2011/2012
Agnieszka Sapa
Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej
Strona 1 z 5
Chemia kliniczna
Dla studentów IV roku Analityki Medycznej
Wdrażanie metody analitycznej
Kalibracja analizy
Agnieszka Sapa
Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej
Chemia kliniczna
dla studentów IV roku Analityki Medycznej
Rodzaje metod:
Jakościowe – wynik typu „dodatni” „ujemny”
Półilościowe – skala nasilenia reakcji np. na 2+, 3+
Ilościowe – wynik w postaci liczby przedstawiającej stężenie,
aktywnośd
Rodzaje metod ilościowych
rutynowa
referencyjna
definitywna
Nowa
metoda –
dlaczego?
Wybór metody
– jakie
kryteria?
Ustalenie
pożądanej
jakości metody –
wybór TEA
Kalibracja analizy
Walidacja metody
Formuła
wyniku
Wartości
decyzyjne/
przedziały
referencyjne
Sposób
kontroli
jakości
Nareszcie -
wydajemy
wyniki!
Bieżąca kontrola i
dokumentacja
metody
Wdrażanie metody
Wynik
badania
Błąd dopuszczalny wyniku
– TEA (ang. Total Error Allowable)
Tradycyjnie: jest to możliwa do zaakceptowania różnica
pomiędzy uzyskanym wynikiem a wartością rzeczywistą
wielkości mierzonej.
Określa pożądaną jakośd analityczną metody
Jeśli nasze błędy pomiarowe go nie przekraczają –
uznajemy, że nasze wyniki są wiarygodne
Dla każdego parametru/każdej metody może byd inny!
Wyznaczanie błędu dopuszczalnego:
Reguła Tonks’a (1963 r.)
Obliczanie na podstawie współczynników zmienności
biologicznej
Analiza opinii klinicystów
Publikowane zalecenia ekspertów krajowych lub
międzynarodowych w zakresie diagnostyki lab. (np. NACB,
IFCC, CLIA) lub konkretnych dziedzin klinicznych (np. NCEP,
ESC, PTD)
Określony przez obowiązujące przepisy
W oparciu o wyniki międzylaboratoryjnej oceny jakości
(COBJwDL, PPZOJMED)
Wartości wynikające z aktualnych możliwości technicznych
tzw. state of the art
Reguła Tonks’a
TEA =
x 100 %
Problem pojęcia „norma”
Można stosowad modyfikacje (np. 1/8, 1/10)
Obecnie stosowana rzadko
¼ zakresu normy
średnia z zakresu normy
2011/2012
Agnieszka Sapa
Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej
Strona 2 z 5
Chemia kliniczna
Dla studentów IV roku Analityki Medycznej
Kryterium zmienności biologicznej
Dopuszczalna nieprecyzyjnośd
I
A
0,5 CV
w
Dopuszczalne obciążenie
B
A
0,25
CV
2
g
+ CV
2
g
CV
w
within-subject biologic variation – wsp. zmienności dla zmienności
biologicznej wewnątrzosobniczej – dane z fachowego piśmiennictwa
CV
g
between-subject biologic variation – wsp. zmienności dla zmienności
biologicznej międzyosobniczej – dane z fachowego piśmiennictwa
Na TEA składa się dopuszczalna nieprecyzyjnośd i dopuszczalne
obciążenie
Polecam: http://www.westgard.com/biodatabase1.htm
Kto dokonuje wyboru TEA?
W Polsce – kierownik laboratorium lub wyznaczona przez
niego osoba odpowiedzialna za sprawy jakości
W innych krajach np. USA, Niemcy – ustalany
zewnętrznie, przez upoważnione organizacje.
Jakie są skutki przyjęcie zbyt małego/dużego TEA?
Możliwośd modyfikacji
Magiczne słowo – walidacja
według PN-EN ISO/IEC 17025:
„walidację definiuje się jako potwierdzenie, przez
zbadanie i przedstawienie obiektywnego dowodu, że
zostały spełnione szczególne wymagania dotyczące
konkretnie zamierzonego zastosowania”
Wymagania dot. walidacji zawarte w normach
technicznych dla laboratoriów:
PN-EN ISO/IEC 17025
PN/EN ISO 15189 – szczególne wymagania dla laboratoriów
medycznych
„kompromis między kosztami, ryzykiem
i możliwościami technicznymi”
Walidacja obejmuje więc:
Specyfikację wymagao stawianych metodzie
Określenie jej cech charakterystycznych
Sprawdzenie, czy wymagania mogą zostad spełnione
Stwierdzenie o przydatności metody
Dotyczy nie tylko samej metody!
Również pobierania, transportu i przygotowania próbek
W toku walidacji określa się:
Zakres roboczy
Liniowośd
Czułośd
Granicę detekcji (wykrywalności) i granicę oznaczenia
ilościowego
Selektywnośd/specyficznośd, podatnośd na interferencje
Precyzję (powtarzalnośd, odtwarzalnośd, warunki
pośrednie)
Poprawnośd i obciążenie
Dokładnośd (jako niepewnośd pomiaru)
Oraz dodatkowo – koszt i czas badania
Charakterystyka procedur badawczych
Cel badania
Zasada metody
Rodzaj materiału badanego i wpływ czynników
przedanalitycznych
Wymagane wyposażenie i odczynniki
Procedury kalibracyjne (z określoną spójnością pomiarową)
Procedury kontroli jakości
Interferencje, reakcje krzyżowe
Przedział referencyjny/wartości decyzyjne
Interpretacja wyników
Na podstawie PN/EN ISO 15189
2011/2012
Agnieszka Sapa
Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej
Strona 3 z 5
Chemia kliniczna
Dla studentów IV roku Analityki Medycznej
Cechy metody:
Wykrywalnośd
Czułośd
Selektywnośd/Specyficznośd
Podatnośd na interferencje
Liniowośd
Precyzja
Poprawnośd
Czułośd
Najmniejsza ilośd substancji jaką można oznaczyd daną
metodą
Najmniejsza różnica stężeo jaką można wykryd daną
metodą
Wykrywalnośd
Najmniejsza ilośd substancji jaką można wykryd daną
metodą
Selektywnośd/specyficznośd
Zdolnośd metody do wykrywania tylko jednej określonej
substancji w złożonej mieszaninie bez zakłóceo ze strony
innych składników mieszaniny
Metoda idealnie selektywna oznaczania danego składnika
jest metodą specyficzną
Podatnośd na interferencje
Lipemia (surowica lipemiczna)
Hemoliza
Bilirubina (surowica ikteryczna)
Inne
Liniowośd metody
Jest to zakres stężeo, w którym jest spełnione prawo
Lamberta-Beera
W skrócie: absorbancja roztworu substancji zależy
wprostproporcjonalnie od jej stężenia (stężenia barwnego
produktu reakcji)
Wyrażona współczynnikiem korelacji, który nie powinien
byd mniejszy niż 0.999
Kalibracja analizy
Wzorzec – ważny punkt kalibracji analizy
Rodzaje wzorców:
Wzorzec chemiczny
Wzorzec kliniczny I-go rodzaju
Wzorzec kliniczny II-go rodzaju
Kalibrator – materiał przenoszący dokładnośd
Od prawidłowego wzorca zależy:
Stabilnośd kalibracji wewnątrz laboratorium
Poprawny punkt wyjścia do wdrożenia metody
Jednolitośd kalibracji między laboratoriami
Wzorzec (materiał referencyjny)
– element standaryzacji
2011/2012
Agnieszka Sapa
Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej
Strona 4 z 5
Chemia kliniczna
Dla studentów IV roku Analityki Medycznej
Wykres kalibracyjny
Sporządzenie roztworów wzorcowych obejmujących zakres
stężeo spodziewanych w materiale biologicznym.
Przeprowadzenie reakcji zgodnie z procedurą metody w
dwóch albo trzech powtórzeniach dla każdego stężenia
wzorca.
Wykreślenie natężenia sygnału (absorbancja, fluorescencja
itp.) w funkcji stężenia wzorca w układzie współrzędnych.
Absorbancja y
y
1
x
1
x
Stężenie
b
y = ax + b
a = tg α
b – wyraz wolny
Obliczanie równania prostej regresji
Prostą regresji wyznacza się najczęściej metodą
najmniejszych kwadratów.
Aby określid stopieo powiązania dwóch zmiennych
oblicza się współczynnik korelacji (r), określa on siłę
(wartośd r) i kierunek związku (+/–) i może
przyjmowad wartości od –1 do 1.
Typy krzywych wzorcowych
Ustalenie typu krzywej jest istotne
Częstośd wykonywania ponownej kalibracji zależy od tego,
czy krzywa jest powtarzalna, czy niepowtarzalna
W metodach automatycznych często korzysta się z
zaleceo producenta*
* Producent chce przede wszystkim jak najwięcej zarobid – wskazany jest
zdrowy rozsądek i rzetelna wiedza diagnosty laboratoryjnego
Krzywa powtarzalna
Jeśli na etapie wdrażania metody ustalimy, że krzywa
jest powtarzalna, kolejne kalibracje będą
wykonywane tylko w przypadku awarii metody, o ile
analiza przyczyn złych wyników w materiałach
kontrolnych nasunie nam podejrzenie, że problemem
jest kalibracja
Kalibrację powinno się wykonywad jak najrzadziej
Krzywa niepowtarzalna
Kalibracja metody jest konieczna w każdym postępowaniu
analitycznym (w każdej serii pomiarowej)
Od kształtu krzywej zależy liczba punktów ponownej
kalibracji
Prostoliniowa – zwykle 1 punkt (często w metodach
manualnych)
Nieprostoliniowa – wielopunktowa (np. ELISA)
2011/2012
Agnieszka Sapa
Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej
Strona 5 z 5
Chemia kliniczna
Dla studentów IV roku Analityki Medycznej
Typy krzywych wzorcowych
Krzywa prostoliniowa:
powtarzalna,
niepowtarzalna
Krzywa nieprostoliniowa:
powtarzalna,
niepowtarzalna
Zadanie na dziś – objętośd koocowa 1000 µl
Stężenie roztworu
wzorcowego
[mg/dl]
Objętośd wzorca o stężeniu
500 mg/dl
[μl]
Objętośd wody
[μl]
A teraz coś gratis…
Podstawowe zasady pracy z pipetami
automatycznymi
Nie wolno pobierad cieczy bez założonej koocówki
Należy zawsze sprawdzid, czy koocówka jest dobrze
nałożona
Nie wolno odwracad pipety z mokrą koocówką!!!
Naciąganie cieczy do koocówki – trzymamy pipetę
pionowo
Wydawanie cieczy z koocówki – trzymamy pipetę
pionowo, probówkę pod kątem ok. 45
Podczas pobierania nie powinno się zanurzad koocówki w
cieczy głębiej niż na ok. 3-5 mm
Nie wolno gwałtownie puszczad tłoka – ciecz może
przedostad się do trzonu pipety i ją uszkodzid
Nie powinno się pipetowad odczynników „prosto z
lodówki”, z pewnymi wyjątkami (np. biologia molekularna,
małe objętości, odczynniki wrażliwe na temperaturę)
Pobieranie i wydawanie cieczy z pipety powinno trwad kilka
sekund, szczególnie przy pipetowaniu większych objętości
Okresowy przegląd, konserwacja i kalibracja pipet
– personel fachowy
Sposoby pipetowania
I – wciskamy tłok pipety do pierwszego oporu, pobieramy
ciecz, wydajemy do drugiego oporu
II – pipetowanie cieczy bardzo lepkich, pieniących się –
wciskamy tłok pipety do drugiego oporu, pobieramy ciecz,
wydajemy do pierwszego oporu