzienkę. Próbka rozpuszczona jest z reguły w roztworze o większej gęstości
(np. w formamidzie), dzięki czemu rozpływa się na dnie studzienki, a po włączeniu zasilania migruje do
żelu, jako wąski prążek. W zależności od techniki, cały żel lub jego końce zanurzone są w przewodzącym
prąd roztworze buforowym. Wzdłuż krawędzi żelu, zwykle na dwóch przeciwległych bokach płytki,
biegną, elektrody, do których przykłada się stałe lub asymetryczne pulsujące napięcie elektryczne rzędu
50-3000 V. Ze względu na zróżnicowaną mobilność elektroforetyczną, ruchliwsze (zazwyczaj mniejsze)
cząsteczki oddalają się szybciej od miejsca naniesienia próbki. Przebieg elektroforezy można
monitorować nanosząc (na osobnych ścieżkach lub razem z preparatem) specjalne barwniki (tzw.
markery) o znanej mobilności elektroforetycznej.
Po zakończeniu procesu żel wydobywa się z aparatu i analizuje przez wybarwienie bądź
obserwację absorpcji światła (zazwyczaj UV) przez żel. Wizualizację elektroforegramów preparatów
znakowanych izotopowo uzyskuje się przez zaczernienie kliszy fotograficznej (autoradiogram). W
przypadku technik preparatywnych obszary żelu zawierające pożądany produkt wycina się i poddaje
procesowi elucji.
Elektroforeza jest najczęściej stosowana do rozdzielania DNA, RNA lub białek wyekstrahowanych
z komórek lub syntetycznych. Jest też czasami stosowana, jako jedna z technik pomiaru masy
cząsteczkowej i badania polidyspersji polimerów syntetycznych. Jeśli badaczowi zależy na ograniczeniu
wpływu kształtu cząsteczek na szybkość ich elektroforetycznej wędrówki i na ściślejszym powiązaniu ich
ruchliwości z masą cząsteczkową, to może badane substancje poddać denaturacji, np. przy pomocy
detergentu SDS (w przypadku białek) lub mocznika (w przypadku DNA lub białek).
Z poziomu molekularnego elektroforeza polega na ukierunkowanym przesuwaniu analizowanych
cząsteczek przez prąd i ich interakcji z fazą stałą żelu, która w tej cząsteczkowej skali wygląda jak
przestrzenna sieć. Bardziej ruchliwe są mniejsze cząsteczki, bo łatwiej się przeciskają przez tą sieć,
większe się opóźniają. Plusowy prąd uruchamia te, które 'utknęły' po drodze i daje lepszej jakości
rozdział.
Ponieważ rozmiary kwasów nukleinowych są często bardzo znaczne, trudno jest je analizować za
pomocą zwykłej elektroforezy. Ograniczenia klasycznej metody w żelu agarozowym pojawiają się w
przypadku długich fragmentów DNA, których powyżej pewnej, krytycznej długości nie da się rozdzielić.
Wynika to z faktu, iż cząsteczki kwasów nukleinowych pozostają w dynamicznej równowadze pomiędzy
formą zwiniętą (bardziej globularną) i rozciągnięta (bardziej liniową), podczas migracji przez porowaty
ośrodek, jakim jest żel agarozowy. Kiedy cząsteczki DNA są tak długie, że ich forma globularna nie może
swobodnie migrować przez nawet duże pory ko migrują mimo różnych długości. To ograniczenie można
ominąć stosując pulsujące, oraz o zmiennym kierunku przyłożone napięcie. Z każdą zmiana kierunku,
cząsteczki DNA zmieniają orientację swoich długich osi.
Wyróżnia się kilka rodzajów elektroforezy umożliwiających analizę materiału wielkości nawet 7Mpz (czyli
całych chromosomów):
PFGE – elektroforeza żelowa w pulsującym polu elektrycznym
FIGE – elektroforeza żelowa w pulsującym, odwracalnym polu elektrycznym
CHEF – elektroforeza żelowa w pulsującym polu elektrycznym o stałej płaszczyźnie
RODZAJE ŻELI:
Agaroza:
To polisacharyd będący polimerem pochodnych galaktozy, otrzymywany z glonów morskich
(krasnorostów)
Charakteryzują się znacznie uboższym usieciowaniem i większymi porami. Pozwala to na separację
znacznie większych makrocząsteczek białkowych, oraz znacznie większych fragmentów kwasów
nukleinowych (50 - 30 000 bp).
Służy, jako podłoże do rozdzielania kwasów nukleinowych. Fragmenty DNA migrują w żelu w kierunku
elektrody dodatniej – anody (DNA ma bardzo silny ujemny ładunek ze względu na obecność fosforanów
z wolnym wiązaniem każda gr. –PO
4
-
pomiędzy cukrami ma jednostkowy ładunek ujemny). DNA jest
barwiony poprzez dodanie bromku etydyny do żelu lub poprzez nasycenie żelu r-rem bromku etydyny
po zakończeniu elektroforezy. DNA jest widoczny w postaci pomarańczowego prążka podczas
naświetlania UV.
Elektroforeza horyzontalna
Poliakrylamid PAM:
Polimer z grupy poliakrylanów otrzymywany przez polimeryzację akryloamidu. Żel powstaje przez
spontaniczne sieciowanie w wyniku reakcji grup aminowych z karbonylowymi. Gdy reakcja ta jest
przeprowadzana w wodzie, łatwo jest otrzymać stabilne hydrożele.
Charakteryzuje się bardzo gęstym usieciowaniem i niewielkimi porami, co umożliwia separację
makrocząsteczek białkowych lub polinukleotydów o wielkości 5 - 2 000 pz.
Elektroforeza wertykalna
Agar-agar, agar:
substancja żelująca, której głównym składnikiem jest trudno przyswajalny przez człowieka cukier
galaktoza.
Elektroforeza kapilarna
zwana też elektroforezą w wolnym buforze służy najczęściej do rozdziału niewielkich cząsteczek. Metoda
ta jest często stosowana w biologii molekularnej do analizy DNA, znacznie rzadziej do rozdziału
peptydów. Rozdział mieszanin prowadzony jest w cienkiej (wewn. średnica 25-100 µm) i długiej (0.5-1
m) kapilarze kwarcowej, przypominającej z wyglądu światłowód. Kapilara ta wypełniana jest buforem.
Próbka wprowadzana jest do wlotu kapilary, po czym jest do niej przykładane wysokie napięcie
elektryczne (do 30 kV). U wylotu kapilary zamontowany jest detektor, który rejestruje wychodzenie z
rurki kolejnych związków chemicznych. Bufor płynie przez kapilarę ze stałą szybkością w stronę jednej z
elektrod. Dla układu wodnego jest to zwykle katoda.
Technika ta umożliwia rozdzielanie anionów i kationów soli organicznych i nieorganicznych.
Odmianą elektroforezy kapilarnej jest micelarna elektrokinetochromatografia (MEKC). W tej
technice w buforze rozdziałowym znajduje się rozpuszczony detergent jonowy (np. dodecylosiarczan
sodu - SDS) w takim stężeniu, aby tworzyć trwałą emulsję. Emulsja ta składa się z miceli, które są
hydrofobowe wewnątrz i naładowane elektrycznie na swojej powierzchni.
Micele te dzięki swemu ładunkowi poruszają się z inną prędkością niż reszta buforu, a w ich
wnętrzach zamknięte są cząsteczki związków chemicznych tworzących analizowaną mieszaninę. Pozwala
to rozdzielać związki chemiczne, które nie przyjmują ładunku elektrycznego nawet po przyłożeniu
dużego napięcia. Metoda ta umożliwia rozdział i analizę niemal wszystkich związków chemicznych
rozpuszczalnych w wodzie.
SEKWENCJONOWANIE DNA
Wymagana jest jednoniciowa matryca DNA, na której syntetyzowane są komplementarne kopie –
DNA przed sekwencjonowaniem musi być klonowany w wektorze fagowym M13.
Z jednoniciowym DNA z faga łączy się na zasadzie hybrydyzacji 15–17 nukleotydowy starter
komplementarny do rejonu w pobliżu połączenia wektora z insertem. Dzięki temu wszystkie sekwencje
klonowane w tym wektorze mogą być sekwencjonowane z użyciem 1 uniwersalnego startera.
Do mieszaniny zawierającej
Starter połączony z matrycą dodaje się:
+ enzym – polimerazę DNA (zwykle polimeraza Klenowa lub z faga T7)
+ małą ilość [α –
35
S]dATP (w którym jeden atom tlenu przy fosforze α został
zastąpiony siarką) – dodajemy jeśli starter nie został oznakowany
Całość rozdziela się do 4 probówek, z których każda zawiera inny terminator (ddNTP) wydłużania
łańcucha, zmieszany z normalnymi dNTP, dodany w takim stosunku, aby zapewnić zahamowanie syntezy
tylko ograniczonej liczby łańcuchów. Cztery zestawy produktów reakcji, analizowane następnie z
zastosowaniem PAGE (elektroforeza w żelu poliakrylamidowym) – prowadzą zwykle do pojawienia się
mniejszej liczby prążków artefaktowych.
ddNTP – dideoksynukleotydy
ddATP
ddTTP
ddCTP
ddGTP
ddNTP stosuje się do zatrzymania enzymatycznej syntezy kopii matrycy. Starter „sekwencyjny”
przyłącza się do jednoniciowej matrycy i polimeraza DNA wykorzystując DTP wydłuża starter. Produkty
wydłużania rozdziela się na 4 porcje i w każdej z nich blokuje się wydłużanie łańcucha poprzez dodanie 1
z 4 ddNTP.
Dideoksynukleotydy działają, jako terminatory wydłużania łańcucha, ponieważ nie zawierają gr.
3’–OH – przy trzecim atomie węgla( zamiast niej występuje związany fosforan), a ta właśnie grupa
byłaby potrzebna do przyłączenia następnego nukleotydu.
Skład mieszaniny reakcyjnej:
Matryca (1niciowe DNA)
Starter
[α –
35
S]dATP (opcjonalnie)
Polimeraza DNA (np. z faga T7)
dATP
dTTP
dCTP
dGTP
ddATP
ddTTP
ddCTP
ddGTP
Jedną z najczęściej obecnie stosowanych metod sekwencjonowania DNA jest metoda Sangera.
Opiera się ona na przedwczesnej terminacji syntezy DNA, wynikającej z przypadkowego włączenia przez
polimerazę DNA dideoksynukleotydów (analogi nukleotydów bez grupy -OH w pozycji 3', Rys. 7).
Przedstawiono również oligonukleotyd, ktorego synteza zakończyła się w wyniku wbudowania
dideoksynukleotydu.
Rys. 7.
Budowa deoksynukleotydu i
wyznakowanego fluorescencyjnie
dideoksynukleotydu
Przedstawiono również
oligonukleotyd, ktorego synteza
zakończyła się w wyniku
wbudowania dideoksynukleotydu
Synteza DNA zapoczątkowana jest ze starterów komplementarnych do fragmentu DNA, którego
sekwencję chcemy ustalić. Jeden z końców starterów znakuje się radioaktywnie lub fluorescencyjnie. W
klasycznej metodzie sekwencjonowania prowadzi się jednocześnie 4 oddzielne reakcje, z których każda
zawiera w mieszaninie reakcyjnej jeden z dideoksynukleotydow (dideoksy-ATP, -GTP, -CTP lub -TTP) oraz
znaczną ilość czterech "normalnych" deoksynukleotydow. Inkorporacja dideoksynukletydu do rosnącego
łańcucha DNA powoduje zahamowanie dalszej jego syntezy, gdyż brak grupy hydroksylowej w pozycji 3'
uniemożliwia przyłączenie kolejnego nukleotydu. Powstaje seria wyznakowanych fragmentów DNA,
kończących się zasadą reprezentowaną przez didoksynukleotyd występujący w danej mieszaninie
reakcyjnej. Fragmenty te rozdziela się ze względu na wielkość za pomocą elektroforezy. W przypadku
znakowania starterów izotopami promieniotwórczymi obraz rozdzielonych fragmentów DNA uzyskuje
się poprzez wykonanie autoradiografii na kliszy rentgenowskiej. Sekwencja DNA odpowiada kolejności
fragmentów odczytanej z żelu.
dNTP – służą wydłużaniu łańcucha, jako substrat dla polimerazy DNA
5’ – …CACTGATGAGTCCGTGAACGAAACGG………………….. – 3’
1niciowa matryca DNA
3’ – …GTGACTACTCTGGCACTTGCTTTGCC……….ШШШШ – 5’
Sekwencja syntez. nici
Starter
↓
+ ddATP
3’ A……….. ШШШШ 5’
3’ A……………….. ШШШШ 5’
3’ A……………………….. ШШШШ 5’
3’ A…………………………….….. ШШШШ 5’
+ ddCTP
3’ C……….. ШШШШ 5’
3’ C……..…….. ШШШШ 5’
3’ C……………..….. ШШШШ 5’
3’ C……………………….. ШШШШ 5’
3’ C………………………….….. ШШШШ 5’
3’ C…………………………………….. ШШШШ 5’
3’ C……………………………………………….. ШШШШ 5’
3’ C…………………………………………………….…….. ШШШШ 5’
+ ddGTP
3’ G……….. ШШШШ 5’
3’ G…………..….. ШШШШ 5’
3’ G……………….…….. ШШШШ 5’
3’ G………………………………….….. ШШШШ 5’
3’ G……………………………………………….. ШШШШ 5’
3’ G………………………………………………….….. ШШШШ 5’
+ ddTTP
3’ T……….. ШШШШ 5’
3’ T……………….….. ШШШШ 5’
3’ T………………………..….. ШШШШ 5’
3’ T………………………………….. ШШШШ 5’
3’ T……………………………………….. ШШШШ 5’
3’ T……………………………………………….….. ШШШШ 5’
3’ T…………………………………………………………….... ШШШШ 5’
3’ T……………………………………………………………….….. ШШШШ 5’
Rys. 8. Sekwencjonowanie DNA wg metody Sangera (dideoksy). Znakowanie syntetyzowanych
fragmentów DNA uzyskuje się przez znakowanie starterów (przed rozpoczęciem reakcji
sekwencjonowania) lub wbudowanie wyznakowanego deoksynukleotydu w czasie reakcji
sekwencjonowania
W systemach połautomatyczego sekwencjonowania stosowane są dideoksynukleotydy
wyznakowane fluorescencyjnie (Rys. 9). Ich wbudowanie do syntetyzowanej nici DNA powoduje
równocześnie jej wyznakowanie i terminację syntezy. Stosując cztery rożne znaczniki fluorescencyjne
uzyskuje się syntezę fragmentów DNA wyznakowanych odpowiednio do wbudowanego do nici
dideoksynukleotydu. Dzięki temu oznaczając sekwencję nukleotydową fragmentu DNA można stosować
jedną, a nie cztery niezależne reakcje sekwencjonowania. Prowadząc syntezę wielu nici i stosując
równocześnie w reakcji wszystkie deoksy- i dideoksynukleotydy otrzymuje się mieszaninę
fluorescencyjnie wyznakowanych fragmentów DNA o długości równej długości startera + (1 do n).
Zazwyczaj n nie przekracza 1000 par zasad. Elektroforetyczny rozdział fragmentów umożliwia ich
uporządkowanie pod względem wielkości, a analiza światła emitowanego przez fluorescencyjny znacznik
określa, jaki nukleotyd został wbudowany, jako ostatni.
Rys. 9.
Schematyczne
przedstawienie
rozdziału
wyznakowanych
fluorescencyjnie
fragmentów DNA zsyntetyzowanych w
reakcji sekwencjonowania wraz z odczytem
sekwencji.
W przypadku półautomatycznej analizy sekwencji nukleotydowej DNA uzyskany rozdział
fragmentów przedstawiony jest w postaci chromatogramu.
Rys. 10. Chromatogram z elektroforetycznego rozdziału wyznakowanych fluorescencyjnie
fragmentów DNA otrzymanych w reakcji sekwencjonowania.