Replikacja DNA

Istota procesu:

Jest to proces umożliwiający przekazanie

informacji genetycznej z komórek rodzicielskich

kolejnym pokoleniom.

Proces ten polega na syntezie dwóch,

kompletnych, dwuniciowych helis z jednej

wyjściowej, przy czym obydwie helisy mają

sekwencję nukleotydową identyczną z helisą

wyjściową.

DNA działa jako matryca dla swojej własnej

replikacji. Każdy łańcuch DNA dyktuje

sekwencję nukleotydów łańcucha

komplementarnego.

Replikacja ma charakter

semikonserwatywny. W

czasie podziału każda z

dwóch nici pełni funkcje

matrycy. Nukleotydy są

dołączane zgodnie z regułą

komplementarności zasad.

Powstaje hybryda złożona z

jednej nici starej i jednej

nowej. Każda komórka

zawiera nić starą

(macierzystą) i nową

(potomną), powstałą w

trakcie replikacji DNA

zachodzącej w fazie S

podziału komórkowego.

Substraty replikacji:

• matryca DNA
• trifosforany

deoksyrybonukleoty
dów (dNTP)

• ATP/CTP/GTP-

energia dla helikaz

Enzymy replikacji:

• Helikaza

- rozwijają nici DNA

• Topoizomeraza-

stabilizują odcinki

jednoniciowe

• DNA prymaza

- syntetyzuje startery RNA

• Białka wiążące ssDNA-

zapobiegają zwijaniu

w podwójną nić

• DNA ligaza-

łączy nowosyntetyzowane odcinki

DNA

• DNA polimerazy
• Egzonukleaza-

usuwa startery RNA z nici

Polimerazy replikacji:

• W przypadku E. coli poznano 3 polimerazy.

• Polimeraza I - zawiera jedną podjednostkę,

wykazuje aktywność egzonukleazy zarówno w

kierunku 3’-> 5’ jak i 5’->3’. Jej główną funkcją jest

synteza nici opóźnionej oraz wypełnianie po

starterach RNA

• Polimeraza II- również zawiera jedną

podjednostkę, wykazuje aktywność egzonukleazy w

kierunku 3’->5’, lecz nie w odwrotnym. Ma za

zadanie sprawdzać i naprawiać powstające nici.

• Polimeraza III- składa się na nia ok.. 10

podjednostek, aktywność egzonukleazy ujawnia

jedynie w kierunku 3’->5’, syntetyzuje nić wiodącą.

Polimerazy Eucariota:

• U Eucaryota odkryto 5 polimeraz.

• Polimeraza α-

4 podjednostki, nie ma aktywności

egzonukleazy, synteza nici opóźnionej, wypełnianie po

starterach RNA

• Polimeraza β-

1 podjednostka, również nie wykazuje

aktywności egzonukleazy, pełni funkcje naprawcze

• Polimeraza γ-

2 podjednostki, aktywność

egzonukleazy 3’->5’, synteza mitochondrialnego DNA

• Polimeraza δ-

2 lub 3 podjednostki, aktyowność

egzonukleazy 3’->5’, synteza nici wiodącej

• Polimeraza ε-

1 podjednostka, aktywność

egzonukleazy 3’->5’, pełni funkcje sprawdzające i

naprawcze.

Miejsca działania

enzymów:

Inicjacja replikacji:

• Inicjacja, czyli początek replikacji zachodzi

w ściśle określonych miejscach na nici DNA.
Miejsca te nazywają się "origin" (w skrócie
ori). Zawierają one specyficzne sekwencje,
służące im do:

• wiązania białek inicjatorowych,
• rozdzielenia nici i rozpoczęcia procesu

replikacji,

• przyłączania białek wspomagających proces

replikacji.

Miejsce inicjacji jest bardzo ważne,

ponieważ tylko tu może odbywać się

kontrola replikacji. Raz rozpoczęty proces

musi przebiegać aż do zakończenia

syntezy całego replikonu.

U bakterii replikon obejmuje cały genofor,

znaczy to, że pojedyncze miejsce inicjacji

kontroluje replikację całego genomu.

Organizmy eukariotyczne natomiast, maja

wiele replikonów w każdym chromosomie.

Dzięki tej różnicy szybkość replikacji

genomu eukariota wielokrotnie przewyższa

szybkość replikacji genomu prokariota.

• Rozdzielające się w miejscu syntezy

łańcuchy matrycowego DNA tworzą

tzw. "widełki replikacyjne". O

rozdzieleniu heliksu DNA decydują

białka enzymatyczne zwane

helikazami. Wykorzystują one

energię hydrolizy ATP do zmiany

kształtu swojej cząsteczki (podobnie

jak białka mięśniowe), co umożliwia

im wykonanie pracy mechanicznej.

• Helikazy przesuwają się wzdłuż

dwuniciowego DNA, rozdzielając nici i

poszerzając widełki replikacyjne.

• Najważniejszymi enzymami

odpowiedzialnymi za replikację DNA są
polimerazy DNA. Nie mają one jednak
zdolności do samodzielnego rozpoczęcia
syntezy łańcuchów DNA, mogą jedynie je
wydłużać.

• Synteza DNA zaczyna sie od wbudowywania

starterowych odcinków RNA, które
zakończone są wolną grupą -OH, na końcu 3'.

• Za wbudowywanie tych odcinków

odpowiedzialne są wyspecjalizowane enzymy
zwane prymazami.

Elongacja replikacji:

• Proces elongacji, podobnie jak proces

inicjacji, wymaga udziału wielu białek
enzymatycznych. Oprócz polimeraz DNA,
głównych enzymów replikacji, potrzebnych
jest wiele enzymów odpowiedzialnych za
katalizowanie reakcji analogicznych do
przeprowadzanych podczas inicjacji
replikacji (rozplątywanie i stabilizacja nici,
wbudowywanie starterów). Wszystkie te
białka tworzą kompleks zwany replisomem.

• Polimerazy syntetyzujące

potomne nici DNA nie tylko nie

są zdolne do rozpoczęcia

replikacji, lecz również

przyłączanie przez nie

nukleotydów może się

odbywać wyłącznie do grup

-OH (końca 3') starterów RNA.

• Replikacja DNA przebiega tylko

w jednym kierunku - od 5' do 3'

końca. Odwrotna orientacja nici

w obrębie podwójnego heliksu

pozwala na ciągłą syntezę tylko

jednej nici (tzw. nici wiodącej).

• Druga musi być w postaci

krótkich fragmentów,

dołączonych do odcinków

starterowych (jest to tzw. nić

opóźniona).

• Fragmenty te nazwano, na

cześć odkrywcy, fragmentami

Okazaki.

• Wytworzenie wiązania estrowego między

resztą fosforanową a deoksyrybozą,
katalizowane przez polimerazy, wymaga
dostarczenia energii. Jak w większości syntez
komórkowych, tak i tu energia pochodzi z
wysokoenergetycznych wiązań między
resztami kwasu fosforowego. Cząsteczka DNA
jest zbudowana z monofosfonukleotydów.

• Substratami do syntezy nowej nici w procesie

replikacji są trifosfonukleotydy (ATP, CTP,
GTP, TTP), więc dołączenie jednego
nukleotydu wiąże się z rozerwaniem dwóch
wiązań wysokoenergetycznych.

Ligazy

Ich zadaniem jest łączenie fragmentów
Okazaki (juz po wycięciu starterów przez
polimerazę) w jedna długa nic. Ligazy
bakteryjne wymagają NAD+ jako
koenzymu i źródła energii, natomiast
ligazy eukariotyczne wykorzystują do tego
celu ATP.

Terminacja replikacji:

• Terminacja jest końcowym etapem replikacji,

w którym dochodzi do połączenia DNA w

kompletne chromosomy i rozdzielenia ich

pomiędzy komórki potomne. Mechanizmy

terminacji u prokaroiota i eukariota znacznie

różnią się od siebie.

• U organizmów prokariotycznych, gdzie na

kolistym genoforze znajduje się tylko jeden

replikon, za końcowy etap replikacji

odpowiadają 4 sekwencje nukleotydowe ,

wiążące się z białkiem terminacyjnym. Białko

to będąc inhibitorem replikacji, hamuje cały

proces.

Terminacja u eucariota:

• Występowanie kilku replikonów w replikującym się

chromosomie powoduje, że do zakończenia

replikacji wystarczy fizyczne zetknięcie się dwóch

podążających ku sobie w przeciwnych kierunkach

widełek replikacyjnych.

• Nie potrzeba tu specjalnych sekwencji

terminalnych.

• Odmiennie przedstawia się sytuacja z

zakończeniem syntezy chromosomów. W

przeciwieństwie do kolistych genoforów

bakteryjnych, chromosomy eukariotyczne

zbudowane są z liniowych cząsteczek DNA.

• Gdyby replikacja u organizmów

eukariotycznych kończyła sie analogicznie do

prokariota to ostatni kilkunukleotydowy

fragment pozostawałby „niedoreplikowany”.

• Na końcu każdego chromosomu istnieją

jednak charakterystyczne sekwencje, które

pozwalają na utrzymanie niezmiennej

długości genomów. Sekwencje te zwane są

telomerami. Telomery odpowiadają również za

ochronę DNA przed łączeniem się z innymi

chromosomami.

Telomery:

Są one kompleksami nukleoproteinowymi.

Telomerowe DNA składa się z krótkich

tandemowych powtórzeń, bogatych w GT.
Telomery u człowieka mają długość ok. 25 kb

(dla porównania u myszy 40-80kb) i

zbudowane są z powtarzających się

fragmentów heksanulkeotydowych 5'-

TTAGGG-3'.
DNA budujące telomery jest na przeważającej

długości dwuniciowe, a ich koniec 3' ma

strukturę jednoniciową i jest bogaty w reszty

guaninowe, które tworzą strukturę

przestrzenną zwaną kwartetem G.

Replikacja telomerów

zachodzi w sposób

odmienny od reszty

chromosomu. Odpowiada

za nie specjalny enzym

zwany telomeraza. Jest

to enzym, który w swoim

centrum aktywnym

zawiera matrycę do

syntezy telomerów -

cząsteczkę RNA.

Starterami w tym

procesie są końcowe

sekwencje telomeru

pozostałego z

poprzedniego cyklu

replikacyjnego.

Naprawa uszkodzonego

DNA

• Naprawa niesparowanych zasad –

typu mismatch

• Naprawa przez wycięcie zasady
• Naprawa przez wycięcie nukleotydu
• Naprawa uszkodzenia dwuniciowego