Mikrobiologia Ćw. 11

Badanie serologiczne

(odczyn aglutynacji, precypitacji, Coombsa, ASO)

Badanie serologiczne:

Istota badania - wykrywanie za pomocą znanego antygenu diagnostycznego (zarazka) swoistych dla niego przeciwciał w badanej surowicy.

Cel badań serologicznych:

1. Rozpoznawanie aktualnie toczącego się zakażenia, np. przez badanie tzw. „par surowic”

2. Stwierdzenie przebycia w przeszłości przez organizm zakażenia, w tym także bezobjawowego (tzw. przeglądy
epizootiologiczne)

3. Określenie aktualnego stanu odporności poszczepiennej (określenie czasu podjęcia szczepienia)

Badanie serologiczne:

- pozwala nie tylko wykazać obecność przeciwciał (badanie jakościowe), ale także ustalić ich ilość (badanie ilościowe)
przez określenie tzw. miana surowicy (największe końcowe rozcieńczenie surowicy lub najmniejsza ilość, w któ®ych
wystąpiła jeszcze widoczna dodatnia reakcja serologiczna)

- każda surowica zawiera z reguły pewną niewielką ilość przeciwciał, określaną jako miano fizjologiczne (ujemne),
które nie świadczy o przebytym kontakcie z zarazkiem. Dopiero wartości wyższe od miana fizjologicznego -
chorobowe (miano dodatnie) przemawia za przebytym zakażeniem określonym drobnoustrojem

- obecność przeciwciał dla danego zarazka może być następstwem: otrzymywania ich od matki (młode osobniki),
przebycia zakażenia bezobjawowego, szczepienia lub choroby

Odczyn aglutynacji:

- aglutynacja szkiełkowa - próba jakościowa, bywa często stosowana do szybkich badań masowych (np. rozpoznawanie pulorozy, mikoplazmozy itp. u drobiu) - kroplę krwi, zamiast surowicy, mieszamy z antygenem diagnostycznym i stwierdzamy w przypadku pozytywnym, zlepianie się kompleksów antygen-przeciwciało w grudki, widoczne gołym okiem lub za pomocą lupy

- aglutynacja probówkowa - stosujemy wzrastające rozcieńczenia badanej próby badanej surowicy (długość szeregu rozcieńczeń dostosowujemy: w badaniach masowych - do odpowiednich instrukcji, przy określaniu pewnego
miana - do prawidłowej wysokości, niekiedy nastawienie dłuższego szeregu konieczne jest z uwagi na zjawisko STREFY - paradoksalny brak aglutynacji w niższych, a obecność wyższych rozcieńczeniach).

Odczyn Coombsa (antyglobulinowy):

- w pewnych przypadkach odczyn aglutynacji daje wynik ujemny, mimo obecności w surowicy przeciwciał swoistych
dla danego antygenu (blokowanie antygenu przez przeciwciała niekompletne) - pozornie ujemny wynik może
pojawić się również w przypadku nadmiaru przeciwciał lub antygenu

- służy do serologicznego wykrywania niekompletnych przeciwciał i polega na reakcji serologicznej globulina-
antyglobulina

- przeciwciała kompletne mają dwie grupy czynne (fragment Fab) - są funkcjonalnie dwuwartościowe i łączą się z
antygenem w duże kompleksy widoczne w postaci aglutynatów (osad w probówce)

- przeciwciała niekompletne mają tylko jedna grupę chwytną funkcjonalną - jednowartościowe - łączą się z
antygenem, lecz nie powodują widocznego odczynu. Dodanie do takiej zawiesiny surowicy antyglobulinowej
powoduje widoczną reakcję. Surowicę taką, zwaną Coombsa lub antyglobulinową tego gatunku zwierzęcia, którego
surowicę badano.

- odczyn Coombsa znajduje zastosowanie w rozpoznawaniu chorób zakaźnych u ludzi i zwierząt np. brucelozy
(aglutynacja wypadła ujemnie, a istnieje podejrzenie o zakażenie), chorób hemolitycznych źrebiąt i prosiąt itp.

Odczyn precypitacji:

- precypitacja pojedyncza (prosta) - badana substancja dyfunduje do żelu, zawierającego znaną surowicę diagnostyczną. W miejscu optymalnego stężenia kompleksów immunologicznych (antygen-przeciwciało) powstają prążki precypitacyjne.

- precypitacja podwójna - oba składniki dyfundują ku sobie (surowica i antygen). W miejscu optymalnego stężenia kompleksów immunologicznych powstają prążki precypitacyjne.

- dyfuzja radialna - surowica dyfunduje z basenika do żelu zawierającego antygen diagnostyczny. Dodatni wynik - pojawia się powstaniem pierścienia precypitacyjnego wokół basenika (im więcej przeciwciał, tym szerszy pierścień precypitacyjny).

- precypitacja pierścieniowa - na antygen diagnostyczny, wprowadzony do probówki lub kapilary, nawarstwiamy badaną surowicę. W przypadku obecności odpowiednich przeciwciał w surowicy powstaje na granicy płynów w ciągu kilku min. wyraźny pierścień precypitacyjny.

Odczyn aglutynacji biernej (pośredniej):

- łączy w sobie cechy odczynów precypitacji i aglutynacji - przeciwciało łączące się z antygenem nieupostaciowanym (diagnostycznym) zaadsorbowanym na nośniku (bantoinit, lateks, węgiel), powoduje ich aglutynację. Jeśli nośnikiem jest krwinka czerwona odczyn określamy mianem hemaglutynacji biernej (pośredniej).

Odczyn antystreptolizynowy (ASO):

- odczyn określa poziom antystreptolizyny (przeciwciał przeciw toksynom Streptococcus pyogenes) w surowicy
pacjenta

- Streptococcus pyogenes wytwarza szereg toksyn - m.in. hemolizyny (substancje powodujące hemolizę
erytrocytów) zwane streptolizynami (są dwie: „O” oraz S”); tylko jedna z nich („O”) jest immunogenna i przeciwko
niej nasz układ immunologiczny wytwarza przeciwciała - antystreptolizyny

- po przebyciu choroby, której przyczyną jest Streptococcus pyogenes (beta-hemolizujące grupa A), możliwymi
powikłaniami są: uszkodzenie mięśnia sercowego, kłębuszkowe zapalenie nerek i reumatoidalne zapalenie stawów

Metodyka:

- wykorzystujemy szereg rozcieńczeń badanej surowicy

- do każdej probówki dodajemy po 1 j.m. streptolizyny

- aby uwidocznić reakcję dodajemy 5% erytrocyty królicze, które hemolizują pod wpływem streptolizyny „O”

- inkubujemy próby w cieplarce (37°C, 45 min.)

Wynik dodatni - w surowicy jest wystarczająca ilość antystreptolizyn, aby zneutralizować podaną streptolizynę, erytrocyty nie rozpadają się (brak hemolizy), opadają na dno probówki, a roztwór staje się klarowny

Wynik ujemny - w surowicy jest niewystarczająca ilość antystreptolizyn, aby zneutralizować podaną streptolizynę, nadmiar streptolizyny powoduje rozpad erytrocytów (hemoliza) i roztwór w probówce staje się czerwony

- odczytujemy miano odczynu - tj. największe rozcieńczenie surowicy badanej, w którym brak jest hemolizy

- miano fizjologiczne poniżej 1:200

- gdy miano odczynu ASO = 1:200 - świadczy to o wcześniej przebytym procesie chorobowym

- gdy miano odczynu ASO >> 1:200 - świadczy to o tym, że niedawno toczył się proces chorobowy, zagrożenie
reumatyczne

1

---