1

ĆWICZENIE IV

MIKROBIOLOGIA ŚRODOWISKA GLEBOWEGO

Wskaźniki aktywności biologicznej gleby - cd.

IV.1.Oddychanie gleby

wskaźnikiem dobrze oddającym obraz aktywności biologicznej gleby jest siła oddychania gleby,

czyli pobierania O

2

i/lub wydzielania CO

2

.

Oddychanie jest uniwersalnym procesem nie ograniczonym do mikroorganizmów, zależy od
fizjologicznego stanu komórek i jest warunkowane przez różne czynniki glebowe tj. wilgotność (pomiary
przeprowadza się przy pojemności wodnej 50-70%), temperatura (stosowana jest temperatura inkubacji w
zakresie 20-30

o

C), dostępność składników odżywczych i struktura gleby.

Aktywne żywe komórki potrzebują stałego zaopatrzenia w energię, która w przypadku mikroorganizmów
heterotroficznych pochodzi z transformacji materii organicznej (celulozy, białek, nukleotydów i związków
zhumifikowanych). Reakcje odpowiedzialne za zaopatrywanie w energię w komórce są reakcjami redox
opartymi o transfer od donora do akceptora. W procesie oddychania, który jest utlenianiem materii
organicznej przez tlenowe mikroorganizmy tlen funkcjonuje, jako akceptor elektronów. Końcowym
produktem tego procesu jest CO

2

oraz H

2

O. Stąd metaboliczna aktywność mikroorganizmów glebowych

może być wyznaczana poprzez pomiar wytwarzanego CO

2

czy pobieranego O

2

(Nannipieri et al. 1990).

Podstawowe oddychanie jest definiowane jako oddychanie bez dodatku substancji organicznej do gleby.

Oddychanie indukowane substratem (SIR) jest oddychaniem mierzonym po dodaniu substratu.

Współczynnik respiracji (oddychania):

2

.

.

2

.

ln

.

O

o

pobieraneg

V

CO

ionego

uwo

V

RQ

=

odzwierciedla stan fizjologiczny biomasy mikrobiologicznej w glebie i powinien mieć wartość 1.

Powietrze glebowe

Gleba posiada własną atmosferę podlegającą znacznie większym wahaniom niż atmosfera nad jej powierzchnią.
Powietrze wypełnia w glebie część porów i zajmuje ono makropory, a przy niskiej wilgotności gleby również część
mezoporów.
Skład chemiczny powietrza glebowego ulega zmianom w czasie sezonu wegetatywnego i w profilu glebowym.
Powietrze glebowe zawiera 10-100 x więcej CO

2

czyli 0,3 - 3,0%

Zawartość O

2

jest znacznie niższa niż 20%. W powietrzu glebowym jest więcej pary wodnej (często ok. 100%

nasycenia), a także dużo gazowych produktów rozkładu substancji organicznej tj. metan, etylen, N

2

O)

Intensywne procesy mikrobiologiczne, a zwłaszcza rozkład substancji organicznej sprzyja wzbogaceniu powietrza
glebowego w CO

2

.

Pojemność powietrzną zwaną też porowatością powietrzną charakteryzuje maksymalna objętość porów zajętych
przez powietrze w stanie polowej pojemności wodnej.
Krytyczne wielkości pojemności powietrznej dla różnych gleb i roślin są trudne do ścisłego ustalenia.
Minimalna - krytyczna pojemność wynosi dla traw 5-10%, zbóż 15%, okopowych 20%.

Metody pomiaru oddychania glebowego

1. Pomiar oddychania glebowego

ex situ

Oddychanie glebowe może być określane z użyciem prostych technik tj. inkubacja gleby w słojach

(Isermeyer 1952), zamkniętych płytkach Petriego (Pochon i Tardieux 1962) czy innych typach naczyń (Jäggi 1976).
CO

2

jest zwykle adsorbowany na NaOH i mierzony poprzez miareczkowanie za pomocą HCl.

Inne metody określania CO

2

są oparte o zmiany przewodności elektrycznej roztworu NaOH (Anderson i Domsch

1978a; Cheng i Coleman 1989), wymagają zastosowania chromatografii gazowej (Brookes i Paul 1987) czy
spektroskopii podczerwieni (Heinemeyer et al. 1989).
Znakowany CO

2

(

14

CO

2

) jest oznaczany przy monitorowaniu rozkładu specyficznych związków organicznych w

glebie (Naklas i Klein 1981). Pobieranie O

2

lub wydzielanie CO

2

może być oznaczane za pomocą aparatu Warburga

2

(Domsch 1962; Stotzky 1965), poprzez pomiar elekrorespirometrem (Birch i Melville 1969; Kröckel and Stolp 1986;
Alef et al. 1988) czy chromatografii gazowej (Trevors 1985).

2. Pomiar oddychania glebowego in situ

Oddychanie glebowe może być również określane bezpośrednio w glebie (Anderson 1982).

Metody te polegają na określeniu poziomu uwalnianego CO

2

z nienaruszonej gleby.

W metodzie długoterminowej (Anderson 1982) roztwór NaOH jest umieszczany w otwartym słoju pod

powierzchnią gleby a przestrzeń podlegająca pomiarowi jest okryta metalowym cylindrem zamkniętym od strony
górnej. Po okresie inkubacji roztwór NaOH jest usuwany i mierzona poprzez miareczkowanie.

W metodzie krótkoterminowej uwalniany ze znanej przestrzeni glebowej CO

2

jest zbierany przy użyciu

aparatury (Richter 1972) składającej się z 4 małych kolektorów gazu, rury do analizy gazu i małej pompy.
W rurze analitycznej CO

2

reaguje z hydrazyną (CO

2

+ N

2

H

2

 NH

2

COOH), której zużycie poprzez zmiany

wskaźnika redox.
Pomiar stężenia CO

2

i O

2

może być dokonywany na różnych głębokościach w oparciu analizę chromatografii

gazowej małych próbek wyciąganych z pożądanej głębokości z użyciem próbnika do próbek gazowych i strzykawki
do pobierania gazu (Richter 1972; Anderson 1982).

Zastosowanie metod manometrycznych do pomiaru zmian ilości O

2

i CO

2

Metody manometryczne, obejmują metody:

2.1. wolumetryczne - pomiaru zmian objętości gazu np.:
-

w respirometrze Gilsona

-

w mikrorespirometrze

2.2. pomiaru zmian ciśnienia gazu np.:
-

w aparacie Warburga

2.1. Metody wolumetryczne

Respirometr Gilsona stosowanym głównie w USA.
Naczyńko identyczne jak w aparacie Warburga połączone
jest z manometrem napełnianym naftą. Metoda Gilsona jest
w zasadzie metodą wolumetryczną - służy do pomiaru zmian
objętości gazu przy stałym ciśnieniu. Poziom płynu w
manometrze zmienia się wskutek pobierania lub wydzielania
gazu. Pomiar polega na doprowadzeniu poziomu płynu w
ramieniu manometru, połączonym z naczynkiem do
pierwotnej pozycji wykorzystując zmianę objętości gazu w
naczyńku. Dokonuje się tego za pomocą pokrętła
połączonego z naczyńkiem. Zmianę objętości odczytuje się
bezpośrednio na trójstopniowej skali połączonej z pokrętłem.

Mikrorespirometr stosowany jest do pomiaru wymiany gazowej u organizmów o małych rozmiarach. Podstawową
część tego przyrządu stanowi komora metalowa zamykana od góry wiekiem szklanym. Do komory dołączona jest
kapilara, w której znajduje się kropla zabarwionego płynu (nafty). Określoną ilość buforu węglanowego wprowadza
się na dno komory, natomiast badany obiekt umieszcza się w kropli wiszącej na ruchomym wieku. Druga taka sama
komora bez materiału roślinnego służy jako termobarometr, który pokazuje ewentualne zmiany w objętości fazy
gazowej, spowodowane zmianami temperatury i ciśnienia. Odczytuje się przesunięcie się kropli nafty. Jest to metoda
wolumetryczna, w której dokonujemy pomiarów zmian objętości przy stałym ciśnieniu z dokładnością 10

-3

mm

3

.

2.2. Metoda pomiaru zmiany ciśnienia

2.2.1. Pomiar ciśnienia parcjalnego O

2

w agregatach glebowych

W glebach strukturalnych mikroorganizmy są zwykle usytuowane na powierzchni lub wewnątrz

pojedynczych agregatów, które tworzą masę glebową.
Dyfuzja O

2

do oddychających organizmów ma miejsce w porach międzyagregatowych i jest indukowana tylko

przez gradient stężenia O

2

, który jest wynikiem procesu oddychania. Stąd badanie aktywności mikroorganizmów

w ich środowisku oraz zaopatrzenie O

2

w glebach o dobrze wykształconej strukturze zależy od właściwości

agregatów oraz od procesu pobierania O

2

i jego transportu.

3

Metoda polega na amperometrycznym pomiarze ciśnienia parcjalnego O

2

i in situ z zastosowaniem

mikroelektrody typu Clarka. Jeżeli napięcie polaryzacji platynowej katody jest stałe i waha się w zakresie –580
do –780 mV pomiar zależy jedynie od stężenia O

2

.

Konstrukcja O

2

– czułej mikroelektrody Clarka została nakreślona przez Revsbecha i Warda (1983).

Stępniewski i in. (1991) skonstruował podobną mikroelektrodę i zasilany silnikiem układ mikronapędowy, który
pozwala na ciągły pomiar profilu pO

2

w agregatach gleby. Katoda platynowa i elektroda odniesienia (Ag/AgCl)

są umieszczone w elektrolicie wodnym (1M KCl) w zewnętrznej szklanej oprawie wykonanej ze szkła sodowo-
wapiennego o kształcie kapilary (

θ

5,0/7,0 mm) wyostrzonej na końcu poprzez wyciągnięcie w płomieniu w celu

uformowania końcówki. Końcówka zaopatrzona jest w błonę z gumy silikonowej, która jest ekstremalnie
przepuszczalna dla O

2

(RTV 108 General Electric). Katoda jest wykonana z drutu platynowego o średnicy 0,1

mm (0,05 m. długości). Przed pomiarem elektroda jest wypełniana metanolem a tlen usuwany jest w eksykatorze
pod ciśnieniem. Następnie metanol jest zastępowany 1M KCl, a końcówka elektrody jest całkowicie pokrywana
poliestrem.

2.2.2. Pomiar zmiany ciśnienia CO

2

(lub O

2

) w aparacie Warburga

Respirometr Warburga pozwala uchwycić zmiany ciśnienia przy stałej objętości układu.

Jest to metoda bardzo

czuła, zezwalająca na śledzenie bardzo małych zmian ilości gazu, rzędu

µ

moli.

Aparat Warburga może umożliwić także badanie i wyznaczanie aktywności właściwej (wyrażana

w

µ

molach ilość substratu utlenianego w ciągu 1 min. Przez 1 mg białka preparatu enzymatycznego w optymalnych

warunkach temperatury, pH, stężenia substancji reagujących) konkretnego enzymu oddechowego.

Ś

ledząc za pomocą respirometru Warburga ubytek O

2

w mieszaninie zawierającej ekstrakt bezkomórkowy

Mycobacterium phlei (uzyskany przez oddziaływanie ultradźwiękami, przepuszczanie przez prasę Frencla lub
mechaniczne roztarcie w moździerzu) oraz bursztynian jako substrat bada się oksydazę bursztynianową.

Zapoznanie się z konstrukcją i zasadą działania aparatu Warburga

Konstrukcja urządzenia

Podstawową częścią aparatu Warburga jest respirometr składający się z naczyńka reakcyjnego wraz z bocznym

ramieniem i szklaną studzienką wmontowana w dno oraz właściwego manometru. Po podłączeniu naczyńka do manometru i
zamknięciu kranu trójdrożnego, naczyńko wraz z manometrem stanowi hermetycznie zamkniętą całość. Wnętrze tego
respirometru składa się z fazy ciekłej wraz z zawieszonymi w niej drobnoustrojami i fazy gazowej (powietrza) ograniczonej z
jednej strony powierzchnią cieczy w naczyńku, z drugiej poziomem płynu manometrycznego tzw. Brodiego. Naczyńko umieszcza
się w łaźni wodnej, w której utrzymuje się stała i optymalną temperaturę, a ponadto podlega ono rytmicznym wahaniom w celu
lepszej dyfuzji gazów (O

2

do cieczy i CO

2

z cieczy). Ciśnienie atmosferyczne i temperatura łaźni wodnej w czasie oznaczania nie

są w praktyce stałe i dlatego stosuje się manometry kontrolne zwane termomanometrami, zawierającymi w naczyńku tylko wodę.

Aparat Warburga jest manometrem typu stałej objętości, gdyż pomiar dokonywany jest po doprowadzeniu gazu w

aparacie do stałej objętości. W wyniku reakcji następuje pobieranie lub wydzielanie gazu przez badana próbę (w naczyńku
aparatu) i związane z tym zmiany ciśnienia. W metodzie bezpośredniej Warburga określamy pobór tlenu po całkowitym usunięciu
wydzielonego CO

2

. Zapewnia to wprowadzenie do studzienki naczyńka 0,2 ml 30% KOH. Pomiarowi podlega nie zmiana

objętości gazu, lecz zmiana ciśnienia (przy stałej objętości) wyrażana w mm płynu Brodiego (23g NaCl, 5g cholanu sodu, 100mg
błękitu Evansa (kwas 1-amino-x naftalenodwusulfonowy) w 500 ml H

2

O) wypełniającego manometr. Ciężar właściwy płynu

Brodiego wynosi 1,033 g/ml, a ciśnienie atmosferyczne 760 mmHg = 10000 mm słupa płynu Brodiego.

Zasada pomiaru

Po doprowadzeniu płynu Brodiego w zamkniętym ramieniu manometru (połączonym z naczyńkiem) do punktu ”0” (150 mm)
odczytuje się poziom płynu w otwartym ramieniu. W przypadku wydzielania gazu poziom ten podnosi się (+h), przy pobieraniu
gazu poziom opada (-h). znając zmianę ciśnienia h i stała naczyńkową dla danego układu (manometr + naczyńko) można obliczyć
objętość pobranego lub wydzielonego w czasie reakcji gazu. W celu przeliczenia zmiany ciśnienia na odpowiadającą jej objętość
gazu konieczne jest uwzględnienie szeregu czynników takich jak: objętość fazy gazowej układu różna dla różnych naczynek),
rozpuszczalność gazu w cieczy, sprowadzenie do warunków normalnych (0

o

C, 760 mmHg).

Te czynniki uwzględnia stała naczyńkowa k.

273

Vg x T +

Vc

x

a

k = --------------------------------------------------------------

P

o

Vg

-

objętość fazy gazowej układu- różnica między całkowitą objętością układu wyznaczoną przez kalibrowanie, a

objętością cieczy w naczyńku,
V

c

-

objętość cieczy w naczyńku – łączna objętość roztworów jakie będą stosowane w badaniach,

T

-

temperatura łaźni wodnej w skali bezwzględnej,

a

-

rozpuszczalność badanego gazu w cieczy w tej samej temperaturze (dane z tabeli)

4

P.

o

-

10 000 mm słupa Brodiego

Przykład oznaczania stałej k
Jeżeli wyznaczona przez kalibrowanie objętość układu wynosi 12,0ml i pomiary pobierania O

2

mają być wykonane w

temperaturze 25

o

C przy łącznej objętości 3 ml cieczy w naczyńku, wówczas:

Vg = (12-3) = 9ml = 9000

µ

l

Vc = 3ml = 3000

µ

l

a O

2

w 25

o

C = 0,0283 (dane z tabeli)

T = 273 + 25 = 298
P.

o

= 10 000 mm płynu Brodiego

A zatem wartość stałej naczynkowej dla pomiarów pobierania tlenu dla tego naczyńka wynosi:

273

9000

x

298 + 3000

x 0,0283

8245 + 84

k = ---------------------------------------------------------------- = ------------ ---- = 0,833

10 000

10 000

w celu obliczenia rzeczywistej zmiany ciśnienia podczas reakcji, należy uwzględnić zmiany wywołane zmianami ciśnienia
atmosferycznego a także zmiany temperatury w łaźni wodnej. W tym celu musimy uwzględnić zmiany zaobserwowane na
termobarometrze.
Przykład obliczania zmiany rzeczywistej ciśnienia:

Na początku oznaczania poziom płynu w otwartym ramieniu manometru próby właściwej wynosi 150 mm i w termobarometrze
również 150 mm. Po pewnym czasie np. 10 min. poziom płynu w manometrze próby właściwej opada do 120 mm tj. o 30 mm, a
w termobarometrze do 148 mm tj. o 2 mm. Rzeczywista zmiana ciśnienia wynosi zatem tylko 28 mm.
W przypadku zgodnego kierunku zmian poziomu w termobarometrze (h

t

) i w próbie właściwej należy bezwzględną wartość

odczytu próby właściwej zmniejszyć o poprawkę h

t

. Gdy kierunek zmiany poziomu w termobarometrze jest przeciwny należy

zwiększyć o poprawkę h

t

.

Objętość (x) pobranego lub wydzielonego gazu wyraża się w

µ

l

Równa się ona iloczynowi zmiany rzeczywistej ciśnienia h i stałej naczynkowej
X = h x k/

µ

l gazu

Technika pomiaru
Wykonanie oznaczenia na aparacie Warburga obejmuje następujące czynności:
1.

Do komory głównej czystych i suchych naczynek odmierza się lub przenosi określoną ilość badanej próby

2.

Wazeliną smaruje się szlif manometru i koreczka w bocznym ramieniu naczyńka

2.

Do studzienki odmierza się 0,2ml 30% roztworu KOH

3.

W studzience umieszcza się pofałdowany skrawek bibuły (2 x 2 cm)

4.

Naczyńka przymocowuje się do manometrów

5.

Cały zestaw manometrów umieszcza się w łaźni wodnej o odpowiedniej temperaturze

6.

Dla wyrównania temperatury układu wytrząsa się cały zestaw manometrów z otwartymi kranami

trójdzielnymi przez okres 10 –15 min.

7.

Ciecz w manometrze doprowadza się do punktu “zerowego” (150 mm)

8.

Zamyka się krany trójdzielne

9.

W określonych odstępach czasu odczytuje się i notuje poziom cieczy w manometrach po doprowadzeniu

poziomu płynu Brodiego w zamkniętym ramieniu do 150 mm

10.

Po wyjęciu naczynek z łaźni (po skończonym doświadczeniu) należy pamiętać o otwarciu kranu

trójdzielnego, aby uniknąć wciągnięcia płynu manometrycznego do naczyńka.

5

IV.2.Testy mikroskopowe

IV.2.1.Wyznaczanie liczby komórek w komorze Thoma

Komora Thoma

Siatka licznika z 5 dużymi kwadratami
(bez narożnych części)

Głębokość komory: 0,1 mm
Najmniejszy kwadrat: 0,0025 mm

2

Duży centralny kwadrat jest podzielony na 16
grupowych kwadratów,
które z kolei podzielone są na 16 mini kwadratów.

Objętość najmniejszego kwadratu:
0,1 mm x 0,0025 mm

2

= 0,00025 mm

3

= 0,00000025

cm

3

Objętość „16” – 16 najmniejszych kwadratów:
16 x 0,00025 mm

3

= 0,004 mm

3

= 0,000004 cm

3

Komora Thoma:
widok ogólny
siatka i powiększenie siatki

Wzór na liczbę komórek w 1 cm

3

(X) –

dla komórek stosunkowo dużych
przynajmniej 5 µm (np. erytrocyty, leukocyty, zarodniki grzybów), które zlicza się w „16”

000004

,

0

a

x

=

lub

250000

•

=

a

x

x - liczba komórek w 1 cm

3

(1 ml); a - liczba komórek w „16” (0,000004 cm

3

)

dla bardzo małych komórkach liczonych w najmniejszym kwadracie

00000025

,

0

a

x

=

lub

4000000

•

=

a

x

x - liczba komórek w 1 cm

3

(1 ml); a - średnia liczba komórek w małym kwadracie

lub

4000000

•

=

an

x

n - rozcieńczenie badanej próby
(często w literaturze też taki zapis x = 4 x 10

6

a n)

Zadanie do wykonania

Wykonaj zawiesiny zarodników grzyba z rodzaju:
1.

Fusarium spp.

2.

Penicillium spp.

Nałóż szkiełko na komorę.
Nanieś zawiesinę pod szkiełko
Gęstość zawiesiny makrokonidii Fusarium spp. wyznacz na podstawie zliczenia w „16”
Gęstość zawiesiny mikrokonidii Penicillium spp. wyznacz na podstawie zliczenia

w najmniejszym kwadracie

Podstaw wartości zliczenia do odpowiednich wzorów
Oblicz i zapisz gęstość zarodników badanych grzybów w 1 ml zawiesiny

6

IV.2.2.

Badanie stopnia kolonizacji korzeni przez grzyby endomikoryzowe (VAM)

zmodyfikowaną metodą Philipsa i Haymana (Philips i Hayman, 1970) w modyfikacji Mortona (Morton, 1990).

Zjawisko mikoryzy można zaobserwować na przygotowanych z fragmentów korzeni i odpowiednio utrwalonych
preparatach. Preparaty utrwala się w poliwynylo – laktoglicerolu (PVLG) lub w jodzie (odczynnik Melzera).
Przy stosowanej preparatyce tkanki korzeniowej uzyskuje się szkielet tkanki korzeniowej (ściany komórkowe i
wiązki naczyniowe) z wybarwionymi na ciemno niebieski lub granatowy kolor strzępkami, arbuskulami i/lub
wezikulami grzybów VAM.
Strzępki grzybów VAM, wezikule, arbuskule są zawsze kontrastowe do „tła” wytrawionej tkanki korzeniowej,
znacznie grubsze (ok. 5

µ

m.) od strzępek innych grzybów i nieseptowane. Wewnątrz korzeni strzępki VAM biegną

najczęściej równolegle do wiązek naczyniowych, poza korzeniami są mocniej wybarwione (do ciemnego granatu) i
optycznie grubsze, z wypustkami i rozgałęzieniami. Dla zaobserwowania różnic pomiędzy grzybem mikoryzowym,
a grzybem nie – mikoryzowym celowe jest porównanie obrazu korzeni tej samej rośliny (np. pszenicy) ze strzępkami
grzyba VAM oraz ze strzępkami innego grzyba (np. patogenicznego - Gaeumannomyces graminis v. tritici - Ggt).

Procedura barwienia korzeni roślin
Próbki korzeni roślin przechowywane w zamrażarce rozmroża się w temp. pokojowej (ok. 20

o

C). Korzenie oddziela

się od gleby przez łagodne przemywanie wodą bieżącą na sicie o średnicy oczek 400

µ

m. Korzenie należy pociąć na

2 – 5 mm fragmenty i pozostawić w wodzie przez ok. 5min. dla ich uwodnienia. Próbki tak przygotowanych korzeni
umieszcza się w tygielkach Goocha z perferowanym dnem, zanurza w 10% roztworze KOH i autoklawuje przez
3 min. przy 1atm/121

o

C celem odbarwienia tkanki korzeniowej (należy zastosować powolną dekompresję komory

autoklawu dla uniknięcia uszkodzeń struktury tkanki korzeniowej).
Próbki przemywa się dokładnie H

2

O dest. i zanurza na 1 godz. w 10% roztworze HCl i ponownie przemyć H

2

O

dest.. Następnie próbki zanurza się w roztworze barwnika (błękit trypanowy w laktoglicerolu) i ponownie
autoklawuje. Próbki korzeni należy ostudzić i odsączyć z nadmiaru barwnika.
Następnie przenosi się próbki korzeni na podstawowe szkiełka mikroskopowe z naniesioną wcześniej kroplą
poliwinylo-laktoglicerolu (PVLG).
Po zamknięciu szkiełkiem nakrywkowym i łagodnym przesuszeniu (30

o

C) uzyskuje się trwały preparat – wzorzec

danej próbki przechowywany w temperaturze pokojowej.
Oznaczanie stopnia kolonizacji mikoryzowej korzeni
Kolonizację endomikoryzową korzeni oznacza się metodą mikroskopową. W 50 wybranych polach obserwacji
mikroskopowej preparatu należy przeprowadzić obserwację występowania struktur VAM przy powiększeniu 100 x.
Za fragment skolonizowany przyjmuje się obecność w polu widzenia każdej formy morfologicznej grzyba
endomikoryzowego: arbuskul, wezikul lub strzępek grzyba VAM w tkance korzeniowej.
Wartość procentową kolonizacji oblicza się według wzoru:
liczba fragmentów skolonizowanych/50 fragmentów korzeni x 100

Wykonanie ćwiczenia:

Preparaty:

grzyb VAM – korzenie pszenicy (rosnącej na madzie)
grzyb patogeniczny Gaeumannomyces graminis v. tritici– korzenie pszenicy (rosnącej na madzie)
grzyb VAM – korzenie żyta (rosnącej na rędzinie)
grzyb VAM – korzenie koniczyny (rosnącej na czarnej ziemi)
grzyb Glomus etunicatum utrwalony w PVLG
grzyb Glomus etunicatum utrwalony w PVLG
Przeszukiwać preparaty przy powiększeniu obiektywu 10 x i dopiero po znalezieniu interesującego fragmentu
zwiększyć powiększenie obiektywu (do 20 – 40 x – bez imersji)

•

Wykonać szkic obrazu mikroskopowego i opisać zaobserwowane struktury tworzone przez grzyba VAM

•

Porównać wygląd grzyba VAM i grzyba patogenicznego
(Strzępki Ggt poddane barwieniu błękitem trypanowym są nieregularne, septowane, jasnozłotego koloru i
znacznie cieńsze od strzępek VAM.)

•

Porównać obraz zaobserwowany na: korzeniach różnych roślin; korzeniach rosnących w różnych glebach

•

Określić stopień kolonizacji mikoryzowej korzenia przeprowadzając obserwację w 50 polach widzenia
preparatu, licząc fragmenty skolonizowane i wyliczając procentową wartość kolonizacji wg. podanego powyżej
wzoru.

7

Zagadnienia do zaliczenia nr 1

1.

Podręcznik „Mikrobiologia i biochemia gleb” Paul i Clark

rozdział 3 –
Metody badań mikroorganizmów glebowych Zasada pobierania próbek glebowych;

o

Mikroskopowe metody badania próbek;

o

Sposób oznaczania bioobjętości i biomasy;

o

Cząstki sygnalne i ich oznaczanie;

o

Metody analizy kwasów nukleinowych w glebie;

o

Metody fizjologiczne: hodowle laboratoryjne mikroorganizmów glebowych i techniki
respiracyjne;

o

Formy występowania enzymów w glebie;

o

Czynniki zapewniające stabilność aktywności enzymatycznej gleby;

2.

część teoretyczna i doświadczalna (skrypty) do ćwiczeń