432

www.postepybiochemii.pl

Antonina

Chmura-Skirlińska

1,

Ryszard J. Gurbiel

1,2

1

Pracownia Spektroskopii EPR, Ja-

giellońskie

Centrum

Rozwoju

Le-

ków, Uniwersytet Jagielloński, Kraków

2

Zakład Biofizyki Molekularnej, Wydział Bio-

chemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet

Jagielloński, Kraków



Pracownia Spektroskopii EPR, Jagiellońskie

Centrum Rozwoju Leków, Uniwersytet

Jagielloński, ul. Bobrzyńskiego 14, 30-348

Kraków; tel.: [phone], e-mail: antonina.

[e-mail]

Artykuł otrzymano 21 września 2013 r.

Artykuł zaakceptowano 31 października

2013 r.

Słowa kluczowe: tlenek azotu, NO-Hb, EPR,

pułapkowanie spinowe, chemiluminescencja,

azotany

Wykaz skrótów: NO — tlenek azotu; EPR

— elektronowy rezonans paramagnetyczny;

ROS — reaktywne formy tlenu; DETC — kwas

dietyloditiokarbamowy; MGD — N-metylo-

d

-

-glukaminowa pochodna kwasu dietyloditio-

karbamowego

Podziękowania: This study was supported

by European Union from the resources of the

European Regional Development Fund under

the Innovative Economy Programme (grant

coordinated by JCET-UJ, No POIG.01.01.02-00-

069/09) as well as the Polish Ministry of Sci-

ence and Higher Education (grant No. N N401

039637).

Wykrywanie tlenku azotu i jego pochodnych w komórkach śródbłonka i tkankach

STRESZCZENIE

P

rawidłowo działający śródbłonek produkuje odpowiednią ilość tlenku azotu (II) i innych

mediatorów, koniecznych do utrzymania homeostazy całego organizmu. Ze względu na

silną zależność pomiędzy stężeniem NO, a stanem fizjologicznym całego organizmu moni-

torowanie stężenia tlenku azotu ma niezwykle istotne znaczenie dla lepszego poznania me-

chanizmów prowadzących do różnorodnych stanów patologicznych towarzyszących powsta-

waniu wielu chorób. Spośród wielu metod oznaczania stężenia NO na szczególną uwagę

zasługują te, które umożliwiają pomiar stężenia wolnych rodników lub adduktów rodników

z innymi stabilizującymi je cząstkami, bądź pozwalają na pomiar bezpośrednich produktów

utleniania lub redukcji rodników. Taką metodą jest na przykład spektroskopia elektrono-

wego rezonansu paramagnetycznego (EPR), która pozwala na bezpośrednią rejestrację sy-

gnałów wolnych rodników jak również trwałych adduktów rodników z pułapką spinową.

Aby uzyskać pełniejszy obraz procesów, w których bierze udział tlenek azotu wskazane jest

aby wyniki uzyskane metodą EPR wzbogacić o wyniki uzyskane innymi metodami. Ponadto

biorąc pod uwagę, że stężenie tlenku azotu(II) zależy od stężenia reaktywnych form tlenu,

a główną przyczyną spadku aktywności biologicznej NO jest zwiększona produkcja RFT,

zwłaszcza anionu ponadtlenkowego (O2-) wykorzystanie technik pozwalających na detekcję

RFT pozwala na lepsze zrozumienie procesów, w których bierze udział NO.

WPROWADZENIE — TLENEK AZOTU I REAKTYWNE

FORMY TLENU W UKŁADACH BIOLOGICZNYCH

W zdrowym organizmie tlenek azotu(II) jest produkowany w ilościach ko-

niecznych do prawidłowego funkcjonowania, a zaburzenia jego produkcji i me-

tabolizmu mogą prowadzić do wielu stanów patologicznych.

Prawidłowo działający śródbłonek produkuje odpowiednią ilość tlenku

azotu(II) i innych mediatorów koniecznych do utrzymania homeostazy całe-

go organizmu. Jedną z głównych przyczyn spadku aktywności biologicznej

NO jest zwiększona produkcja reaktywnych form tlenu (RFT), a zwłaszcza

anionu ponadtlenkowego (O

2

˙

-

), co powoduje zwiększone powstawanie nad-

tlenoazotynu (ONOO

–

) (Ryc. 1). Ze względu na silną zależność pomiędzy

stężeniem NO a stanem fizjologicznym całego organizmu, znajomość stęże-

nia NO i RFT ma niezwykle istotne znaczenie dla lepszego poznania mecha-

nizmów prowadzących do różnorodnych stanów patologicznych towarzy-

szących powstawaniu wielu chorób. Z tego też powodu trwają intensywne

prace mające na celu wykrycie schorzeń, którym towarzyszy zaburzenie pro-

dukcji tlenku azotu(II). Z uwagi na fakt, że wolne rodniki charakteryzują

się dużą reaktywnością i w konsekwencji krótkim czasem życia w układach

biologicznych bezpośredni pomiar stężenia zarówno NO jak i RFT, a także

poznanie mechanizmów reakcji, w których zaangażowane są te cząsteczki

natrafia na wiele trudności.

Rycina 1. Wzajemna konwersja form oksydo-redukcyjnych tlenku azotu w układach biologicznych. Reakcje

związane z przeniesieniem elektronu pomiędzy tlenkiem azotu a metaloproteinami, kompleksami metali

przejściowych i tiolami mogą prowadzić do powstawania jonów NO

–

i NO

+

(na podstawie [11,22-24].

Postępy Biochemii 59 (4) 2013

433

Na szczególną uwagę zasługują techniki, które po-

magają ominąć te problemy i pozwalają na bezpośred-

ni pomiar stężenia rodników przy wykorzystaniu sub-

stancji, które tworzą trwałe kompleksy z rodnikami, w

ten sposób wydłużając czas ich życia, bądź pozwalają

na pomiar bezpośrednich produktów utleniania lub

redukcji rodników. Jedną z takich technik jest metoda

elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR),

która pozwala na bezpośredni pomiar sygnałów

pochodzących od wolnych rodników lub rejestrację widm

trwałych adduktów rodników z pułapką spinową. Wyż-

szość techniki EPR nad innymi metodami bezpośrednimi

(np. metodami chemiluminescencji) polega na wysokiej

selektywności i wybiórczości w stosunku do NO czy O

2

˙

–

.

Warto również wspomnieć o innych, komplementarnych

metodach pomiaru, opartych między innymi na chemi-

luminescencji, spektroskopii UV-Vis, elektrochemii czy

fluorescencji, które bardzo często są wykorzystywane do

potwierdzenia wyników uzyskanych techniką EPR lub

dostarczają dodatkowych informacji na temat kinetyki

reakcji rodnikowej lub lokalizacji powstawania RFT.

FIZJOLOGICZNA ROLA TLENKU AZOTU(II)

Biologiczna funkcja tlenku azotu i jego form oksydacyj-

no-redukcyjnych ściśle zależy od zdolności oddziaływania

z różnymi biocząsteczkami. Bardzo mały rozmiar i obojętny

ładunek elektryczny tej cząsteczki pozwala na swobodne

przenikanie przez błony biologiczne. NO reguluje aktyw-

ność wielu białek [1-5] poprzez odwracalną koordynację do

jonów metali (Cu, Fe, Co, Mo) w centrach enzymów [3,5-11]

lub oddziaływanie z grupami tiolowymi [1,2].

Tlenek azotu jest termodynamicznie nietrwały i już w

temperaturze 30–50°C, pod podwyższonym ciśnieniem

łatwo ulega rozkładowi głównie do N

2

O i NO

2

oraz ślado-

wych ilości N

2

, O

2

i N

2

O

3

[12,13]. W roztworze wodnym po-

wstały NO

2

natychmiast reaguje z NO prowadząc do utwo-

rzenia jonów azotanowych(III):

NO + NO

2

→ N

2

O

3

N

2

O

3

+ H

2

O → 2HNO

2

Utlenianie tlenku azotu(II) tlenem cząsteczkowym jest

wielostopniowym procesem składającym się z względnie

wolnych reakcji. W przeciwieństwie do tego reakcja pomię-

dzy tlenkiem azotu a anionem ponadtlenkowym jest bar-

dzo szybka i prowadzi do utworzenia nadtlenoazotanu(III),

ONOO

–

, który z kolei ulega reakcjom homolizy prowadzą-

cym do utworzenia rodników

•

NO

2

,

•

OH [11,14-16].

Ze względu na to, że atom azotu w tlenku azotu(II)

występuje na drugim stopniu utlenienia, NO wykazuje

właściwości redukujące (antyutleniacz), a jego charakter

wolnorodnikowy powoduje, że jest on bardzo skutecz-

nym i szybkim zmiataczem wolnych rodników. Reaguje

on z wieloma wysoce szkodliwymi dla organizmów ży-

wych utleniaczami takimi jak nadtlenek wodoru, nad-

tlenki alkilowe, anionorodnik ponadtlenkowy i nadtlen-

kowe pochodne lipidów.

W przypadku stresu oksydacyjnego, w którym po-

wstaje nadtlenoazotan(III), tlenek azotu pełni rolę

ochronną. Z drugiej jednak strony, wysokiemu stężeniu

ONOO

–

przypisuje się odpowiedzialność za cytotoksycz-

ność tlenku azotu(II) [4,17]. Może on indukować proce-

sy dwuelektronowego utleniania, działając w ten sposób

na pierścień aromatyczny tokoferolu i innych ważnych

antyutleniaczy. W obecności tioli małocząsteczkowych i

tioli związanych z białkami, uważanych za główne zmia-

tacze ONOO

–

, powstają rodniki tiolowe (RS

•

) i S-nitrozo-

tiole (RSNO). Białka zawierające metale lub selen rów-

nież stanowią ochronę przeciwko nadtlenoazotanom(III)

[11,18,19].

Wysoka aktywność biologiczna i reaktywność chemiczna

tlenku azotu wynika stąd, że nie tylko forma rodnikowa,

ale także jego forma zredukowana i utleniona są zaangażo-

wane w procesy biochemiczne [14,18,20-23]. Reakcje zwią-

zane z przeniesieniem elektronu pomiędzy tlenkiem azotu

a metaloproteinami, kompleksami metali przejściowych i

tiolami mogą prowadzić do powstawania jonów NO

–

i NO

+

[11,23-25].

NATURALNE PUŁAPKI SPINOWE

Obecne głównie w osoczu S-nitrozotiole, a szczególnie

S-nitrozoproteiny są przykładem cząsteczek odpowiedzial-

nych za transport tlenku azotu. Tlenek azotu związany w

cząsteczce S-nitrozotiolu nie reaguje z O

2

i O

2

˙

-

, co ogranicza

powstawanie toksycznych produktów utleniania NO. Tiole

reagując ze związkami, które są źródłem NO

+

, tworzą S-ni-

trozotiole, które z kolei poprzez homolityczny rozpad wią-

zania S–N przekształcają się w rodnikowe formy NO

•

i RS

•

:

RSNO

RS• + NO•

S-nitrozotiole ulegają atakowi nukleofilowemu na grupę

nitrozylową. Jeżeli nukleofilem jest tiol lub anion RS

–

może

to prowadzić albo do przeniesienia jonu NO

+

pomiędzy

dwoma fragmentami S-nukleofilowymi, albo do utworze-

nia RSNO

•–

, który jest źródłem form NO

–

lub N

2

O [11,25].

WYKORZYSTANIE TECHNIKI EPR

DO POMIARU NO I RFT

Przedmiotem badań metodą EPR są substancje zawie-

rające nieskompensowany spin elektronowy, takie jak

wolne rodniki, jony metali przejściowych, kompleksy z

silnym przeniesieniem ładunku, O

2

, NO, znaczniki spi-

nowe czy pułapki spinowe. Metoda EPR charakteryzuje

się wysoką czułością pozwalającą na rejestrację sygnałów

pochodzących od mikromolowych stężeń centrów para-

magnetycznych. Metody rezonansu paramagnetycznego

pozwalają nie tylko na stwierdzenie obecności centrum

paramagnetycznego i jego identyfikację, ale również na

uzyskanie informacji na temat bezpośredniego otocze-

nia centrum paramagnetycznego, określenie geometrii

centrum, liczby i typu ligandów, odległości od innych

centrów paramagnetycznych i innych parametrów opi-

sujących procesy dynamiczne zachodzące w cząsteczce

(ruchliwość, procesy relaksacji itp.).

434

www.postepybiochemii.pl

Rejestracja sygnałów EPR pochodzących od wolnych

rodników tlenowych, w tym tlenku azotu, możliwa jest

dzięki zastosowaniu/wykorzystaniu pułapek spinowych:

egzogennych lub enendogennych. Wart pokreślenia jest

fakt, że spektroskopia EPR pozwala na bezpośredni pomiar

nie tylko tlenku azotu, ale również anionów ponadtlenko-

wych i innych wolnych rodników tlenowych i azotowych

wytwarzanych przez tkanki biologiczne.

PUŁAPKI ENDOGENNE

Badania z wykorzystaniem endogennych pułapek spino-

wych polegają na mierzeniu widm trwałych kompleksów

NO występujących w tkankach lub komórkach. Do takiej

grupy związków należą między innymi endogenne białka

zawierające żelazo zarówno hemoproteiny jak i białka za-

wierające żelazo niehemowe.

Jedną z bardzo często używanych metod do oznaczania

stężenia NO w żywym organizmie jest pomiar widm kom-

pleksów hemoglobina-NO. Pomiar taki przeprowadza się

w zamrożonych próbkach krwi i erytrocytów. Tlenek azo-

tu łączy się z żelazem hemowym, w wyniku czego tworzą

się trwałe pięcio- lub sześciokoordynacyjne kompleksy.

Addukty spinowe tlenku azotu dają charakterystyczne sy-

gnały ERP, tzw. „sygnały trypletowe” (Ryc. 2). Dzięki temu

pomiar charakteryzuje się dużą selektywnością [26-28].

Amplituda sygnału EPR (g = 2,035; AN = 12,6 Gs) jest pro-

porcjonalna do stężenia kompleksu Hb-NO. Hemoglobinę

można również wykorzystać jako nietoksyczną pułapkę do

detekcji NO wydzielonego w hodowlach komórkowych lub

w izolowanych tkankach.

Inną grupą stabilnych kompleksów NO są di-

nitrozylowe kompleksy żelaza, DNIC. Do rodzi-

ny tej należą kompleksy o strukturze tetraedru

[(RS)

x

Fe(NO)

4-x

]

−

, gdzie x=2 lub 3. Najbardziej znany przed-

stawiciel tej rodziny [(RS)

2

Fe(NO)

2

]

−

jest odpowiedzialny za

transport i magazynowanie NO w układach biologicznych

[29]. Jego reaktywność chemiczna i zmiany spektralne zo-

stały dokładnie opisane w literaturze [29-36]. Należy on do

dużej grupy kompleksów o wzorze ogólnym [FeL

2

(NO)

2

]

−

.

Wszystkie kompleksy [FeL

2

(NO)

2

]

−

są paramagnetyczne, a

widmo EPR (Ryc. 3) praktycznie nie zależy od struktury

ligandów i jest charakterystyczne dla tej grupy związków

[37-39].

W układach biologicznych ligandami tworzącymi DNIC

mogą być zarówno małe cząsteczki takie jak glutation czy

cysteina, jak i białka o dużej masie cząsteczkowej, zawie-

rające żelazo hemowe lub niehemowe centra żelazowo-

-siarkowe. Sygnał EPR (g=2,03) jest typowy dla całej grupy

DNIC, w których żelazo(I) tworzy trwałe dwurdzeniowe

kompleksy Fe-S z NO bez względu na rodzaj liganda. Sy-

gnał taki można zarejestrować zarówno w komórkach jak

i tkankach, i jego tworzenie jest związane ze wzrostem wy-

twarzania NO i obecnością wolnego żelaza [11,40].

Kompleks [Fe(SR)

2

(NO)

2

]

−

może także przekazywać NO

innym cząsteczkom np. tiolom. W wyniku takiej reakcji po-

wstają S-nitrozotiole:

[Fe(SR)

2

(NO)

2

]

−

+ R’SH → R’S-NO + produkt rozkładu

Reakcja ta została opisana dla układu gdzie RS to L-cyste-

ina lub GSH (glutation), a R’S to albumina [29,34]. Przykład

ten pokazuje znaczącą rolę kompleksu [Fe(SR)

2

(NO)

2

]

−

w

transporcie i magazynowaniu NO in vivo [11].

PUŁAPKI EGZOGENNE

Pomiar NO może też być prowadzony przy wykorzy-

stanu pułapek spinowych. Zastosowanie techniki pułap-

kowania spinowego, polega na rejestracji widm EPR pa-

ramagnetycznych adduktów spinowych powstających w

specyficznej reakcji pułapki z wolnym rodnikiem NO, przy

czym sama pułapka nie daje sygnału EPR. Do grupy jed-

nych z najbardziej popularnych pułapek stosowanych do

Rycina 2. Charakterystyczny sygnał trypletowy kompleksu hemoglobina-NO

(Hb-NO), zmierzony w erytrocytach uzyskanych z krwi dwumiesięcznych my-

szy ApoE/LDLR knock-out. Sygnał zmierzono w temperaturze 77 K. Amplituda

sygnału jest proporcjonalna do stężenia kompleksu Hb-NO. Widmo wykonano

w Pracowni EPR JCET.

Rycina 3. Widmo EPR charakterystyczne dla grupy dinitrozylowych komplek-

sów żelaza DNIC – stabilnych kompleksów tlenku azotu(II), żelaza i siarki [Fe-

L

2

(NO)

2

]

−

odpowiedzialnych za transport i magazynowanie NO w układach bio-

logicznych. Widmo zmierzono w temperaturze 77 K (na podstawie [44]).

Postępy Biochemii 59 (4) 2013

435

oznaczania NO należą syntetyczne pochodne kwasu karba-

mowego. Można do nich zaliczyć rozpuszczalne kompleksy

(DETC, PDTC) oraz formy nierozpuszczalne (MGD, DTCS,

ProDTC, MSD) [41].

Jednym z pierwszych wykorzystywanych i wciąż po-

wszechnie stosowanych związków jest DETC. Pomiary z

wykorzystaniem kompleksu Fe-DETC prowadzone są w

zamrożonych próbkach, w temperaturze 77K. W celu uzy-

skania aktywnego kompleksu Fe-DETC należy zmieszać

odpowiednią ilość kwasu dietyloditiokarbamowego roz-

puszczonego w odtlenowanym buforze PBS z odpowied-

nią ilością soli żelaza(II) rozpuszczonej w odtlenowanej

soli fizjologicznej. Tak uzyskany hydrofobowy kompleks

jest dodawany do komórek i tam łączy się z wydzielonym

tlenkiem azotu. Utworzony w ten sposób kompleks mono-

nitrozylowy ma właściwości paramagnetyczne, a jego wid-

mo może być rejestrowane techniką EPR (Ryc. 4). Ponieważ

sam kompleks jest hydrofobowy, przeprowadzenie syntezy

w roztworze wodnym prowadzi do utworzenia zawiesiny,

co często jest uważane za wadę tej metody. Co prawda moż-

na go rozpuścić w rozpuszczalnikach niepolarnych i w ten

sposób podać do komórek lub tkanek, ale o wiele bardziej

popularne jest wykorzystanie tego kompleksu do pomiaru

stężenia NO in vivo. W takim przypadku DETC rozpusz-

czony w soli fizjologicznej jest podawany dootrzewnowo,

a roztwór Fe(II) jest podawany podskórnie. Formowanie ni-

trozylowego kompleksu Fe-DETC następuje bezpośrednio

w tkankach i pomiar jest możliwy poprzez przygotowanie

próbek z zamrożonych tkanek. Metodę tę można wykorzy-

stać do monitorowania stężenia NO w różnych tkankach

oraz do określania lokalizacji tych miejsc, w których stęże-

nie tlenku azotu odbiega od przyjętej normy.

Alternatywą dla hydrofobowego kompleksu Fe-DETC

jest równie popularny Fe-MGD, hydrofilowy kompleks że-

laza (II) i N-metylo-

d

-glukaminowej pochodnej DETC. Fe-

-MGD jest pułapką stosowaną do badań w temperaturze

fizjologicznej. Bardzo dobra rozpuszczalność tego komplek-

su pozwala na łatwe uzyskanie jego rozpuszczalnej formy

w roztworze wodnym, poprzez zmieszanie odpowiedniej

ilości soli MGD rozpuszczonej w odtlenowanym buforze

PBS z odpowiednią ilością soli żelaza(II) rozpuszczonego w

odtlenowanej soli fizjologicznej. Istnieją

liczne prace poka-

zujące wykorzystanie tej pułapki w obecności komórek jak

i w tkankach, ale również w izolowanych, perfundowanych

narządach.

WYKORZYSTANIE CYKLICZNYCH HYDROKSYLOAMIN

DO DETEKCJI REAKTYWNYCH FORM TLENU

Tak jak wspomniano na wstępie, stężenie tlenku azotu-

(II) w dużym stopniu zależy od stężenia reaktywnych

form

tlenu, a główną przyczyną spadku aktywności biologicznej

NO jest zwiększona produkcja RFT, zwłaszcza anionu

ponadtlenkowego (O

2

˙

–

). Istnieje bardzo wiele związków,

które mogą potencjalnie być wykorzystane jako pułapki

spinowe do oznaczania RFT. Niektóre z nich, takie jak np.

DMPO, umożliwiają selektywne oznaczanie stężenie O

2

˙

–

.

Uzyskanie informacji na temat stężenia RFT może być ko-

nieczne do zrozumienia przyczyn zmian stężenia NO.

Jedna z metod pozwalających na oznaczanie wolnych rod-

ników tlenowych wykorzystuje reakcję utleniania cyklicz-

nych hydroksyloamin, takich jak CPH (1-hydroksy-3-kar-

boksy-2,2,5,5-tetrametylopirolidyna) i CMH (1-hydroksy-

3-metoksykarbonyl-2,2,5,5-tetrametylopirolidyna),

które

mogą swobodnie wnikać przez błonę do wnętrza komórki.

Można również stosować PPH (1-hydroksy-4-fosfono-oksy-

-2,2,6,6-tetrametylopiperydyna), dla której błony komórko-

we są nieprzepuszczalne. Dzięki wykorzystaniu odpowied-

niej pułapki można określić poziom RFT wewnątrz oraz na

zewnątrz komórki. Co prawda rejestrowany sygnał nie daje

pełnej informacji o rodzaju pułapkowanego rodnika, ale na

podstawie uzyskanych wyników otrzymuje się informację

na temat poziomu reaktywnych form tlenu zdolnych do

utleniania cyklicznych hydroksyloamin.

Na rycinie 5 umieszczono zestawienie widm EPR uzy-

skanych podczas inkubacji świeżo pobranej krwi z pułap-

ką CMH w temperaturze 37ºC. Dzięki tego typu pomiarom

można uzyskać informację o szybkości utleniania hydrok-

syloamin przez RFT, co jest miarą poziomu stresu oksyda-

cyjnego zachodzącego w układzie biologicznym. W prób-

kach krwi pochodzącej od zwierząt z zaburzeniami pro-

dukcji tlenku azotu (myszy pozbawione aktywnych genów

kodującego apolipoproteinę E i receptor lipoprotein o małej

gęstości apoE/LDLR knockout) zaobserwowano znacznie

wyższy poziom sygnału od pułapki niż u zwierząt zdro-

wych (Ryc. 5).

Cykliczne hydroksyloaminy mogą także być stosowane

w hodowlach komórkowych. Wykorzystanie odpowiedniej

pułapki pozwala na określenie, czy sygnał pochodzi od pu-

łapki znajdującej się wewnątrz czy na zewnątrz komórki.

Nasze dotychczasowe badania prowadzone na komórkach

unieśmiertelnionej linii śródbłonkowej EAhy 926 pokazały

między innymi, że po dwunastogodzinnej inkubacji komó-

rek z czynnikiem martwicy

nowotworu-α (TNFα) utlenia-

nie pułapki CPH następuje w większym stopniu niż w ko-

mórkach kontrolnych.

METODY KOMPLEMENTARNE DO EPR

Niejednokrotnie technika EPR jest niewystarczają-

ca do pełnego zrozumienia procesów biologicznych, w

których biorą udział tlenek azotu i RFT. Dlatego w wielu

Rycina 4. Widma EPR nierozpuszczalnego adduktu NO-Fe(DETC)

2

. Widma uzy-

skano w temperaturze 77 K, dla różnych stężeń tlenku azotu(II): 1000 μM-50 μM.

Widmo wykonano w Pracowni EPR JCET.

436

www.postepybiochemii.pl

doświadczeniach konieczne jest zastosowanie innych, kom-

plementarnych metod, pozwalających na oznaczanie NO

lub jego pochodnych. Do metod tych można zaliczyć spek-

troskopię Ramana, gdzie pomiar NO opiera się na obser-

wacji przesunięć pasm stokesowskich i antystokesowskich,

chromatografię gazową z detekcją mas, metody spektro-

fluorymetryczne, chemiluminescencyjne, wykorzystujące

spektroskopię UV-Vis (i np. reakcję Griessa) oraz techniki

elektrochemiczne. W układach biologicznych szczególnie

cenne są te metody, które pozwalają na oznaczalność bar-

dzo małego stężenia NO (10

-8

-10

-9

mola/L) i

w ostatnim czasie obserwuje się wzrost za-

interesowania tymi technikami.

CHEMILUMINESCENCJA

Metody chemiluminescencyjne pozwa-

lają na oznaczanie NO powstałego poprzez

redukcję azotanów(III) i (V), nitrozotioli

oraz białek kompleksujących NO. Tlenek

azotu, który tworzy się w wyniku reakcji re-

dukcji nitrozozwiazków, reaguje z ozonem

i powstaje NO

2

*

. Emisja fotonów, która to-

warzyszy przejściu cząsteczki NO

2

*

ze sta-

nu wzbudzonego do stanu podstawowego,

jest wprost proporcjonalna do ilości tlenku

azotu, który przereagował z ozonem. Me-

tody chemiluminescencyjne pozwalają na

oznaczenia już nanomolowych ilości NO

w pożywkach hodowlanych, osoczu, pełnej

krwi, lizatach tkanek, a także w żywności

czy w lekach.

W zależności od doboru reduktora mo-

żemy oznaczać stężenia azotanów(V) i

(III). Azotany (III) oznaczamy Redukując

je do NO jonami jodkowymi. Stężenie azotanów(V) i (III)

możemy oznaczyć w procesie redukcji w obecności chlor-

ku wanadu(III). Nitrozotiole można selektywnie oznaczyć

w obecności jonów miedzi(II), natomiast oznaczenie NO

przyłączonego do żelaza hemowego w białkach jest moż-

liwe w obecności KCN/K

3

Fe(CN)

6

. Dzięki wysokiej czuło-

ści metodę tę można wykorzystać do oznaczania azotynów

będących produktem utleniania tlenku azotu wydzielonego

nawet z małego kawałka aorty (Rys. 6).

SPEKTROSKOPIA UV-VIS

Niejednokrotnie cząsteczki, które

łączą się z tlenkiem azotu nie tylko po-

siadają charakterystyczne widmo EPR,

ale również charakteryzują się specy-

ficznym widmem UV-Vis. Tak jest na

przykład w przypadku nitrozohemo-

globiny (HBNO), której widmo EPR

zostało opisane powyżej. Dodatkowo

addukt ten ma bardzo charakterystycz-

ne widmo UV-VIS, z pasmami absorp-

cji 417 nm (ε=126), 544 nm (ε=11,4) i

572 nm (ε=11,4) [42]. Dzięki znajomo-

ści położenia pasm absorpcji i wartości

ekstynkcji można niezależnie metodą

UV-Vis potwierdzić zarówno czystość

próbki jak i określić stężenie związku.

Techniki z wykorzystaniem UV-Vis, ze

względu na swoją prostotę i łatwość

wykonywanych pomiarów, są ciągle

jednymi z najpopularniejszych metod

analitycznych. Pozwalają na określenie

czystości próbki w szerokim zakresie

stężeń i dla różnorodnych materiałów.

Techniką tą można również określić

Rycina 5. Widma EPR uzyskane podczas inkubacji świeżo pobranej krwi myszy c57BL6/J z pułapką

CMH w temperaturze 37ºC, zmierzone przy użyciu spektrometru Bruker e-scan. Amplituda sygnału jest

proporcjonalna do stężenia utlenionej hydroksyloaminy. Dzięki tego typu pomiarom można uzyskać in-

formację o szybkości utleniania hydroksyloamin przez RFT, co jest miarą poziomu stresu oksydacyjnego

zachodzącego w układzie biologicznym. Widmo wykonano w Pracowni EPR JCET.

Rycina 6. Stężenie azotanów(III) w buforze po inkubacji krążków aorty szczurów rasy Wistar w obecności

L-NAME (inhibitora syntazy tlenku azotu), aorty kontrolnej (odcinek 1 i odcinek 2) i aorty aktywowanej jonofo-

rem wapniowym. Każdy kolor reprezentuje wyniki uzyskane z krążków pochodzących od jednego zwierzęcia.

Pomiar wykonano w Pracowni EPR JCET.

Postępy Biochemii 59 (4) 2013

437

kinetykę przyłączania się lub dyfuzji tlenku azotu oraz

trwałość samych kompleksów w różnym zakresie stężeń,

pH i temperatury.

ELEKTROCHEMIA

Obecnie znane są metody amperometryczne, dzięki któ-

rym można dokonać pomiaru tlenku azotu(II) w nienaru-

szonych tkankach i w komórkach [43]. Detekcji dokonuje

się za pomocą selektywnych elektrod gazowych, w których

potencjał w określonym przedziale stężeń zależy liniowo

od stężenia NO. Jednymi z pierwszych elektrod używanych

powszechnie do pomiaru NO w układach biologicznych

były: elektroda profesora Tadeusza Malińskiego oraz elek-

troda ISO-NO firmy World Precission Instruments.

Selektywne elektrody gazowe składają się z elektrody

jonowymiennej oraz układu wyodrębniającego i przetwa-

rzającego oznaczany składnik z próbki analitycznej. Głów-

ną częścią tych elektrod jest hydrofobowa membrana prze-

puszczalna dla gazów. Oddziela ona odpowiednie półogni-

wo od roztworu badanego, styka się z dwoma roztworami,

wewnętrznym o stałym składzie i zewnętrznym badanym.

Rdzeniem elektrody jest grafitowe włókno pokryte galwa-

nometrycznie zmodyfikowaną porfiryną lub polimerem o

ładunku ujemnym, wysoce specyficznym dla tlenku azotu-

(II). Nawet duży nadmiar jonów NO

2

-

nie wpływa na zmia-

nę przepływu prądu. Metoda polega na pomiarze prądu

elektrycznego generowanego podczas utleniania tlenku

azotu(II) zachodzącego na powierzchni elektrody. Genero-

wany w wyniku tego procesu prąd jest wprost proporcjo-

nalny do ilości utlenianego NO:

NO – ē → NO+

Technika ta służy do pomiaru nanomolowych stężeń

NO oraz daje możliwość analizy szybkiej odpowiedzi cza-

sowej (sekundy). Jej zaletą jest też umożliwienie pomiaru

miejscowego w tkankach i komórkach, np. w śródbłonku i

mięśniach gładkich ściany naczynia. Elektroda ta cechuje się

również wyjątkowo szybką reakcją na zmianę bodźca [44].

PIŚMIENNICTWO

1. Szaciłowski K, Stasicka Z (2001) S-nitrosothiols: Materials, reactivity

and mechanisms. Progr React Kin Mech 26: 1

2. Gaston B (1999) Nitric oxide and thiol groups. Biochem Biophys Acta

1411: 323-333

3. Cooper CE (1999) Nitric oxide and iron proteins. Biochem Biophys

Acta 1411: 290-304

4. Wink DA, Mitchell JB (1998) Chemical biology of nitric oxide: insights

into regulatory, cytotoxic and cytoprotective mechanisms of nitric oxi-

de. Free Rad Biol Med 25: 434-456

5. Hoshino M, Laverman L, Ford PC (1999) Nitric oxide complexes of

metalloporphyrins: an overview of some mechanistic studies. Coord

Chem Rev 187: 75-102

6. Milani M, Pesce A, Nardini M, Ouellet H, Ouellet Y, Dewilde S, Bocedi

A, Ascenzi P, Guertin M, Moens L, Friedman JM, Wittenberg JB, Bolo-

gnesi M (2005) Structural bases fro heme bingind and diatomic ligand

recognition in truncated hemoglobins. J Inorg Biochem 99: 97-109

7. Pal B, Kitagawa T (2005) Interactions of soluble guanylate cyclase with

diatomics as probed by resonnance raman spexctroscopy. J Inorg Bio-

chem 99: 267-279

8. Endo I, Odaka M, Yohda M (1999) An enzyme controlled by light: the

molecular mechanism of photoreactivity in nitrile hydratase. Trends

Biotechnol 17: 244-248

9. Noguchi T, Noriji M, Takei K, Odaka M, Kamiya N (2003) nitrile hy-

dratase. Biochemistry 42: 11642-11650

10. Gilles-Gonzalez M-A, Gonzalez G (2005) Heme-based sensors: defi-

ning characteristics, recent developments and regulatory hypotheses.

J Inorg Biochem 99: 1-22

11. Szaciłowski K, Chmura A, Stasicka Z (2005) Interplay between iron

complexes, nitric oxide and sulfur ligands: Structure, (photo)reactivity

and biological importance. Coordination Chem Rev 249: 2408-2436

12. Feelish M, Stamler JS (red) (1996) Methods in Nitric Oxide Research,

Chicester, GB, John Wiley & Sons

13. Bohle DS (1998) Pathophysiological chemistry of nitrix oxide and its

oxygenation by-products. Curr Opin Chem Biol 2: 194-200

14. Kröncke KD, Fehsel K, Kolb-Bachofen V (1997) Nitric oxide: cytotoxici-

ty versus cytoprocestion — how, why, when and where? Nitric Oxide

1: 107-120

15. Goldstein S, Czapski G (1995) Kinetics of nitric oxide autoxidation in

aqueous solution in the absence and presence of various reductants.

The nature of oxidizing intermediates. J Am Chem Soc 117: 12078-

12084

16. Szabó C (2003) Multiple pathways of peroxynitrite cytotoxicity. Toxi-

cology Lett 140-141: 105-112

17. Patel RP, McAndrew J, Sellak H, White CR, Jo H, Freeman BA, Dar-

ley-Usmar VM (1999) Biological aspects of reactive nitrogen species.

Biochem Biophys Acta 1411: 385-400

18. Crow JP (2000) Peroxynitrite scaveging by metalloproteins and thiola-

tes. Free Rad Biol Med 28: 1487-1494

19. Butler AR, Flitney FW, Williams DLH (1995) NO, nitrosolium ions,

nitroxide ions and iron nirosyls in biology: a chemist’s perspective.

Trends Pharmacol Sci 16: 18-22

20. Hughes M (1999) Relationship between nitric oxide, nitroxyl ion, nitro-

sonium cation and peroxynitite. Biochem Biophys Acta 1411: 263-272

21. Kelm M (1999) Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochem.

Biophys. Acta 1411: 272-289

22. Stamler JS, Singel DJ, Loscalzo J (1992) Biochemistry of nitric oxide and

its redox-activated forms. Science 258: 1898-1902

23. Ford PC, Lorkovic I (2002) Mechanistic aspects of the reactions of nitric

oxide with transition metal complexes. Chem Rev 102: 993-1017

24. Szaciłowski K, Stasicka Z (2000) S-nitrosothiols: materials, reactivity

and mechanisms. Progr React Kin Mech 26: 1

25. Kleschyov AL, Munzel W (2007) Electron paramagnetic resonance

(EPR) spin trapping of biological nitric oxide. J Chromatogr B 851: 12-

20

26. Pustelny K, Bielanska J, Płonka P, Rosen G, Elas M (2007) In vivo spin

trapping of nitric oxide from animal tumors. Nitric Oxide 16: 202-208

27. Vanin AF, Sanina NA, Serezhenkov VA, Burbaev DS, Lozinsky VI,

Aldoshin SM (2007) Dinitrosyl-iron complexes with thiol-containing

ligands: spatial and electronic structures. Nitric Oxide 16: 71-81

28. Wang PG, Xian M, Tang X, Wu X, Wen Z, Cai T, Janczuk AJ (2002)

Nitric oxide donors: chemical activities and biological applications.

Chem Rev 102: 1091-1134

29. Szaciłowski K, Oszajca J, Barbieri A, Karocki A, Sojka Z, Sostero S, Bo-

aretto R, Stasicka Z (2001) Photochemistry of the [Fe(CN)

5

N(O)SR]

3-

complex. A mechanistic study. J Photochem Photobiol A: Chem 143:

99-108

30. Costanzo S, Ménage S, Parello R, Bonomo RP, Fontecave M (2001) Re-

-examination of the formation of dinitrosyl-iron complexes during re-

action of S-nitrosothiols with Fe(II). Inorg Chim Acta 318: 1-7

31. Butler AR, Glidewell C, Hyde AR, Walton JC (1985) Formation of pa-

ramagnetic mononuclear iron nitrosyl complxes from diamagnetic di-

and tetranuclear iron-sulphur nitrosyls: characterization by EPR spec-

troscopy and study of thiolate and nitrosyl ligand exchange reactions.

Polyhedron 4: 797

438

www.postepybiochemii.pl

The detection of nitric oxide and NO-derivatives in the endothelial cells

and tissues

Antonina Chmura-Skirlińska

1,

, Ryszard J. Gurbiel

1,2

1

Laboratory of EPR Spectroscopy, Jagiellonian Center for Experimental Therapeutics, Jagiellonian University 14 Bobrzyńskiego St., 30-348 Kra-

kow, Poland

2

Deparment of Molecular Biophysics, Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology, Jagiellonian University, 7 Gronostajowa St., 30-387

Krakow, Poland



e-mail: [e-mail]

Key words: nitric oxide, NO-Hb, EPR, spin trapping, chemiluminescence, nitrite

ABSTRACT

The correctly working endothelium produces suitable quantities of nitric oxide (NO) and other mediators, necessary for maintenance of ho-

meostasis of cardiovascular system. Because of correlation between the availability of NO and the physiological state of the whole organism,

monitoring the concentration of nitric oxide is essential for the better understanding of pathogenesis of many diseases. For this reason, there

are intensive studies performed to develop new methods allowing the control of NO concentration in biological specimens. Thus, we should

pay a special attention on the methods which make possible the measurement of the concentration of nitric oxide and reactive oxygen species

(ROS). They can be based on analysis of adducts formed by ROS with different stable complexes, on measurement of the direct products

of oxygenation, or on the reduction of radicals. Electron paramagnetic resonance (EPR) deserves special attention, as it allows for the direct

measurement of free radical signals or for analysis of stable adducts of radicals with the spin traps. Other methods should be used, however,

to confirm and extend the results of EPR examination.

32. Baltusis LM, Karlin KD, Rabinowitz HH, Dewan JC, Lippard SJ (1980)

Synthesis and structure of Fe(L’H)(NO)

2

, a tetracoordinate complex

having a twelve-membered chelate ring, and its conversion to penta-

coordinate FeL’(NO) through formal loss of “HNO” (L’ = SCH

2

CH

2

N-

MeCH

2

CH

2

CH

2

NMeCH

2

CH

2

S

-

). Inorg Chem 19: 2627-2632

33. Boese M, Mordvincev PI, Vanin AF, Busse R, Mulsch A (1995) S-Nitro-

sation of serum albumin by dinitrosyl-iron complex. J Biol Chem 270:

29244-29249

34. Szaciłowski K, Macyk W, Stochel G, Sostero S, Traverso O, Stasicka

Z (2000) Ligand and medium controlled photochemistry of iron and

ruthenium mixed ligand complexes: prospecting for versatile systems.

Coord Chem Rev 208: 277-297

35. Conrado CL, Bourassa JL, Egler C, Wecksler S, Ford PC (2003) Pho-

tochemical investigation of Roussin’s Red salt esters: Fe

2

(u-SR)

2

(NO)

4

.

Inorg Chem 42: 2288-2293

36. Boese M, Keese MA, Becker K, Busse R, Mülsch A (1997) Inhibition

of glutathione reductase by dinitrosyl-iron-dithiolate complex. J Biol

Chem 272: 21767-21773

37. Wiegant FCA, Malyshev IY, Kleschyov AL, van Faassen E, Vanin AF

(1999) Dinitrosyl iron complexes with thiol-containing ligands and

S-nitroso-D,L-penicillamine as inductors of heat shock protein synthe-

sis in H35 hepatoma cells. FEBS Lett 455: 179-182

38. Jeżowska-Trzebiatowska B, Jezierski A (1973) Electron spin resonance

spectroscopy of iron nitrosyl complexes with organic ligands. J Mol

Struct 19: 635-640

39. Lewandowska H, Brzóska K, Męczyńska-Wielgosz S, Rumianek K,

Wójciuk G, Kruszewski M (2010) Dinitrozylowe kompleksy żelaza -

budowa i znaczenie biologiczne. Postepy Biochem 56: 298-304

40. Fujii S, Yoshimura T (2000) A new trend in iron-dithiocarbamate com-

plexes: as an endogenous NO trapping agent. Coord Chem Rev 198:

89-99

41. Kharitonov VG, Ventura JB, Sharma VS (1996) Interactions od nitric

oxide with heme proteins using UV-VIS spectroscopy. W Methods

in nitric oxide research (Feelisch M, Stamler J, red.) Chichester, Wi-

ley-Blackwell, str. 39-44

42. Janczyk A, Wolnicka-Glubisz A, Chmura A, Elas M, Matuszak Z, Sto-

chel G, Urbanska K (2004) NO-dependent phototoxicity of Roussin’s

black salt against cancer cells. Nitric oxide 10: 42-50

43. Maliński T (2007) Electrochemical measurements of nitric oxide in bio-

logical systems. Encyclopedia of Electrochemistry

44. Chmura A (2005) Fotochemia wybranych nitrozylowych klasterów

żelazowo-siarkowych. Praca doktorska, Wydział Chemii, Uniwersytet

Jagielloński