Oznaczanie RNA w materiale roślinnym
Prowadzący: mgr inż. Marta Grec
Oznaczanie RNA w materiale roślinnym
Prowadzący: mgr inż. Marta Grec
1. Wstęp teoretyczny
RNA oraz DNA, nazywane kwasami nukleinowymi, są długimi liniowymi polimerami, w
których monomery stanowią nukleotydy
1
. Każdy z tych merów, który złożony jest z jednostki
cukrowej – β-D-rybozy (RNA) oraz β-D-deoksyrybozy (DNA) - związanej w pozycji 1’ z
zasadą purynową (adenina A, guanina G) lub pirymidynową (cytozyna C, tymina T – w DNA,
uracyl U – w RNA), łączy się z kolejnym za pomocą wiązania 3’
→
5’-fosfodiestrowego.
Cząsteczki DNA i RNA są uważane za nośniki informacji genetycznej, która jest
przechowywana w sekwencji zasad leżących wzdłuż łańcucha kwasu nukleinowego. Zasady
te posiadają szczególną cechę tworzenia za pomocą wiązań wodorowych specyficznych par, a
takie ich parowanie jest podstawą mechanizmu kopiowania informacji genetycznej z
istniejącego łańcucha na nowo powstały. Cząsteczki RNA zbudowane są z jednej nici ale
zawierają rejony typu „spinki do włosów”, powstające w wyniku utworzenia dwuniciowej
helisy przez sekwencje komplementarne występujące w jednej nici kwasu.
DNA stanowi materiał genetyczny organizmów komórkowych, który określa jakie białka
powstają w komórce, ale to RNA stanowi bezpośrednią matrycę dla ich syntezy. Ekspresja
genów jest przekształceniem informacji zawartej w DNA w funkcjonalne cząsteczki, w której
kluczową rolę odgrywa kilka rodzajów RNA:
a) Informacyjny RNA (mRNA) – stanowi matrycę do syntezy białek czyli translacji –
określa kolejność aminokwasów w syntezowanym białku
b) Transportujący RNA (tRNA) – przenosi zaktywowane aminokwasy do rybosomów,
gdzie dochodzi do ich połączenia się wiązaniami peptydowymi w kolejności
określonej przez mRNA
c) Rybosomowy RNA (rRNA) – główny składnik rybosomów, pełni podczas biosyntezy
białek funkcje zarówno katalityczne jak i strukturalne
DNA stanowi matrycę do syntezy RNA, a proces ten nazywany jest transkrypcją. Jest on
katalizowany przez enzym – polimerazę RNA, która rozpoznając tzw. promotora rozpoczyna
syntezę RNA. Polimeraza RNA przemieszcza się wzdłuż matrycy i przepisuje jedną z nici, aż
osiągnie miejsce terminacji transkrypcji.
Zawartość RNA w komórce roślinnej zmienia się w zależności od rodzaju tkanki i jej
stadium rozwojowego. W dojrzałych liściach całkowite stężenie RNA wynosi 0,1-0,2%. W
liściach czy korzeniach starzejących się lub poddanych głodzeniu jego poziom wyraźnie
obniża się.
W komórce RNA zwykle połączone jest z białkami, które można odłączyć przez działanie
detergentami, chlorkiem guanidyny lub proteazami. Naturalne mieszaniny RNA można
rozdzielić metodą chromatografii jonowymiennej, sączenia molekularnego w żelach itd.
Badanie składników RNA można przeprowadzić bez poddania go reakcji hydrolizy (np.
stosując reakcje barwne tj. reakcja Biala na rybozę) lub po hydrolizie enzymatycznej lub
chemicznej. W wyniku działania 1M kwasu solnego (1h, 100
o
C) na cząsteczkę RNA
uwalniane są zasady purynowe, fosforany rybozy oraz nukleotydy pirymidynowe.
Ogrzewanie RNA w obecności 0,5M wodorotlenku potasu (40
o
C) powoduje powstawanie 2’-
3’- cyklicznych diestrów mononukleotydów (nie powstają one z DNA, gdyż nie ma w nim 2’-
OH); przedłużenie czasu ogrzewania w wodorotlenku potasu do godziny prowadzi do
utworzenia w przybliżeniu równych ilości rozpuszczalnych soli potasowych izomerów 2’- i
3’- nukleotydów: AMP, GMP, CMP i UMP (rys 1), których ilość można oznaczyć
spektrofotometrycznie.
N
N
N
N
NH
2
O
OH
O
P
O
O
-
HO
O
-
NH
N
N
O
NH
2
N
O
O
OH
HO
P
O
O
-
O
-
N
NH
2
O
N
O
OH
O
P
O
O
-
HO
O
-
NH
O
O
N
O
O
OH
HO
P
O
O
-
O
-
Rys. 1
Podczas ćwiczenia będzie wykorzystana adaptowana do materiału roślinnego i
uproszczona procedura Schmidta i Thannhausera
2
. Polega ona na usunięciu z materiału
roślinnego barwników, lipidów, białek, wolnych nukleotydów i DNA. Pozostałe RNA
hydrolizuje się poprzez łagodne ogrzewanie w roztworze wodorotlenku potasu, a powstające
2’- i 3’-mononukleozydy oznacza się spektrofotometrycznie. Wykazują one maksymalną
absorpcję przy około 260 nm. Ponadto mierzy się absorbancję przy 300 nm w celu
wprowadzenia poprawki wynikającej z obecności innych związków pochłaniających
promieniowanie przy tej długości fali.
2. Wykonanie ćwiczenia
Odczynniki i materiały:
95% etanol
80% etanol
eter naftowy
0,2M kwas nadchlorowy (schłodzony)
1M kwas nadchlorowy
0,5M wodorotlenek potasu
materiał roślinny
Szkło i inne wyposażenie
Kolba stożkowa 250 ml, moździerz z tłuczkiem, pęseta, lejek szklany z korkiem gumowym,
kolbka ssawkowa, sączki, bagietki, probówka wirówkowa, próbówka szklana, termometr,
cylinder miarowy 10 ml, pipeta, łaźnia lodowa, łaźnia wodna (100
o
C), łaźnia wodna (40
o
C),
folia aluminiowa, kuweta, spektrofotometr, wirówka,
Etap 1 – usunięcie większości chlorofilu, lipidów, wolnych puryn i nukleotydów
Naważkę 300 mg (zapisać dokładną wagę naważki!!) liści pociąć na 2-3 milimetrowe
fragmenty. Do kolby stożkowej o pojemności 250 ml wlać 100 ml 80% etanolu i zakryć folią
aluminiową. Następnie umieścić w wrzącej łaźni wodnej i gdy alkohol zacznie wrzeć dodać
stopniowo za pomocą pęsety kawałki liści w taki sposób, aby nie przerwać wrzenia. Kolbę
przykryć folią i ogrzewać przez 4 minuty. Nie doprowadzić do zbyt dużego odparowania
alkoholu!
Etap 2 – usunięcie chlorofilu, lipidów, karotenoidów
Zawartość kolby schłodzić pod bieżącą wodą, zdekantować alkoholowy roztwór i odrzucić
(wylać do specjalnie przygotowanego pojemnika na odpad etanolu!!!). Pozostałość przenieść
do moździerza i dokładnie rozetrzeć, dodać 5 ml 95% etanolu i dalej rozcierać. Zawiesinę
przenieść na lejek szklany z gumką i przygotowanym sączkiem – odsączyć alkohol pod słabą
próżnią. Moździerz przepłukać 10 ml 95% etanolu i roztwór przenieść na sączek. Osad na
sączku przemyć dwukrotnie (2 razy po 10 ml) eterem naftowym i odsączyć pod słabym
ciśnienie.
Etap 3 – usunięcie rozpuszczalnych nukleotydów
Osad przemyć dwukrotnie (2 razy po 10 ml) schłodzonym 0,2M kwasem nadchlorowym. W
celu usunięcia kwasu osad przemyć dwukrotnie (2 razy po 10 ml) 95% etanolem.
Etap 4 – hydroliza RNA do 2’- i 3’-mononukleotydów
Po odsączeniu etanolu wyjąć sączek z osadem, zwinąć, włożyć do probówki wirówkowej,
dodać 5 ml 0,5M wodorotlenku potasu i całkowicie zanurzyć sączek w roztworze. Probówkę
zamknąć i wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 40
o
C na godzinę.
Etap 5 – wytrącenie DNA, białek, ścian komórkowych
Po wyjęciu z łaźni wodnej probówkę umieścić w łaźni lodowej na 10 minut (mieszając
zawartość bagietką), następnie dodać 5 ml schłodzonego 1M kwasu nadchlorowego i łagodnie
wymieszać. Pozostawić w łaźni lodowej przez 15 minut.
Etap 6 – Uzyskanie roztworów oczyszczonych 2’- i 3’-mononukleotydów
Całość wirować 7 minut przy 12 000 obrotach/min, supernant ostrożnie zdekantować do
cylindra o pojemności 10 ml (zapisać objętość!).
Etap 7 – pomiary i ilościowe oznaczanie RNA
Do szklanej próbówki pobrać 1 ml roztworu nukleotydów RNA, dodać 3 ml wody, dokładnie
wymieszać i przenieść do kuwety pomiarowej. Zmierzyć absorbancję przy 260 i 300 nm w
spektrofotometrze wyzerowanym na wodę. Ilość RNA obliczyć ze wzoru:
mg RNA = 0,031(A
260
-A
300
)(rozcieńczenie x ml RNA)
gdzie:
0,031 – „średnia wartość” absorbancji dla nukleotydów w RNA
A
260
, A
300
– zmierzone wartości absorbancji
rozcieńczenie próbki – w tym przypadku 4 (1 ml + 3 ml)
ml RNA – ilość supernantu po wirowaniu
Zawartość RNA wyrazić w procentach.
1. J.M. Berg, J.L.Tymoczko, L. Stryer, Biochemia, Wydawnictwo PWN, 2005, 117-131
2. J.N. Davidson, Biochemia kwasów nukleinowych, Methuen & Co Ltd., 1969, 111-112