Ć

WICZENIE XI

Mikrobiologia środowiska wodnego

Skład jakościowy i ilościowy mikroorganizmów wodnych

Bakterie, które występują w wodzie lub ściekach są w większości saprofitami. Są to gatunki typowo wodne lub

glebowe. Obok nich mogą się jednak znajdować gatunki, dla których naturalnym siedliskiem jest organizm człowieka lub
zwierzęcia, a do wody dostały się wraz ze ściekami bytowo-gospodarczymi, wodami opadowymi lub zostały wprowadzone
bezpośrednio z zanieczyszczeniami kałowymi. Są wśród nich również gatunki saprofityczne, które należą do tzw. naturalnej
mikroflory przewodu pokarmowego i odżywiają się nie strawionymi resztkami pokarmowymi (bakterie grupy coli, Streptoccocus
faecalis, Clostridium perfringens). W wydalinach ludzi chorych mogą znajdować się bakterie patogenne (bakterie czerwonki,
tyfusu itp.) lub warunkowo patogenne np. Pseudomonas aeruginosa.

Bakterii chorobotwórczych nie wykrywa się w wodzie lub ściekach bezpośrednio. Korzysta się w tym celu z metody

pośredniej, polegającej na wykrywaniu bakterii uznanych za tzw. wskaźniki sanitarne.
Gatunkiem będącym takim właśnie wskaźnikiem jest Escherichia coli.

Za bakterie grupy coli uważa się gram ujemne pałeczki nie wytwarzające przetrwalników, rozwijające się w warunkach

względnie beztlenowych, mające zdolność fermentowania laktozy z wytwarzaniem kwasu i gazu, w ciągu 48 godzin hodowli w
temperaturze 35-37

o

C. Grupa ta nie jest jednolita. Należą do niej bakterie z rodzaju Escherichia, Citrobacter i Enterobacter

należące do rodziny Enterobactericeae.

Obok wymienionych elementów analizy sanitarnej, proponuje się obecnie dodatkowo wykrywanie bakterii z gatunku

Pseudomonas aeruginosa w wodzie do picia i potrzeb gospodarczych oraz w wodzie dla zakładów kąpielowych i pływalni, a
także w wodach powierzchniowych i ściekach. Bakterie te stanowią potencjalny czynnik chorobotwórczy dla ludzi i zwierząt.
Poza tym, P. aeruginosa występuje powszechnie w wodach powierzchniowych i glebie. Może bytować również w chlorowanej
wodzie, gdyż jest to bakteria odznaczająca się znaczną odpornością na dezynfekujące działanie chloru.

W ocenie hydrobiologicznej badanych wód prowadzi się badania jakościowe i ilościowe.

Część jakościowa polega na mikroskopowej obserwacji preparatów i określaniu przynależności systematycznej

oglądanych obiektów na podstawie ich cech morfologicznych.

Część ilościowa natomiast, polega na policzeniu osobników należących do poszczególnych rodzajów lub gatunków i

obliczeniu stosunku procentowego poszczególnych grup systematycznych do ogólnej liczby organizmów, co pozwala na
wykrycie gatunków dominujących w biocenozie.

W zależności od trybu życia w warunkach naturalnych organizmy wodne można podzielić na kilka zespołów, wśród

których trzy są najważniejsze. Jest to:
- plankton - żywa zawiesina (bioseston) unosząca się w toni wodnej. W obrębie tego zespołu wyróżnia się bakrerioplankton (żywa
zawiesina bakterii), fitoplankton (żywa zawiesina drobnych roślin) i zooplankton (żywa zawiesina drobnych zwierząt);
- perifiton - składający się z organizmów prowadzących życie osiadłe przy brzegach zbiornika. Są to formy, które w postaci
delikatnego osadu pokrywają przedmioty podwodne;
- bentos - jest zespołem organizmów dennych żyjących na powierzchni wewnątrz osadów. W głębokich zbiornikach, gdzie
ś

wiatło nie dociera do dna, bentos składa się tylko z przedstawicieli świata zwierzęcego oraz bakterii należących do względnych i

bezwzględnych beztlenowców.

Grzyby wodne są umownym zgrupowaniem gatunków, które występują wyłącznie lub przeważnie w środowisku

wodnym, lecz przeprowadzenie wyraźnej granicy między grzybami wodnymi a np. lądowymi nie jest możliwe. Pewne grzyby
bytujące w glebie np. Mucor i Rhizopus, można spotkać w wodzie lub osadach dennych. Grzyby występują w środowisku
naturalnym w postaci zarodników lub form przetrwalnych. W rzekach zanieczyszczonych ściekami organicznymi rozwija się
masowo tzw. grzyb ściekowy Leptomitus lacteus, którego luźno splątana biaława plecha pokrywa grubą warstwą dno i brzegi
rzeki.

Krążenie Fe i Mn w ekosystemach wodnych

Zjawisko to ma wspólne cechy ogólne –

wytrącanie związków tych pierwiastków do osadów dennych oraz ich redukcja w osadach.

Fe dostaje się do wód w postaci soli żelazawych lub humianów
oraz ze spływami powierzchniowymi zawierającymi utlenione związki Fe w postaci zawiesiny.
Huminiany Fe są rozkładane przez Siderocapsa treubii.
Fe stanowi 4-5% całkowitej zawartości minerałów w roztworach wodnych poddanych działaniu O

2

.

Występuje pod postacią Fe(OH)

2

o rozpuszczalności (pH 7) 10

-38

co ogranicza rozpuszczalność Fe

+3

do 10

-14

µ

M.

Rozpuszczalność Fe

+3

maleje 1000x z każdą jednostką wzrostu pH (zasadniczo niedostepny powyżej 4).

Rozpuszczalność Fe

+2

maleje 100x z każdą jednostką wzrostu pH.

Przy kwaśnym odczynie środowiska i w warunkach beztlenowych Fe występuje w formie Fe

+2

.

W warunkach naturalnych zawartość Fe jest bardzo zmienna.

Wody przybrzeżne - 0,06 – 6

µ

M.

Wody morskie

- 0,0001 – 0,001

µ

M.

Potencjał +300mV (cytochromy A) do – 500mV(ferrodoksyny) decyduje o jego ogromnym zaangażowaniu w
zasadnicze procesy życiowe i wielkim na niego zapotrzebowaniu.
Jedynie Lactobacillus może funkcjonować prawidłowo bez Fe (20at/1 kom.)- E. coli 10

5

-10

6

at./kom zastępując Fe

kobaltem. Bacillus zastępuje Fe w metaboliźmie wtórnym Mg.

Organizmy wykształciły odpowiednie mechanizmy pobierania Fe.

Przy wysokim stężeniu Fe

Zaangażowane są reduktanty, błonowe ATPazy, reduktaza flawinowa

Przy niskim stężeniu Fe

a.

niskocząsteczkowe ligandy specyficzne kompleksujące Fe

+3

siderofory

b.

system transportu

Grzyby: 21 sideroforów hydroksamowych, bakterie 11 sideroforów hydroksamowych, 11 katecholowych.

Rośliny wykształciły 2 strategie:

I strategia – nietrawiaste

Wytwarzają substancje redukujące, reduktanty fenolowe, protony, napędzana ATP pompa protonowa

II strategia – produkujące fitosiderofory

ś

yto – kwas 3’OH mugineinowy; jęczmień – kwas distichinowy, owies – kwas awenowy; kukurydza, ryż, jęczmień -

kwas deoxymugineinowy

Sole żelazawe i manganawe są utleniane do związków żelazowych i manganowych wskutek biochemicznej
aktywności Desulfovibrio desulfuricans, Bacillus circulans, Bacillus polymyxa do fosforanów lub kwaśnych
węglanów żelazowych i manganowych.
Redukcja jest procesem dostarczającym bakteriom O

2

do utleniania substancji energetycznej.

Należą do grupy amonifikatorów, bakterii fermentacji masłowej – czyli nie jest to wyspecjalizowana grupa.

Bacillus polymyxa w warunkach beztlenowych redukuje głównie azotany i dopiero gdy ich zabraknie zaczyna redukować Fe(OH)

3

.

Jeziorne rudy żelazowo-manganowe tworzą się przy intensywnym dopływie związków Fe i Mn, odpowiedniej ilości

substancji organicznej i potencjale oksydoredukcyjnym.

Bakterie żelaziste, które odkładają złogi nierozpuszczalnego Fe(OH)

3

są głównie organizmami wodnymi.

Bezwzględne autotrofy czerpią z utleniania Fe

2+

do Fe

3+

energię do chemosyntezy.

Thiobacillus ferroxidans występuje w kwaśnych wodach pirytowych.
Proces utleniania Fe

+2

dostarcza zaledwie 11 kcal/mol [utlenianie N (66kcal), utlenianie S (118kcal)].

Ponieważ na związanie 1 atomu C konieczne jest utlenienie 750 atomów Fe efekt biogeochemicznego działania
autotrofów jest bardzo wyraźny.
Leptotrix (obok Crenotrix i Cladotrix względny autotrof)

może wykorzystywać organiczne związki Fe (np. humiany).

Właściwe bakterie żelaziste należy odróżnić od tych bakterii, które mogą gromadzić drobne ilości żelaza lub
pośrednio powodować jego wytrącanie przy utlenianiu substancji organicznej albo przez zmianę środowiska.
Bakterie żelaziste czerpią energię potrzebną im do asymilowania CO

2

z utleniania związków żelazawych do

ż

elazowych. Węgiel jest asymilowany na drodze chemosyntezy. Wśród bakterii żelazistych wyróżniamy następujące

grupy:
- bezwzględne autotrofy;
- względne autotrofy mogące utleniać połączenia organiczne, ale zdolne również do utleniania związków żelazawych
do żelazowych i do wykorzystania uwolnionej przy tym energii d
o asymilacji CO

2

;

- heterotrofy gromadzące wodorotlenek żelaza, lecz nie uzyskujące energii z jego utleniania.
Spośród autotrofów w wodach występują formy nitkowate oraz jednokomórkowe i kolonialne. Nitkowate to głównie
gatunki Galionella. Wśród heterotroficznych najczęściej spotykane są Leptotrix, Crenotrix, Siderocapsa.

W strefie oligosaprobowej zbiornika wodnego, w której woda powraca do stanu całkowitej czystości a

mineralizacja zanieczyszczeń organicznych jest daleko posunięta, chociaż jeszcze nie zakończona zupełnie,
ponieważ stwierdza się w wodzie obecność nie rozłożonych stabilnych substancji organicznych np. zw.
huminowych, namnażają się nitkowate bakterie żelaziste z grupy Leptotrix i Ochracea. Pojawienie się form bakterii
ż

elazistych jest wskaźnikiem powrotu wody do stanu czystości.

Leptotrix

Crenotrix

Spirillum

Leptotrix
ochracea

Leptotrix
crassa

Leptotrix
sideroporus

Crenotrix
polyspora

Crenotrix
ferruginea

Spirillum
ferrugineum

Gallionella

Siderocapsa

Gallionella
ferruginea

Gallionella
corneata

Gallionella
planctonica

Siderocapsa
coronata

Siderocapsa
major

Mangan

może być utleniany do trudnorozpuszczalnego brunatnego dwutlenku Mn przez Aerobacter, Bacillus, Pseudomonas.
Niektóre bakterie żelaziste np. Sphaerotilus manganifera są zdolne do utleniania związków Mn i odkładania w swych
komórkach wodorotlenku Mn oprócz wodorotlenku Fe.

w jeziorach eutroficznych sole Fe i Mn w okresach stagnacji

przechodzą ze złogów w osadach dennych do masy wodnej.

w jeziorach oligotroficznych związki Fe i Mn nagromadzają się w warstwie dennej

i nie uczestniczą w dalszym krążeniu.

Leptotrix (ochracea, crassa, sideroporus), Crenotrix polyspora – nitkowate.
Rozmnażają się przez tworzenie na końcach nitek komórek przetrwalnikowych – nieruchliwych lub płytek. Leptotrix
w wodach wolno płynących, Crenotrix w wodach stojących.
Gallionella (ferruginea, corneola, planctonica) – małe pałeczki wydzielające bardzo dużo śluzu w postaci nitek lub
wstążeczek wysyconych Fe(OH)

3

, rośnie lepiej w atmosferze wysyconej CO

2

.

Spharotilus masowo rozwijający się w wodach zanieczyszczonych ściekami organicznymi.
Obfity rozwój w osadzie czynnym powoduje zjawisko pęcznienia w urządzeniach chłodniczych.
Komórki tworzą nitki tkwiące w pochewce śluzowej
Streptotrix - bardzo często w osadzie czynnym głównie obciążonym ściekami z rzeźni lub ferm
Siderocapsaceae- komórki kuliste, owalne, lub pałeczkowate w śluzowych otoczkach występują w wodzie na
powierzchni roślin wodnych.

Nitryfikacja

Przemiany substancji azotowych w wodzie

Proces nitryfikacji prowadzący do wytwarzania najłatwiej przyswajalnych związków azotu ma ogromne znaczenia dla

biologii zbiorników wodnych. Jest to kolejny po amonifikacji proces zwracający do obiegu związki azotu.
W procesie tym amoniak i sole amonowe ulegają utlenianiu do kwasu azotawego a następnie do kwasu azotowego i ich soli.
Jednocześnie w wyniku tego procesu powstają ze związków mineralnych substancje organiczne bakterii.

Bakterie nitryfikacyjne to głównie chemoautotrofy i tlenowce. Także wiele heterotrofów może brać udział w procesie

nitryfikacji, ale rzadko powodują one nagromadzenie się większych stężeń azotynów i azotanów. Wzrost komórek heterotrofów
nie zależy od tego procesu utleniania.

Ponieważ w niektórych środowiskach istnieją warunki nie sprzyjające wzrostowi autotrofów skutek nitryfikacyjnej

działalności autotrofów i hetrotrofów może być podobny.

Energię do chemosyntezy autotrofy czerpią z utleniania zredukowanych form azotu np. amoniaku (I faza nitryfikacji)

lub azotynów (II faza nitryfikacji).

Bakterie nitryfikacyjne są wrażliwe na działanie temperatury. Proces nitryfikacji zachodzi dopiero w temp. 8

o

C.

Optimum termiczne wynosi 28-30

o

C. Przy 50

o

C bakterie te giną. Stwierdzana jest ponadto wyjątkowa wrażliwość tej grupy

bakterii na zbyt duże stężenie związków organicznych oraz związków toksycznych.
W dwóch fazach nitryfikacji uczestniczą odmienne rodzaje bakterii.

Przeprowadzana jest w dwu etapach przez 2 typy bezwzględnych chemoautotrofów:

I etapu: NH

3

do NO

2

-

i II etapu: NO

2

-

do NO

3

-

Bakterie utleniające NH

3

do NO

2

reprezentowane są przez:

Nitrosomonas, Nitrocystis, Nitrosolobus, Nitrosospira

Drobnoustroje te są zbliżone do Pseudomonadales – rosną na granicy dwóch faz – głównie na powierzchni ciał
stałych.
W wysuszonej glebie mogą przetrwać w stanie życia utajonego (anabiozy) przez wiele lat.
NH

3

(nie przenikający przez błony) jest utleniany na hydroksylaminę – (łatwo przenikającą przez błony)

2 drogi utlenienia:

•

dwuhydroksylamina

•

nitroksyl

3 koncepcja – hydroksylamina tworzy związek kompleksowy z metalem i łącząc się z układem flawoproteina –
cytochromy oddaje kolejno po 1 elektronie.
Redukcja NAD (podobnie jak w fotosyntezie bakteryjnej) zachodzi przy udziale odwrotnego łańcucha przenoszenia
elektronów z wykorzystaniem energii z ATP.

HNO

2

jest silnie toksyczny dla bakterii - 0,3 M hamuje metabolizm w 30%

Bakterie utleniające NO

2

-

na NO

3

-

reprezentowane przez:

Nitrobacter, Nitrococcus, Nitrospira. śyją w środowisku lekko alkalicznym (7,7), słabiej adsorbują się na
powierzchni ciał stałych.
Wolny NH

3

hamuje silnie chemosyntezę, już przy 0,001 M stężeniu obniża intensywność procesu o 70%.

Nie są hamowane przez ślady substancji organicznej. Rozwijają się normalnie na pirogronianie, mannitolu, octanie,
maślanie, asparaginie.
W glebach bytuje ok. 1

•

10

4

cfu/g gleby.

Działają przy pH 6,5-7,5, a przy pH 3,5-4 nitryfikacja ustaje. Bytują głównie w powierzchniowej warstwie gleby, w
temperaturze 10

o

-30

o

C, też <5

o

C do >40

o

C. Optymalna ok. 30

o

C. Najsilniej wiosną i jesienią.

Rola bakterii nitryfikacyjnych w wodach powierzchniowych polega na usuwaniu NH

3 i

NO

2

-

,

które w większych

ilościach mogą być szkodliwe zarówno dla organizmów wodnych jak i człowieka oraz dostarczaniu roślinom
najkorzystniejszego źródła N.
Utlenianie azotynów dostarcza znacznie mniej energii (17 kcal) niż utlenianie NH

3

(66 kcal).

Szybkie utlenianie NO

2

-

do NO

3

-

powoduje, że stężenie NO

2

-

w wodach powierzchniowych jest rzędu 0,01 mg/l.

Przy utlenianiu N-amonowego stosunek C (z CO

2

)

:

N(utlenianego) wynosi 1:35

Przy II fazie C:NO

2

-

1:135

W I fazie, którą można przedstawić w postaci reakcji:
NH

4

+

+ 1

1

/

2

O

2

--------> H

2

O + 2H

+

+ NO

2

-

+ 66kcal

Hipotetyczny przebieg reakcji wg. Kluyvera
H

H - 2H H O
N H N H N + H

2

O

H OH H
OH
wodorotlenek hydroksyloamina nitroksyl
amonowy
O +H

2

O H -2H O

N N OH N + H

2

O

H OH OH
dwuhydroksyamoniak kwas azotawy
W I fazie uczestniczą bakterie z rodzaju Nitrososomonas, Nitrosospira i Nitrosolobus.
II faza
+H

2

O -2H

HNO

2

HON(OH)

2

HNO

3

+ 17kcal

Prowadzona jest przez bakterie z rodzajów Nitrobacter, Nitrospira, Nitricoccus.

Gatunki bakterii nitryfikacyjnych wodnych:

Nitrosomonas europea, Nitrocystis oceanus – I faza
Nitrobacter winogradski i Nitrobacter agilis – II faza
Rozwijają się na granicy woda – ciało stałe (powierzchniowa warstwa osadów)

Bakterii nitryfikacyjnych jest mało:

W wodach oligotroficznych – brak dostatecznej ilości NH

3

W wodach eutroficznych – niedobór O

2

Rzeki, jeziora zawierają 100 cfu/l lub znacznie mniej.
Dla ekologii wód ważne są przede wszystkim procesy utleniania.
Proces nitryfikacji pozwala usunąć z wód toksyczny NH

3

(już przy 0,001 M) oraz HNO

2

(0,3 M) do 0,01 mg/l.

Jest ważnym wskaźnikiem stopnia saprobowości wód.

Wykonanie ćwiczenia

Pośrednie metody obliczania ogólnej liczby drobnoustrojów w wodzie

Ogólna liczebność bakterii i grzybów

Wykonaj posiewy metodą płytek tartych wylewając po 0,1 ml odpowiedniego rozcieńczenia na

powierzchnię podłoża agarowego na płytce.
Posiew na powierzchnię agaru odżywczego pozwoli odczytać ogólną liczbę jtk bakterii w wodzie.
Posiew na powierzchnię podłoża Martina umożliwi określenie liczby jtk grzybów w wodzie.

Pośrednie metody obliczania grup fizjologicznych drobnoustrojów w wodzie

Drobnoustroje

nitryfikacyjne

Płynną pożywkę Lewisa i Pramera w zestawie trójprobówkowym NPL (po 5 ml pożywki płynnej) zaszczep badaną wodą
przenosząc rozcieńczenia 10

-1

do 10

-8

po 0,5 ml w 3 powtórzeniach. Inkubuj w temperaturze 25

o

C. Po okresie inkubacji sprawdź

obecność azotynów i azotanów oraz amoniaku - brak pomarańczowo-żółtej barwy po dodaniu odczynnika Nesslera wskazuje na
brak NH

3

w płynie pohodowlanym. Do oznaczenia kwasu azotawego stosuje się odczynnik Griessa.

Do płynu pohodowlanego dodajemy odczynnik Griessa: 4 krople odczynnika A i odczynnika B.
A - kwas sulfanilowy (8g), kwas octowy 5 N (1000 ml)
B - naftylamina (8g),

kwas octowy 5 N (1000 ml)

Różowe zabarwienie płynu świadczy o obecności kw. azotawego. Jeśli nie pojawia się różowe zabarwienie sprawdzamy czy nie
powstał kwas azotowy. W tym celu dodajemy do płynu sproszkowanego Zn (katalizator reakcji redukcji kwasu azotowego do
azotawego), który powoduje pojawienie się różowego zabarwienia jako wyniku reakcji odczynnika Griessa z kwasem azotawym.

Dla potwierdzenia zajścia procesu nitryfikacji konieczne są obserwacje mikroskopowe
kultur i stwierdzenie obecności drobnoustrojów przeprowadzających ten proces.

W zbiornikach wodnych często występują różne odmiany

Nitrosomonas europaea

Winogradsky o owalnych lub lekko jajowatych komórkach 1,1x0,45µm

, różniące się

wielkością i kształtem komórek.

W kulturze znajdują się jednocześnie komórki w różnych

stadiach rozwojowych, co stwarza wrażenie ich pleomorfizmu. Charakterystyczna dla
kultury jest obecność komórek gruszkowatych o słabej barwliwości.
Dlatego do barwienia komórek Nitrobacter poleca się stosować metody
wykorzystywane do barwienia przetrwalników.

Otrzymanie czystych kultur Nitrosomonas jest

procesem złożonym, wskutek obecności w koloniach tego mikroorganizmu bakterii towarzyszących.

Barwienie: Wykonaj preparat pobierając materiał z hodowli płynnej i utrwal w płomieniu palnika.
Zabarw preparat stosując metodę zimną Bartholomewa i Mittwera:
-zalej preparat 7,6% roztworem zieleni malachitowej na 10 min.
-przemyj wodą bieżącą w ciągu 10 sek.
-zalej 0,25% roztworem safraniny na 15 sek.
-przemyj i wysusz

Metoda hodowli i obserwacji drobnoustrojów żelazistych w wodzie

Etap I - Zakładanie hodowli

Wodę umieszcza się w jałowym naczyniu wraz z osadem pochodzącym z tego samego zbiornika.

Na powierzchni wody w takim naczyniu umieszcza się płaski krążek z korka, w którego dolną część wkład się kilka

szkiełek nakrywkowych.

Krążek swobodnie pływający w naczyniu pozostawia się na okres 2-3 tygodni. W tym czasie do powierzchni szkiełek

przytwierdza się wiele bakterii żelazistych. Po pewnym czasie po osadzeniu się mułu (osadu) w warstwie wody pojawiają się
podobne do waty skupienia, a potem rdzawe plamy.
Etap II - Barwienie i mikroskopowanie bakterii żelazistych

Po okresie inkubacji:

Korek wyjmuje się z wody. Za pomocą bibuły filtracyjnej usuwa się ze szkiełek nakrywkowych wodę,

suszy na powietrzu, utrwala przez zanurzenie na 15 nim. w alkoholu metylowym.
Równe objętości 2% roztworu żelazocyjanku potasowego i 5% kw. octowego przygotowanego w wodzie
destylowanej miesza się i ogrzewa do zagotowania.
Preparat zanurza się na 2 minuty do gorącego roztworu, przemywa wodą destylowaną i dobarwia 2% roztworem
safraniny w wodzie.
Ponownie przemywa się wodą i suszy.
Komórki bakterii żelazistych barwią się na kolor czerwony, wydzieliny żelaza na niebiesko.
Preparaty poddajemy obserwacji mikroskopowej i oznaczamy do rodzaju: Leptotrix, Crenotrix, Spirillum,
Gallionella, Siderocapsa i gatunku.

Literatura:

Błaszczyk M.K. 2007. Mikroorganizmy w ochronie środowiska. PWN. W-a.
Libudzisz Z., Kowal K., śakowska Z. 2007. Mikrobiologia techniczna. Tom 1. Mikroorganizmy i
ś

rodowiska ich występowania. PWN. W-a.

Alef K., Nannipieri P. 1995. Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press Limited,
J. Paluch 1993. Mikrobiologia wód. PWN. W-a.
M. Pawlaczyk-Szpilowa 1978 Mikrobiologia wody i ścieków. PWN. W-a.
M. Pawlaczyk-Szpilowa 1980 Ćwiczenia z mikrobiologii wody i ścieków. PWN. W-a.