Postępy Biochemii 58 (2) 2012

217

Cytometr Przepływowy Staje Się Urządzeniem Osobistym

1

Spis Treści

2

Wprowadzenie

3

Innowacja 1:

Niezawodna, wysoko wydajna automatyka strumieniowa

4

Innowacja 2:

Ekonomiczna, solidna optyka

5

Innowacja 3:

Uproszczona elektronika wysokiej klasy

6

Innowacja 4:

Intuicyjne oprogramowanie

7

Naprawdę osobisty cytometr przepływowy

Od momentu wprowadzenia cytometrii przepływowej w latach 70-tych, stała się ona niezbędnym narzędziem stosowa-

nym w wielu dziedzinach nauk o życiu. Moc analityczna i wszechstronność dzisiejszych cytometrów przepływowych opar-

tych na laserach otworzyła tajemnice biologii komórki i wzmocniła zupełnie nowe pola badań. Cytometria przepływowa

stała się podstawą nowoczesnych laboratoriów na całym świecie.

Osobisty cytometr przepływowy BD Accuri

®

C6 oferuje zarówno wydajność, jak i prostotę. Jego niewielkie rozmiary

i przystępna cena sprawiają, że cytometria przepływowa jest w zasięgu nowej generacji użytkowników. Kilka innowacji

projektowych i usprawnień technicznych — w zakresie automatyki strumieniowej, optyki, elektroniki i oprogramowania —

jest kluczem do tego, że BD Accuri C6 nadaje się dla szerszego grona badaczy.

Rycina 1. System cytometru przepływowego BD Accuri C6.

218

www.postepybiochemii.pl

WPROWadzenie

W ciągu niemal czterech dziesięcioleci cytometria przepływowa stała się niezbędnym narzędziem do badania cyklu ko-

mórkowego, apoptozy, profili komórkowych i molekularnych, niekomórkowej detekcji molekularnej, proliferacji komórko-

wej, transfekcji, żywotności komórek i immunologii. Cytometria przepływowa przyczynia się również do najnowszych postę-

pów badań naukowych w dziedzinie proteomiki, wysokowydajnego skriningu leków opartego na komórce i wykorzystania

biomarkerów w rozwoju leków.

W cytometrii przepływowej cząstki lub komórki są zawieszone w strumieniu cieczy i przepływają przez wiązkę światła

laserowego. Detektory optyczne rejestrują rozproszone światło laserowe i fluorescencję, a elektronika mierzy i digitalizuje te

emisje światła dla celów analizy z wykorzystaniem komputera. Dane dot. rozproszenia światła dostarczają podstawowych

informacji na temat cząstek lub komórek, takich jak rozmiar, kształt i cechy powierzchni. W celu zbadania szerokiej gamy

właściwości komórek, komórki identyfikuje się przy użyciu znaczników fluorescencyjnych, takich jak przeciwciała połączone

z barwnikiem.

Wprowadzony w 2006 r. BD Accuri C6 jest pierwszym osobistym cytometrem przepływowym. Jest on mały, dostępny

za przystępną cenę, prosty w obsłudze, łatwy w konserwacji i zgodny ze standardowymi protokołami laboratoriów badaw-

czych. Wykrywa on rozproszenie do przodu i boczne, a także maksymalnie cztery kolory fluorescencji. Zaprojektowane od

podstaw udoskonalenia systemu w zakresie automatyki strumienia, optyki, elektroniki i oprogramowania sprawiają, że jest

to potężne, unikalne i łatwe w użyciu narzędzie, nawet dla nowicjuszy w obszarze cytometrii przepływowej.

EN

PL

Detectors

Detektory

Sample

Próbka

Laser

Laser

To Waste

Do Odpadów

Statistical Analysis

Analiza Statystyczna

To Waste

Sample

Detectors

Statistical Analysis

Size

Gran

Laser

Rycina 2. Jak działa cytometr przepływowy.

Rycina 3. Osobisty cytometr przepływowy BD Accuri C6.

Postępy Biochemii 58 (2) 2012

219

innOWaCja 1: niezaWOdny, WySOkOWydajny PRzePłyW

Układ przepływowy w cytometrach przepływowych jest zaprojektowany w taki sposób, aby skutecznie kierować mierzo-

ne komórki lub cząstki do kuwety przepływowej, ogniskując strumień cieczy tak, że światło może analizować każdą komórkę

indywidualnie.

Konstrukcja układu przepływowego aparatu BD Accuri C6 wykorzystuje pompy perystaltyczne do napędzania przepły-

wu cieczy. Pompy są małe, niedrogie i wymagają minimum konserwacji. Aby wygenerować płynny przepływ przy użyciu

pompy pulsacyjnej, zespół projektowy połączył nowe tłumiki pulsacji ze złożonym, kontrolowanym przez mikroprocesor

systemem dynamicznej informacji zwrotnej. Uzyskany w efekcie przepływ jest czuły i regulowany przez użytkownika. Dzię-

ki tej innowacji, układ przepływowy BD Accuri C6 uruchamia się automatycznie po włączeniu zasilania i pozwala precyzyj-

nie kontrolować prędkość cieczy osłonowej i próbki w wyjątkowo wąskim zakresie tolerancji.

Układ przepływowy BD Accuri C6 wykorzystuje dwie pompy perystaltyczne. Jedna popycha ciecz roboczą do kuwety

przepływowej, natomiast druga wyciąga połączoną próbkę i ciecz osłonową z kuwety przepływowej do zbiornika na odpady.

Rożnica pomiędzy ciśnieniami obu pomp tworzy ssanie, które powoduje aspirację próbki. Konstrukcja typu pchaj/ciągnij

umożliwia niezależną regulację prędkości przepływu cieczy osłonowej i próbki, co pozwala na precyzyjną kontrolę średnicy

rdzenia próbki. W razie potrzeby, użytkownik może szybko dostroić układ przepływowy do każdej indywidualnej próbki.

Ponieważ pompy z przepływem bezpośrednim mogą mierzyć pobraną objętość próbki, BD Accuri C6 może automatycznie

obliczyć liczbę zdarzeń na μl dla każdej próbki, podając zarówno liczbę komórek, jak i ich stężenie. Konstrukcja ta oznacza

również, że wszelkie zapchania można z łatwością usuwać z kuwety przepływowej wykorzystując zwrotny przepływ cieczy

osłonowej. Większość zapchań (takich jak zagregowane komórki) występuje raczej w Sondzie do Iniekcji Próbki (ang. Sample

Injection Probe - SIP), a nie w wewnętrznych liniach układu przepływowego.

Rycina 4. System BD Accuri C6 z pompą perystaltyczną.
Opatentowane tłumiki pulsacji i czujniki ciśnieniowe umożliwiają niedrogim pompom perystaltycznym dostarczenie nieciśnieniowego, wolnego od pulsacji układu typu

popychaj/ciągnij z dynamiczną informacją zwrotną.

Rycina 5. Zbiorniki układu przepływowego BD Accuri C6.

220

www.postepybiochemii.pl

BD Accuri C6 jest zgodny z rozmaitymi rodzajami probówek, w tym z probówkami o rozmiarze 12 x 75 mm i bezkorko-

wymi probówkami mikrowirówkowymi. Z uwagi na fakt, że układ przepływowy nie jest ciśnieniowy, BD Accuri C6 może

dokonać aspiracji próbki z pękniętej probówki.

Aparat zawiera cztery nieciśnieniowe zbiorniki na płyn: roztwór osłonowy, odpadowy, czyszczący i odkażający. Czujniki

automatycznie alarmują użytkowników, jeśli zachodzi potrzeba napełnienia lub opróżnienia zbiornika. Próbka jest pobierana

przez SIP do kuwety przepływowej, gdzie ciecz z próbką jest ogniskowana z wykorzystaniem siły hydrodynamicznej wywie-

ranej przez ciecz osłonową.

Aby ograniczyć konserwację, BD Accuri C6 jest zaprogramowany na automatyczną dekontaminację układu przepływo-

wego. W momencie wyłączania, aparat przepłukuje linie przepływu roztworem odkażającym i czyszczącym. Następnie po

włączeniu, linie przepływu są przepłukiwane i napełniane cieczą osłonową w gotowości do przyjęcia pierwszej próbki.

Podsumowując, wysokowydajny układ przepływowy BD Accuri C6:

1.

Automatycznie rozpoczyna pracę po przyciśnięciu jednego przycisku.

2.

Przeprowadza samoczyszczenie i alarmuje, gdy płyny wymagają uwagi użytkownika.

3.

Jest zgodny z rozmaitymi konfiguracjami próbka-probówka.

4.

Mierzy pobraną objętość próbki i automatycznie oblicza liczbę komórek i stężenie na μl.

5.

Pozwala użytkownikowi niezależnie regulować prędkość przepływu próbki.

6.

Pozwala użytkownikowi regulować średnicę strumienia rdzenia dla szerokiej gamy rozmiarów komórek.

7.

Minimalizuje liczbę elementów składowych, zmniejszając wymiary i koszt.

Postępy Biochemii 58 (2) 2012

221

innOWaCja 2: ekOnOmiCzna, SOlidna OPtyka

Układ optyczny w cytometrze przepływowym ogniskuje światło lasera na strumieniu w kuwecie przepływowej i rejestruje

rozproszenie światła oraz fluorescencję.

Układ optyczny BD Accuri C6 jest przykładem prostoty. Kilka innowacji pozwoliło zespołowi projektowemu skrócić i

ustabilizować tor światła, obniżając koszty i wymagania w zakresie serwisowania.

Instrument wykorzystuje dwa lasery na ciele stałym, emitujące długości fal 488 nm i 640 nm. Wieloelementowe soczewki

ogniskujące, o dużęj wydajności zbierania zwiększają moc sygnału bez użycia luster. Dostęp do filtrów interferencyjnych jest

prosty, a ich wymiana łatwa. Elementy optyczne o stałym ustawieniu są odporne na stukanie i uderzanie, co redukuje proble-

my z kalibracją i wezwania serwisowe. Sprawia to, że aparat jest przenośny i można go przesuwać z miejsca na miejsce lub

używać w terenie bez konieczności ponownego kalibrowania.

Układ optyczny BD Accuri C6 mierzy światło bezpośrednio. Wiązki laserowe ustawione współliniowo trafiają do kuwety

przepływowej w tym samym punkcie, ale czerwony laser jest modulowany, umożliwiając oddzielenie sygnałów z każdej

wiązki. Moduły fotopowielaczy (PMT) są ustawione wokół kuwety przepływowej, aby zmaksymalizować zbieranie światła

i zredukować problemy związane z justacją. Detektory te, zogniskowane na jednym punkcie, próbkują dane tylko wówczas,

gdy wyszczególniona kombinacja lasera wzbudzi próbkę. Tak więc wszystkie cztery detektory fluorescencji mogą dokonać

odczytu z każdego lasera. W pełni cyfrowy system wykorzystuje 24-bitowy przetwornik analogowo - cyfrowy (ADC) do

konwertowania sygnałów z PMT.

Podsumowując, niezawodny układ optyczny BD Accuri C6:

1.

Jest solidny i odporny na potrącanie, co sprawia, że łatwo go transportować.

2.

Pozwala użytkownikowi na łatwą wymianę filtrów interferencyjnych.

3.

Nie wymaga justacji przez użytkownika.

4.

Minimalizuje liczbę elementów składowych, zmniejszając wymiary i koszt.

Rycina 6. Układ optyczny BD Accuri C6.
Fotopowielacze, ustawione wokół kuwety przepływowej, maksymalizują zbieranie światła i redukują problemy związane z justacją.

222

www.postepybiochemii.pl

innOWaCja 3: UPROSzCzOna, WySOkiej klaSy elektROnika

Elektronika to układ nerwowy cytometru przepływowego, zarządzający komunikacją pomiędzy podsystemami. Na przy-

kład podsystemy przetwarzania sygnału cyfrowego (DSP) i konwersji analogowo — cyfrowej (ADC) określają dynamiczny

zakres pomiarowy aparatu, od słabego sygnału do silnego.

Wykorzystując nowoczesne 24-bitowe układy ADC i zaawansowane filtrowanie elektroniczne, BD Accuri C6 może jed-

nocześnie zbierać 16 milionów kanałów danych cyfrowych, wyświetlanych jako siedem dekad. Oznacza to, że może on jed-

nocześnie precyzyjnie rozróżniać zarówno słabe, jak i jasne sygnały, co jest szczególnie użyteczne w przypadku pewnych

eksperymentów biologicznych, których rozpiętość sygnałów obejmuje pięć dekad. Umożliwia to BD Accuri C6 analizowanie

szerokiej gamy próbek, od słabych, mikronowych płytek krwi po linie dużych komórek o wysokiej fluorescencji o rozmiarze

powyżej 30 mikronów. W rzadkich przypadkach, gdy fluorescencja jest poza skalą, jak np. przy niektórych liniach komórek

po transfekcji zielonym białkiem fluorescencyjnym, wstawiane w prosty sposób filtry tłumiące sprowadzają sygnały z powro-

tem w zakres skali, utrzymując jednocześnie działanie detektorów w zakresie liniowym.

BD Accuri C6 wykrywa ten szeroki zakres dynamiczny przy użyciu fabrycznych standardowych ustawień detektora.

Użytkownicy nie muszą ustawiać napięcia PMT i współczynnika wzmocnienia wzmacniacza, aby koncentrować się na wyso-

kim lub niskim końcu skali. Dane można najpierw zgromadzić, a następnie przeanalizować, bez obawy o ich utratę wskutek

niewłaściwych ustawień PMT. Nowi użytkownicy mogą zbierać dane przy użyciu prostego, fabrycznie skonfigurowanego

szablonu, a dane można analizować później z pomocą bardziej doświadczonego użytkownika. W razie wykrycia błędów

bramkowania lub kompensacji lub w świetle nowych odkryć naukowych, dane można poddać ponownej analizie w dowol-

nym momencie.

Narzędzia oprogramowania pomagają badaczom w analizie szerokiego spektrum danych. Na przykład narzędzie Zoom

(Powiększ/Zmniejsz) pozwala badaczom koncentrować się (i ustawiać bramki) na bardzo małych obszarach wyświetlonych

danych. Funkcja BD Accuri VirtualGain®, która może ustawiać rozkład danych dowolnego parametru w wybranym kanale,

naśladuje manualną regulację wzmocnienia i jest przydatna do porównywania rozkładów DNA.

W celu zapewnienia komunikacji pomiędzy cytometrem a komputerem, BD Accuri C6 obsługuje złącza urządzeń typu

plug-and-play przy użyciu portów USB. Ten standard branżowy w zakresie elektroniki pomaga redukować złożoność, koszt

i rozmiar.

Podsumowując, złożony układ elektroniczny BD Accuri C6:

1.

Zapewnia siedem pełnych dekad zakresu dynamicznego.

2.

Eliminuje konieczność regulacji napięcia i ustawień wzmocnienia wzmacniacza.

3.

Dostarcza narzędzi softwarowych, aby pomóc w analizie szerokiego spektrum danych.

4.

Obsługuje złącza USB dla urządzeń typu plug-and-play w standardowym PC lub laptopie.

5.

Minimalizuje liczbę elementów składowych, zmniejszając wymiary i koszt.

Postępy Biochemii 58 (2) 2012

223

innOWaCja 4: intUiCyjne OPROgRamOWanie

Oprogramowanie BD Accuri CFlow® zaprojektowano mając na uwadze szybkość uczenia się i łatwość użycia w oparciu o

setki godzin obserwacji badaczy używających cytometry przepływowe.

Na przykład panele podzielone na zakładki ułatwiają sterowanie. Akwizycji danych dokonuje się z zakładki Collect [Zbie-

raj], gdzie użytkownicy mogą tworzyć i posługiwać się wykresami gęstości i punktowymi, histogramami i danymi liczbowy-

mi. W zakładce Analyze [Analizuj], użytkownicy mogą nakładać na siebie kolorowe histogramy, drukować wiele wykresów,

porównywać próbki i używać narzędzia Zoom [Powiększ/Zmniejsz], aby powiększać obszary danych. W zakładce Statistics

[Dane Liczbowe], dane są wyświetlane w tabeli głównej i można łatwo dokonywać obliczeń, kopiować dane liczbowe oraz

wklejać je do arkuszy kalkulacyjnych w celu ułatwienia raportowania.

W każdej zakładce użytkownik znajdzie narzędzia i funkcje w miejscu, gdzie według przewidywań powinny się znajdo-

wać. Na przykład w zakładce Collect [Zbieraj] każdy wykres zawiera własne narzędzia bramkowania i wyświetlania.

W efekcie, użycie oprogramowania CFlow jest intuicyjne. Nowi użytkownicy często zaczynają swobodnie obsługiwać

oprogramowanie CFlow w czasie krótszym niż 30 minut, mając do dyspozycji 3-stronicowy ilustrowany Szybki Przewodnik.

Oprogramowania można używać na większości standardowych komputerów i laptopów, a wykresy i pliki danych można

eksportować w formacie FCS 3.0 w celu płynnego importu do programów do analizy z wykorzystaniem metod cytometrii

przepływowej, w tym FCS Express i FlowJo™. Wykresy można również przeciągać i upuszczać do aplikacji Microsoft® Offi-

ce, takich jak PowerPoint®.

Podsumowując, intuicyjne oprogramowanie BD Accuri CFlow:

1.

Można używać na dowolnym standardowym komputerze PC lub laptopie z 2 GB RAM-u.

2.

Jest intuicyjne zarówno dla użytkowników początkujących jak i zaawansowanych, nawet bez szkoleń.

3.

Pozwala tworzyć złożone grafiki, takie jak wykresy gęstości, i nakładać na siebie kolorowe histogramy.

4.

Wykorzystuje format pliku FCS 3.0, aby zapewnić kompatybilność z innym oprogramowaniem.

5.

Umożliwia użytkownikom przeciąganie i upuszczanie obrazów z wykresami do aplikacji Microsoft Office

oraz kopiowanie i wklejanie danych liczbowych do programów z arkuszami kalkulacyjnymi.

Rycina 7. Interfejs użytkownika oprogramowania BD Accuri CFlow®.
Zakładki Collect [Zbieraj], Analyze [Analizuj] i Statistics [Statystyki] ułatwiają sterowanie zadaniami.
Plots [Wykresy] (panel w prawym górnym rogu) zawiera własne narzędzia bramkowania i wyświetlania.

224

www.postepybiochemii.pl

naprawdę osobisty cytometr przepływowy

Innowacje w zakresie układu przepływowego, optyki, elektroniki i oprogramowania, omówione w niniejszej publikacji,

otworzyły nowe możliwości w zakresie wykorzystania cytometrii przepływowej. Osobisty cytometr przepływowy BD Accuri C6,

dostępny zarówno dla użytkowników początkujących jak i zaawansowanych, nadaje się z powodzeniem dla każdego laborato-

rium life science.

Rycina 8. Trzy widoki BD Accuri C6.
A. Wymiary aparatu. B. Aparat z opcją BD Accuri CSampler®. Dodana automatyzacja pozwala na przygotowywanie i analizowanie próbek na tej samej płytce, eliminując

ręczne przenoszenie próbek z płytki do probówek. BD Accuri CSampler jest kompatybilny z płytkami standardowymi i 96-dołkowymi o głębokich studzienkach, a także

probówkami 12 x 75-mm. C. Widok z tyłu, przedstawiający łatwe podłączenie BD Accuri C6 do zbiorników z płynami.

BD Accuri C6 rozszerza wykorzystanie potęgi cytometrii przepływowej nie tylko przez szeroką gamę badaczy z dziedzi-

ny life science, ale także w dyscyplinach naukowych, które nie korzystały z niej w przeszłości, takich jak nauka o ochronie

środowiska, mikrobiologia i biologia morska. Pierwszy osobisty cytometr przepływowy daje naukowcom podstawowe na-

rządzie pozwalające przyspieszyć realizację ich celów naukowych. BD Accuri C6 sprawia, że cytometria przepływowa staje

się osiągalna.

BD

ul. Królowej Marysieńki 90

02-954 Warszawa

tel.: [phone]

faks: [phone]

www.bd.com

BD Biosciences

ul. Królowej Marysieńki 90

02-954 Warszawa

tel.: + 48 22 651 62 52

faks: + 48 22 651 75 89

www.bdbiosciences.com

A

B

C