REPLIKACJA DNA I POWSTAWANIE MUTACJI
1) Replikacja DNA
2) Telomery
3) Cykl komórkowy
4) Mutacje jako skutek braku naprawy replikowanego DNA
5) Rodzaje mutacji
6) Mutacje a funkcje białek
7) Naprawa DNA – wybrane mechanizmy
8) Mutacje jako zmiany dużych odcinków DNA
9) Mutacje liczby chromosomów
1) Replikacja DNA – konieczność odsłonięcia jednoniciowego DNA
Rozdzielenie podwójnej nici powoduje odsłonięcie ‘lepkich’ pojedynczych nici, które
maja tendencję do ponownego łączenia się. Zapobiegają temu białka SSBs (single strand
binding).
1) Replikacja DNA – inna przeszkodą jest skręcenie helisy
Nić helisy jest skręcona i to skręcenie się nasila w miarę przesuwania się kompleksu
replikacyjnego. Rozwiązaniem jest działanie topoizomerazy, która nacina jedną z nici,
przepuszcza drugą przez powstałą przerwę i doprowadza do powtórnego złączenia.
1) Replikacja – jeszcze inny problem, przeciwbieżność nici DNA
- Kopiowanie musi przebiegać w jednym kierunku podwójnej nici DNA (od 5’ do 3’ nowej
nici), ale dwie nici składowe są przeciwbieżne
1) Replikacja DNA
– rozwiązaniem jest „normalna”
replikacja w przypadku nici
“wiodącej” i odcinkowa replikacja
(fragmenty Okazaki) “spóźniającej
się” nici DNA
1) Replikacja DNA
- helikaza – rozdziela starą podwójną nić DNA umożliwiając przyłączenie się polimerazy DNA do
nici pojedynczych
- polimeraza DNA – odpowiedzialna jest za dokładanie komplementarnych zasad do starych nici
DNA, czyli powstawanie nowych
- topoizomeraza – likwiduje naprężenia powstające w rozplątywanej podwójnej nici DNA poprzez
nacinanie pojedynczych nici, co pozwala na ich przeplecenie się, a następnie połączenie
- primaza RNA – tworzy krótkie komplementarne odcinki RNA na spóźniającej się nici DNA, które
służą za startery (ang. primers) do syntetyzowania fragmentów Okazaki
- ligaza DNA – łączy fragmenty Okazaki w ciągłą nową nić
1) Replikacja DNA - inicjacja
- chromosomy bakterii (a także plazmidy i koliste genomy wirusów) mają jeden początek replikacji:
odwijanie nici zachodzi w obu kierunkach co prowadzi do tworzenia się charakterystycznej
„struktury teta” (θ)
- u organizmów eukariotycznych występuje wiele początków replikacji w każdym z chromosomów
bakterie
eukarionty
1) Replikacja DNA - kohezyny
By zapobiec splątywaniu się dwóch siostrzanych nici (chromatyd)u eukariontów, są one
natychmiast po replikacji łączone równolegle przez białka kohezyny. Kohezyny są rozszczepiane
dopiero przy rozchodzeniu się chromatyd w anafazie.
1) Replikacja DNA – terminacja
Koniec replikacji kolistego DNA to dwa identyczne koła. Problem pojawia się przy zakończeniu
replikacji liniowych chromosomów eukariontów. Na ostatnim fragmencie nici opóźniającej się
(lagging) nie można utworzyć starteru RNA i dlatego ta nić jest krótsza po replikacji.
2) Telomery
Końce chromosomów to telomery. Są to
odcinki gdzie w kilkuset kopiach występuje
sekwencja 5’-TTAGGG-3’. Okazuje się, że
jest to wynik działania telomerazy, enzymu
mającego za zadanie wydłużanie końca
chromosmu. Jest to białko o aktywności
odwrotnej transkryptazy do którego
doczepiona jest cząsteczka RNA (z sekwencją
5’-CUAACCCUAAC-3’) służąca za
przesuwającą się matrycę.
2) Telomery a starzenie się komórek
Telomeraza jest aktywna w komórkach
lini generatywnej i komórkach
progenitorowych (stem cells). W tkankach
normalnie nie działa. Telomery się
skracają i to jest ich ‘zegarem’ starzenia
się. Po odliczonej liczbie podziałów, np.
kilkudziesięciu, komórka nie może się
dalej dzielić. W hodowli komórek to
sytuacja niepożądana. Dlatego nieraz
aktywuje się telomerazę sztucznie.
Spontaniczne wznowienie aktywności
telomerazy obserwuje się w komórkach
rakowych.
3) Cykl komórkowy
Komórka musi zgrać podział DNA z podziałem komórki. Cykl komórkowy składa się z faz: M
(mitoza, podział komórki), G1 (gap 1, normalny metabolizm), S (synthesis, replikacja DNA), G2
(gap 2, okres oczekiwania na podzial komórki). Za punkty kontrolne cyklu uważa się moment
wejścia w fazę S i w fazę M. Przejście w te fazy jest rządzone przez skomplikowane procesy, ale
jednymi z elemetów kontroli są białka cykliny, których ilości zmieniają się w trakcie cyklu. Dla
przykładu, cykliny mitozy są szczególnie obfite w tej fazie. Aktywują one mitozę, ale i
powstrzymują replikację (fazę S). Gdy je zablokowano, uniemożliwiono wejście w fazę M i
spowodowano nadreplikację DNA.
4) Mutacje jako skutek braku
naprawy replikowanego DNA
Mutacje powstają gdy do DNA
wstawiony zostanie
niekomplementarny nukleotyd (górny
rysunek). Jeśli niekomplementarny
nukleotyd zostanie odowiednio szybko
wymieniony (naprawa DNA, repair) to
mutacji jako dziedzicznej zmiany nie
będzie (dolny rysunek).
Mutacje punktowe (substytucje)
dzielimy na tranzycje (puryna do
puryny, pirimidyna do pirymidyny;
A→G, G →A, T →C, C →T) i
transwersje (puryny w pirymidyny i na
odwrót; A→C, A →T, G →C, G →T
C→A, C →G, T →A, T →G).
Inne typowe mutacje powstające przy
replikacji to delecje lub insercje
jednego lub kilku nukleotydów.
4) Mutacje jako skutek braku
naprawy replikowanego DNA
Błąd w replikacji powoduje powstanie
niedopasowania nukleotydu
(mismatch), jeśli się on utrwali, powiela
się dalej jako zmieniona ale
komplementarna para nukleotydów.
4) Mutacje jako skutek braku
naprawy replikowanego DNA
Polimeraza DNA działa tak by nie
popelniać błędów. Selekcja
nukleotydów jest imponująco dokładna,
pomyłki wystepuja raz na 10,000
sparowań.
4) Mutacje jako skutek braku
naprawy replikowanego DNA
Jeśli polimeraza DNA się pomyli, to
potrafi sama naprawić swój błąd
ponieważ oprócz aktywności
polimerazy ma też aktywność
egzonukleazy. Gdy wstawi się
poprawny nukleotyd, aktywność
polimerazy wygrywa i kompleks
posuwa się dalej. Gdy powstaje para
niekomplementarna, następuje
powstrzymanie polimeryzacji, co
pozwala zadziałać egzonukleazie i
wyciąć nieodpowiedni nukleotyd. Ta
forma naprawy nazywana jest naprawą
korekcyjną (proofreading). Pomyłki
następują tu zaledwie około raz na
1000.
5) Rodzaje mutacji – zmiany
tautomeryczne
Nie zawsze gdy powstaje substytucja
jest ona skutkiem pomyłki polimerazy
DNA. Niekiedy prawidłowy nukleotyd
przybiera ‘nieprawidłową formę’ (np.
bardziej stabilna forma ketonowa
przechodzi chwilowo w mniej stabilną
formę enolową). Gdy stanie się to w
momencie syntezy, forma enol
przywoła nieprawidłową zasadę
komplementarną. Później powróci
jednak do formy keto i powstanie
niedopasowanie. Powodem niektórych
mutacji jest więc nieuchronne
przeskakiwanie między alternatywnymi
tautomerami zasad azotowych.
5) Rodzaje mutacji – poślizg replikacyjny
Gdy w DNA mamy ciągi powtórzeń, takich jak dwójki CA, polimeraza DNA dość często ślizga
się i dodaje kolejna parę CA. Jest to poślig replikacyjny Wynikiem jest mutacja zmiany fazy
odczytu (frameshift). Zmiana fazy powstaje przy wszelkich insercjach/delecjach nie-trójkowych.
Jest często bardzo szkodliwa, bo po punkcie mutacji pojawiają się nieprawidłowe kodony i
zmienia się pozycja kodonu STOP.
5) Rodzaje mutacji – poślizg replikacyjny
Najprawdopodobniej poślizg replikacyjny jest odpowiedzialny za ekspansję powtórzeń
trójkowych. Nie ma wtedy zmiany fazy odczytu ale powstają białka, które mają zaburzoną
strukturę trzeciorzędową i nieprawidłowo zachowują się w komórce (np. koagulują). Są znane jako
przyczyny wielu chorób genetycznych.
5) Rodzaje mutacji –
mutacje indukowane
chemicznie
Częstym sposobem
wywoływania mutacji jest
użycie analogów
nukleotydów. Na przykład,
bromouracyl jest podobny do
tyminy, może być wstawiony
na jej miejsce i w formie keto
sparowałby się z adeniną.
Jednak, znacznie częściej niż
tymina przechodzi w formę
enol i wtedy paruje się z
guaniną. Powstaje mutacja, bo
wykorzystano zjawisko
tautomerii. (Tego typu
mutacje są losowo
umieszczane w ciągu DNA, to
znaczy, badacz nie potrafi
przewidzieć ich pozycji.)
5) Rodzaje mutacji –
mutacje wywołane
promieniami UV
Ś
wiatło długości 260 nm
powoduje powstanie
podwójnego lub
pojedynczego wiązania
kowalencyjnego pomiędzy
sąsiadującymi (w tej samej
nici) pirymidynami
(najczęściej tyminami),
powstaje dimer tyminowy.
6) Mutacje a funkcje białek
Mutacje mogą prowadzić do
utraty funkcji genu, jej
osłabienia, lub zmiany funkcji
na inną
całkowita utrata
funkcji – null mutation
częściowa utrata funkcji
– leaky mutation
zmiana (nabycie) funkcji
– gain of mutation
6) Mutacje a funkcje białek
Mutacje bywają najbardziej szkodliwe gdy „trafią” w miejsca kodujące centra aktywne enzymów
lub promotor, mniej gdy w mniej ważny obszar egzonów, najmniej gdy w introny, chyba, że
uniemożliwiają wycinanie tych ostatnich
promotor
intron
typ dziki
null – brak funkcji
null – brak funkcji
null – brak funkcji
neutral – funkcja zostaje
null – brak funkcji
leaky – osłabienie
miejsce
aktywne
mutacja
egzon
egzon
7) Naprawa DNA – naprawa bezpośrednia
Naprawa bezpośrednia to np. naprawa pęknięcia (nick) nici DNA przez ligazę (rycina), lub
naprawa struktury nukleotydu, taka jak odcięcie grupy alkilowej, która niekiedy zostaje błędnie
doczepiona do nukleotydu.
7) Naprawa DNA – naprawa z wycinaniem zasady (base excision)
Uszkodzona zasada jest odnajdywana przez glikozylazę DNA i odcinana od cukru. Następnie
cały nukleotyd, ale tylko ten jeden, jest usuwany a potem zapełniany prawidłowym.
7) Naprawa DNA – naprawa z wycinaniem nukleotydów (nucleotide excision)
Gdy uszkodzenie powoduje lokalne zaburzenie struktury helisy, najpierw następuje rozdzielenie
nici (melting) prawdopodobnie przez helikazę. Potem nić zawierająca uszkodzenie jest wycinana
(u eukariontów 24-29 nukleotydów), polimeraza dobudowuje drugą nić, a ligaza włącza ją do
starej nici kowalencyjnie.
7) Naprawa DNA – naprawa poreplikacyjna niedopasowań nukleotydów (mismatch repair)
U bakterii nić rodzicielska jest zmetylowana, a nic potomna przez pewien czas nie. To pozwala
na ich rozróżnienie i wycinanie tylko nowej nici przy natknięciu się na niedopasowanie.
7) Naprawa DNA – naprawa poreplikacyjna niedopasowań nukleotydów (mismatch repair)
U bakterii białko MutS stale
skanuje nić i rozpoznaje
niedopasowania. Przywołuje
MutH, która przyłacza się do
nici niezmetylowanej (nowej).
Ta z kolei przywołuje helikazę i
endonukleazę by usunąć odcinek
nowej nici z niedopasowaniem.
Potem polimeraza i ligaza
kończą naprawę.
U eukariontów jest podobny
system, ale brakuje MutH i
metylowania jako znacznika
starej nici. Kompleks naprawy
niedopasowań jest
prawdopodobnie związany z
kompleksem replikacyjnym i w
ten sposób jest zapewnione
rozróżnianie nici starej i nowej.
7) Naprawa DNA – łączenie końców nie-homologicznych (czyli dowolnych)
Gdy podwójna nić pęknie w
czasie mitozy, część
chromosomu bez centromeru
zostanie utracona. Istnieją
jednak systemy szybkiego
łączenia wolnych końców. U
eukariontów pośredniczy w tym
białko Ku i szereg innych białek.
W ten sposób złączeniu ulec
mogą końce, które niedawno się
przełamały jak i zupełnie nie
niehomologiczne łańcuchy
DNA.
7) Naprawa DNA – bakteryjny system SOS
Gdy w czasie replikacji ‘normalna’
polimeraza DNA III natrafi na zbyt
uszkodzone DNA nie może posuwać
się dalej. Wtedy włączany jest system
SOS, które ma uchronić komórkę
bakterii przed załamaniem się
replikacji jej chromosomu.
Przywoływane są między innymi
białka RecA, które pozwalają na
odłączenie polimerazy III i
umożliwiają pracę polimerazie V. Ta
ostatnia potrafi syntetyzować na
matrycy DNA z uszkodzeniami, choć
skutkuje to wieloma błędami w nowej
nici. Potem RecA i polimeraza V są
zastępowane przez normalną
polimerazę III.
U eukariontów także istnieją takie
‘ratunkowe’ polimerazy pomostowe
(bypass), zdolne do przejścia przez
określone uszkodzenia DNA.
8) Mutacje jako zmiany dużych odcinków DNA
Wyróżniamy delecje, duplikacje, inwersje i translokacje. Mogą powstawać na
skutek pęknięć i ligacji odcinków DNA.
Takie rearanżacje są często powodowane przez rekombinację homologicznych
odcinków DNA rozrzuconych po chromosomie (na przykład odcinki powtarzalne
lub pozostałości prowirusów)
delecja
duplikacja
inwersja
tranlokacja
wzajemna
8) Mutacje jako zmiany dużych odcinków DNA
Częściej są powodowane przez rekombinację homologicznych odcinków DNA
rozrzuconych po chromosomie (na przykład transpozony, prowirusy lub ich pozostałości)
W czasie mejozy zmutowane
chromosomy nie mogą się prawidłowo
ustawić względem swoich
chromosomów homologicznych
- inwersje objawiają się jako
charakterystyczne ”pętle”
- translokacje są widoczne
jako „krzyże”
W ewolucyjnej skali czasu rearanżacje chromosomowe są powszechne
człowiek
mysz
9) Mutacje liczby chromosomów
- euploidalność (zwielokrotnienie kompletu
chromosomów)
- aneuploidność (zwielokrotnienie
niektórych chromosomów)
- drogą do poliploidalności jest często
nieprawidłowa segregacja chromosomów
do gamet
- poliploidyzacja jest częsta
u wielu grup organizmów;
ciekawym przykładem jest
ewolucja pszenicy
(organizm modyfikowany
genetycznie przez tysiące
lat!!!)