1
Ćwiczenie 6
(MOiŚ)
T: Aktywność biochemiczna i fizjologiczna bakterii na wybranych podłożach identyfikacyjnych. Testy
identyfikacyjne.
I)
Podłoża identyfikacyjne
Służą do określania przynależności bakterii do konkretnego gatunku na podstawie
ich cech biochemicznych i fizjologicznych. Aby w pełni zidentyfikować szczep
bakteryjny określa się zwykle co najmniej 20 takich cech.
1) Wykorzystanie cukrów i alkoholi wielowodorotlenowych
a) wykorzystanie cytrynianu jako jedynego źródła węgla
b) wykorzystanie malonianu jako jedynego źródła węgla
c) wykorzystanie cukru lub alkoholu (glukoza/laktoza/mannitol/sorbitol)
d) rozkład cukru/alkoholu z wydzieleniem gazu (podłoże z rurką Dűrhama)
e) fermentacja glukozy (podłoże H-L, Hugh-Leifson’a)
f) wytwarzanie acetoiny (test Voges-Proskauer) [T]
2) Metabolizm związków azotu
a) dekarboksylacja lizyny i ornityny
b) dwuhydroksylaza argininy
c) dezaminacja fenyloalaniny [T]
d) wytwarzanie indolu (SIM) [T]
e) wytwarzanie H
2
S (SIM)
f) ruch (SIM)
g) rozkład mocznika (ureaza)
h) redukcja azotanów do azotynów [T]
1) test na oksydazę cytochromową
2) test na obecność katalazy
3) test na obecność koagulazy
test probówkowy
CF (Clumping Factor)
2
1.
Wykorzystanie cukrów i alkoholi wielowodorotlenowych
a) test na podłożu Simmonsa na wykorzystanie cytrynianu jako źródła
węgla cytrynian – jedyne źródło węgla w pożywce
fosforan amonu – jedyne źródło azotu
błękit bromotymolowy – wskaźnik
Bakterie pozyskujące cytrynian z podłoża alkalizują pożywkę. Reaguje błękit
bromotymolowy zmieniając barwę z zielonej na niebieską. Aby bakterie pozyskiwały i
rozkładały cytrynian muszą mieć odpowiednią permeazę (transport do komórki) oraz liazę
cytrynianową.
b) test na wykorzystanie malonianu jako jedynego źródła węgla
Jeżeli bakterie mają zdolność pozyskiwania malonianu to alkalizują tym samym podłoże i reaguje
wskaźnik – błękit bromotymolowy. Barwa podłoża zmienia się z zielonej na niebieską.
c) wykorzystanie cukru lub alkoholu (glukoza/laktoza/mannitol/sorbitol)
W płynnym podłożu znajduje się 1-2% cukru lub alkoholu oraz wskaźnik – błękit
bromotymolowy. W wyniku rozkładu cukru lub alkoholu podłoże ulega zakwaszeniu.
Reaguje wskaźnik i podłoże z barwy zielonej zmienia się na żółtą. Jest to reakcja dodatnia.
d) rozkład cukru/alkoholu z wydzieleniem gazu (podłoże z rurką Dűrhama)
Jest to test na wykorzystanie cukru/alkoholu jednak w probówce dodatkowo umieszczona jest
rurka Dűrhama (szklana rurka z otworem z jednej strony skierowanym w dół). Wytwarzanie
gazu obserwuje się tylko w probówkach z dodatnią reakcją na rozkład cukru lub alkoholu –
czyli w takich, gdzie podłoże zabarwiło się na żółto. Jeżeli w rurce widać pęcherzyk powietrza
to bakterie w trakcie metabolizowania cukru wytwarzają gaz i reakcja jest dodatnia. Jeżeli
podłoże pozostało zielone to dalszy etap identyfikacji pomija się – reakcja jest ujemna.
e) fermentacja glukozy (podłoże H-L, Hugh-Leifson’a)
Na podłożu umieszczona jest warstwa parafiny uniemożliwiająca dostęp tlenu. Na tym
podłożu stwierdzamy zdolność bakterii do fermentacji glukozy. Jeżeli w warunkach
beztlenowych bakterie wykorzystują cukier to zakwaszają podłoże i reaguje błękit
bromotymolowy zmieniając barwę z zielonej na żółtą.
f) wytwarzanie acetoiny (odczyn Voges-Proskauer; V-P)
Test ten wykonuje sie na podłożu Clarka z glukozą. Po inkubacji dodaje się
odpowiednie odczynniki w celu stwierdzenia obecności acetoiny.
Acetoina jest produktem szlaku 2,3-butandiolowego:
glukoza -------> 2 x pirogronian-----(kondensacja, dekarboksylacja)----->
acetomleczan ---(dekarboksylacja)---->acetoina
acetoina ----(warunki beztlenowe, redukcja)--->2,3 butandiol
acetoina ----(warunki utleniające)----> diacetyl
3
W celu przeprowadzenia testu do probówki dodaje się:
0,6 ml Alfa-Naftolu (silny utleniacz)
0,6 ml KOH (warunki alkaliczne)
Następnie inkubuje się probówkę 30 min. w 37st C.
Acetoina w warunkach zasadowych zostaje utleniona przy udziale alfa-naftolu do diacetylu.
Diacetyl reaguje z ugrupowaniem guanidynowym, które wchodzi w skład aminokwasów
(pepton itp.) i daje czerwony pierścień. Widoczny pierścień to reakcja dodatnia.
2. Metabolizm związków azotu
a)
dekarboksylacja lizyny i ornityny
Bakterie mające odpowiednie enzymy (dekarboksylaza lizyny/ornityny) mają zdolność
przekształcania aminokwasów do amin (lizyny do kadaweryny; ornityny do
putrescyny). Wytwarzanie tych enzymów jest indukowane niskim pH podłoża.
W skład podłoża wchodzi m.in. glukoza, chlorowodorek lizyny/ornityny oraz błękit
bromotymolowy – co nadaje całości barwę zieloną. Bakterie inkubuje się 24 godziny
a następnie odczytuje wynik.
Bakterie w pierwszej kolejności pobierają z podłoża glukozę. Następuje zakwaszenie podłoża,
które z zielonego przechodzi w żółte (reaguje błękit bromotymolowy). Poprzez zakwaszenie
następuje aktywacja dekarboksylazy lizyny/ornityny. Powstałe z aminokwasów aminy alkalizują
podłoże i z barwy żółtej przechodzi ono w zieloną – zielona barwa podłoża świadczy o reakcji
dodatniej*. Reakcję prowadzimy równolegle w kontrolnej probówce pozbawionej lizyny i
ornityny. Należy tak robić ponieważ nie wiadomo czy w próbie właściwej zielone podłoże jest
wynikiem wykorzystania ornityny i lizyny czy po prostu dany szczep bakteryjny nie pobiera
glukozy i żadna reakcja w probówce nie zaszła.
b)
dwuhydroksylaza argininy
Przeprowadza sie na podłożu Tornley’a, w skład którego wchodzi m.in czerwieo fenolowa
(wskaźnik) oraz nawarstwiona jest parafina (warunki beztlenowe).
Arginina jest rozkładana dwuetapowo. Dwuhydrolaza argininy (syn. desymidaza argininy)
rozkłada argininę do cytruliny i amoniaku. W wyniku działania cytrulinazy (ureidazy cytruliny)
powstaje ornityna, amoniak i CO
2
. W tych dwóch reakcjach powstają więc dwie cząsteczki
amoniaku, który silnie alkalizuje podłoże. Wskaźnikiem jest czerwień fenolowa, która zmienia
się z lekko różowej barwy na silnie różową.
4
c)
dezaminacja fenyloalaniny
Test wykonuje się na skosie agarowym. W wyniku dezaminacji fenyloalanina przechodzi w
kwas fenylopirogronowy, który z jonami żelazowymi daje charakterystyczne zabarwienie.
Do podłoża z posianym szczepem dodajemy 3% FeCl
3
(barwa pomarańczowa). Jeżeli odczynnik
pozostaje pomarańczowy to reakcja ujemna. Jeżeli zmieni barwę na zielono-szmaragdową to
znaczy, że bakterie na podłożu mają zdolność do dezaminacji fenyloalaniny.
d)
wytwarzanie indolu (SIM)
Test przeprowadza sie na podłożu SIM. Niektóre bakterie mają zdolność do przekształcania
tryptofanu w indol, pirogronian i amoniak. Obecność indolu w pożywce wykrywa sie za
pomocą odczynnika Kovacs’a.
Skład odczynnika Kovacs’a:
para-2-metylo-amino-benzaldehyd
alkohol amylowy
stęż. HCl
Po dodaniu odczynnika inkubujemy probówkę 10 min. w 37° C. Powstały czerwony pierścień
świadczy o wyniku dodatnim.
e)
wytwarzanie H
2
S (SIM)
Test przeprowadza sie na podłożu SIM, w skład którego wchodzi m.in. tiosiarczan sodu. Jeżeli
bakterie mają zdolność do produkcji reduktazy tiosiarczanowej to redukują tiosiarczan do H
2
S.
H
2
S reaguje natomiast z jonami żelazawymi zawartymi w podłożu. Powstaje siarczek żelaza (II),
który ma barwę czarną. Reakcja dodatnia – podłoże zabarwione na czarno.
Bakterie mogą tez wytwarzać desulfhydrazę cysteiny i wtedy redukują siarkę z aminokwasu
cysteiny co daje taki sam efekt jak w przypadku redukcji tiosiarczanu.
f)
ruch (SIM)
Podłoże SIM to podłoże stałe. Posiew jest w postaci wkłucia. Jeżeli wzrost bakterii tylko w
miejscu wkłucia to bakterie nie maja zdolności ruchu. Jeżeli natomiast wzrost występuje w
całym podłożu to świadczy o ruchliwości danego szczepu.
g)
rozkład mocznika (ureaza)
Wykonuje się ten test na podłożu Christensena zawierającym mocznik i czerwień fenolową
(wskaźnik). Mocznik jest rozkładany przez ureazę (rozcina wiązania pomiędzy C i N). Powstaje
amoniak i dwutlenek węgla. Podłoże ulega alkalizacji i reaguje wskaźnik zmieniając się z barwy
lekko różowej na silnie różową.
5
h)
redukcja azotanów do azotynów
Istnieją dwie drogi redukcji azotanów
asymilacyjna (azotany -> azotyny -> tlenek azotu -> hydroksyamina -> amoniak)
dysymilacyjna (azotany -> azotyny -> tlenek azotu -> podtlenek azotu -> azot cząsteczkowy)
Test przeprowadza sie na bulionie zwykłym z dodatkiem KNO
3
. Bakterie redukujące
azotany (wytwarzające m.in. reduktazę azotanową) wykrywamy poprzez obecność
azotynów. Po inkubacji bakterii dodajemy dwa odczynniki:
Griess’a A (kw. sulfanilowy)
Griess’a B (alfa-naftyloamina)
Odczynniki łączą się z azotynami i powstaje czerwony kompleks. Świadczy to o reakcji
dodatniej. Jednak brak czerwonego zabarwienia nie musi świadczyć o braku redukcji azotanów.
Być może wszystkie azotyny zostały juz przekształcone w dalsze produkty szlaku
metabolicznego.
Aby to sprawdzić dodajemy pył cynkowy. Powoduje on natychmiastową redukcję azotanów do
azotynów. Tak więc jeżeli w pożywce nadal były nieprzetworzone azotany to zredukują się i
utworzą barwny kompleks z Griess A i Griess B. Jeżeli tak się stanie to znaczy, że to pył cynkowy
zredukował azotany, a nie bakterie więc reakcja jest ujemna. Jeżeli natomiast po dodaniu pyłu
cynkowego barwa sie nie zmieni to znaczy, że bakterie przekształciły wszystkie azotany.
Reakcja jest wtedy dodatnia.
1)
Test na oksydazę cytochromową
Oksydaza cytochromowa (oksydaza cytochromu c) to ostatnie białko łańcucha
oddechowego. Przenosi elektrony na tlen. W celu wykrycia tego kompleksu u bakterii na
bibułę nakrapiamy odczynnik Kovacs’a (2) (tetra-metyl-para-fenylendiamina). Następnie
nanosimy szczep bakteryjny. Jeżeli w ciągu 10 sekund pojawi się ciemnoniebieskie
zabarwienie to reakcja jest dodatnia.
Szczepy nanosimy ezą platynową (metal szlachetny), żeby zapobiec transportowi
elektronów z ezy na oksydazę cytochromową.
Elektrony z odczynnika Kovacs’a przechodzą na oksydazę, a następnie na tlen. Sam
odczynnik przechodzi w błękit Wűrstera (ciemny niebieski kolor).
2)
Test na obecność katalazy
Katalaza to enzym rozkładający nadtlenek wodoru do wody i tlenu cząsteczkowego.
Katalaza pomaga niektórym bakteriom bronić się przed nadtlenkiem wodoru
produkowanym przez układ immunologiczny. Katalazę wytwarzają na przykład gronkowce.
3% roztwór nadtlenku wodoru nakrapiamy na kolonie bakteryjne. Jeżeli powstają pęcherzyki
gazu(tlen) to oznacza, że bakterie wytwarzają katalazę.
6
3)
Test na obecność koagulazy
Koagulaza jest to enzym, który przekształca protrombinę zawartą w osoczu w tzw.
„staphylotrombinę”. Ta ostatnia katalizuje reakcję przekształcenia rozpuszczalnego w osoczu
fibrynogenu w nierozpuszczalną fibrynę. Fibryna powstała drogą patologiczną za
pośrednictwem bakterii chorobotwórczych powoduje skrzepy wewnątrznaczyniowe.
Bakterie mogą wytwarzać koagulazę, która jest związana z powierzchną ściany komórkowej
lub uwalnianą do środowiska (tzw. koagulaza wolna).
Wyróżniamy 2 rodzaje testów na obecność koagulazy:
a)
test na koagulazę wolną i związaną (test probówkowy)
Do probówki zawierającej osocze królika posiewamy szczep bakteryjny i inkubujemy przez 24
h. Jeżeli można zaobserwować zestalenie osocza to badany szczep jest koagulazo-dodatni
b) test na koagulazę związaną ze ścianą komórkową (CF-clumping factor; czynnik zlepny) Na
szkiełko podstawowe nanosimy 1 kroplę 0,85% NaCl i obok jedną kroplę osocza królika. Do obu
kropli wprowadzamy po 1 kolonii bakteryjnej, a następnie mieszamy. Jeżeli w kropli z plazmą
króliczą powstają strąty (następuje zestalenie osocza) to szczep ma koagulazę związaną ze
ściana komórkową. Kolonia wprowadzona do NaCl służy jako próba kontrolna. Gdyby także w
tym przypadku zaobserwowano strąty oznaczałoby to, że szczep ma zdolność do
autoaglutynacji i testu nie można brać wtedy pod uwagę.