Biohydrometalurgia - laboratorium

A. Pawłowska 2011

Ćwiczenie nr 1.

Przygotowanie krzywej wzorcowej do określania stężenia białka w roztworach.

Metoda Lowry’ego.

Wstęp teoretyczny

Metoda Lowry’ego (Lowry i in., 1951) jest wykorzystywana do oznaczania całkowitej ilości białka w badanej próbce. Polega
na barwnej reakcji białka z jonami miedzi, w warunkach alkalicznych. Końcowa barwa (niebiesko-fioletowa) roztworu jest
wynikiem dwóch reakcji:
a) biuretowej, w której wiązania peptydowe białek reagują z jonami miedzi w warunkach alkalicznych, tworząc jony Cu

+

;

b) jonów miedzi Cu

+

z odczynnikiem Folina i Ciocalteua, w wyniku czego następuje redukcja odczynnika

fosfomolibdenowolframowego do błękitu molibdenowego przez obecne w białku tyrozynę i tryptofan.
Czułość metody: 0,01-1,0 mg białka/mL.

Celem ćwiczenia jest przygotowanie krzywej standardowej stężenia albuminy wołowej w roztworze. Wykres ten pozwoli na
wyznaczenie stężenia białka w próbkach jakie otrzymamy w trakcie kolejnych ćwiczeń.

Odczynniki i roztwory

1)

Roztwór roboczy Folina-Ciocalteu

2)

Odczynnik Lowry’ego

3) Standard białka

Jeśli roztwory nie są przygotowane, proszę postępować wg poniższej instrukcji:

3)

Roztwór roboczy Folina i Ciocalteua: należy odmierzyć 18 mL odczynnika Folina i Ciocalteua, przenieść do butelki
z ciemnego szkła, następnie dodać 90 mL wody dejonizowanej i dokładnie wymieszać.

4)

Odczynnik Lowry’ego: do butelki z odczynnikiem (proszek) dodać 40 ml wody dejonizowanej. Delikatnie wymieszać,
tak aby nie powstało zbyt dużo piany.

5)

Standard białka 400 µg/mL: do buteleczki z albuminą wołową dodać 5 mL wody dejonizowanej i dobrze wymieszać.

Wykonanie

W probówkach należy sporządzić wodne roztwory białka, wg Tabeli 1. Próbki dobrze wymieszać przy pomocy urządzenia
typu vortex. Następnie do 1 ml przygotowanego wodnego roztworu białka dodać 1 ml odczynnika Lowry’ego, wymieszać
i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po upływie tego czasu dodać 0,5 ml roztworu roboczego fenolowego
odczynnika Folina i Ciocalteua. Dobrze wymieszać (vortex). Próby pozostawić w temperaturze pokojowej na 30 minut. Po
tym czasie przenieść roztwory do kuwet i odczytać absorbancję przy 750 nm względem próby kontrolnej, jako odnośnika.

Należy pamiętać o jednoczesnym przygotowaniu próby kontrolnej, w której zamiast roztworu białka stosuje się wodę
dejonizowaną (1 mL) oraz te same odczynniki i procedurę, co w pozostałych próbach.

Tabela 1.

Standard białka [mL]

Woda [mL]

Stężenie białka [µg/mL]

0,125

0,875

50

0,250

0,750

100

0,500

0,500

200

0,750

0,250

300

1,000

0

400

Z uzyskanych danych należy wykreślić krzywą zależności Absorbancja = f (stężenie białka).