Zagadnienie szczegółowe na egzamin z mikrobiologii:

MIKROBIOLOGIA STOSOWANA I PODSTAWY INŻYNIERII

GENETYCZNEJ

podpunkty: 189 – 197.

189) Klasyfikacja bakterii.

Systematyka prokariontów i Metody klasyfikacji:
Prokarionty są organizmami bardzo mało zróżnicowanymi, dlatego też ich klasyfikacja powoduje
sporo trudności. Wydawałoby się, że najlepszym kryterium podziału byłby kształt komórki.
Okazuje się jednak, że nie jest on odzwierciedleniem naturalnych linii filogenetycznych tych
organizmów. Także ogólne funkcje życiowe, takie jak sposób oddychania, odżywiania się,
poruszania itp., nie pozwalają na prawidłowe naturalne sklasyfikowanie bakterii.
Jedną z pierwszych metod naukowej klasyfikacji bakterii wprowadził w roku 1884 Hans Gram –
jest to tak zwana metoda Grama. Za pomocą barwienia ustalił on dwie główne grupy bakterii: Gram
– dodatnie (G+) barwiące się na niebiesko oraz Gram – ujemne (G-) barwiące się na czerwono.
Dzięki późniejszym badaniom mikroskopowym wiadomo dziś, że sposób barwienia zależy od
budowy ściany komórkowej – bakterie (G+) mają grubą ścianę mureinową, zaś bakterie (G-)
cienką, ale za to występuje u nich podwójna błona komórkowa. Rozwój biologii molekularnej w
XX i XXI wieku umożliwił bardziej precyzyjny podział prokariontów. Powstanie stosowanego do
dziś systemu stało się możliwe dzięki badaniu podobieństwa sekwencji DNA (stopnia homologii)
oraz obecności określonych enzymów i szlaków metabolicznych.
Podział systematyczny:

•

Archeany

•

Eubakterie

•

Sinice (Cyanobacteria)

•

Promieniowce (Actinomycetes)

•

Krętki (Spirochaetae)

•

Firmicutes

•

Protobakterie (Proteobacteria)

190.Nowoczesna diagnostyka mikrobiologiczna.
PCR (o czym niżej)
RFLP - jest wykorzystywany w technice, w której organizmy mogą być różnicowane poprzez
analizę wzorów pochodzących z pocięcia ich DNA. Tą techniką wykrywa się różnice pomiędzy
rozmiarami fragmentów DNA pociętych restryktazami. Różnice długości fragmentów DNA
powstają w wyniku mutacji, które tworzą lub eliminują miejsca rozpoznawane przez te enzymy.
Jednym z najnowszych sposobów badań są chipy białkowe

191. Zastosowanie PCR w diagnostyce mikrobiologicznej.
Stosuje się głównie metodę real-time PCR, która jest udoskonaloną wersją PCR, jest to czuła
metoda analityczna stosowana w genetyce, bazująca na konwencjonalnej metodzie PCR, która,
wykorzystując techniki fluorescencyjne, pozwala na monitorowanie ilości produktu reakcji w
każdym cyklu prowadzonej reakcji PCR, dzięki czemu cała procedura analizy jest bardzo szybka i
pozwala wyeliminować etap szacowania produktu po zakończeniu reakcji. Umożliwia ona także
wgląd w kinetykę reakcji, a co za tym idzie pozwala na oszacowanie ilości produktu na początki

reakcji, co jest niemożliwe w konwencjonalnej metodzie PCR. Ponadto, dzięki temu, że
amplifikacja kwasów nukleinowych i detekcja produktu odbywa się w jednym zamkniętym
naczyniu, ryzyko zanieczyszczenia badanej próby jest minimalne.
Stosuje się ją do identyfikacji patogenów. Komórki sonifikuje się za pomocą ultradźwięków, a
materiał genetyczny poddaje PCR. Skraca to czas i podnosi dokładność wyników.
Stosowane również do wykrywania wirusów

192. SZEREGI BIOCHEMICZNE

Identyfikację bakterii można wykonać w oparciu o ich własności biochemiczne. Do

najważniejszych należą:

-

właściwości kwasotwórcze i gazotwórcze (fermentacja)

-

właściwości proteolityczne (rozkład białek)

-

dekarboksylacja i deaminacja aminokwasów

-

zdolność produkowania katalazy (enzym rozkładający nadtlenek wodoru)

-

zdolność produkowania enzymu ureazy (rozkład mocznika)

-

zdolność wytwarzania indolu (rozkład tryptofanu)

-

zdolność rozkładu cukrów,

-

zdolność wytwarzania acetoiny

-

zdolność wytwarzania siarkowców

-

zdolność redukowania azotanów

-

zdolność redukowania błękitu metylenowego

-

zdolności hemolityczne (rozpuszczanie czerwonych krwinek).

Wyżej wymienione cechy nie obejmują całości testów identyfikacyjnych, jest ich znacznie

więcej. Należą jednak do najczęściej stosowanych, zwłaszcza w obrębie rodziny
Enterobacteriaceae. Podobne testy przeprowadza się podczas analizy gleby lub wód w celu
określenia ich eutrofizacji.

Przykładowe podłoża:

•

podłoże Kligera - badanie zdolności bakterii do rozkładu cukrów (glukoza, laktoza) oraz
właściwości proteolitycznych (wydzielanie siarkowodoru),

•

podłoże Singera – badanie zdolności bakterii do rozkładu mocznika (obecność ureazy) i
wytwarzania indolu,

•

podłoże półpłynne z mannitolem – badanie zdolności bakterii do rozkładu mannitolu,

•

podłoże z laktozą – badanie zdolności bakterii do rozkładu laktozy,

•

podłoże z fenyloalaniną – badanie zdolności bakterii do dezaminacji fenyloalaniny,

•

podłoże Simmonsa – wykorzystanie cytrynianu sodu jako jedynego źródła węgla,

•

podłoże z żelatyną – badanie obecności enzymów proteolitycznych,

•

podłoże do badania ruchu bakterii i obecności azotanów,

•

podłoże z melonianem sodowym – badanie zdolności bakterii do rozkładu melonianu.

193. CHARAKTERYSTYKA BAKTERII Z RODZAJU ENTEROBACTERIACEAE

Pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae (pałeczki jelitowe) stanowią dużą, blisko

spokrewnioną grupę bakterii, na którą składa się czterdzieści rodzajów obejmujących ponad
dwieście gatunków. Wiele rodzajów rodziny Enterobacteriaceae (np. rodzaje Escherichia,
Enterobacte, Klebsiella) zasiedla jelita zdrowych ludzi i zwierząt. Inne (Salmonella, Shigella czy
Yersinia) są bezwzględnymi patogenami odpowiedzialnymi za takie choroby, jak dur brzuszny,
czerwonka czy toksykoinfekcje pokarmowe.

Wszystkie bakterie wchodzące w skład rodziny Enterobacteriaceae są bardzo podobne do

siebie zarówno pod względem morfologii komórek, morfologii kolonii, jak i metabolizmu. Są
dużymi gramujemnymi pałeczkami o średnicy do 2

µ

m i długości do 6

µ

m. Wiele rodzajów jest

urzęsionych. Mają niewielkie wymagania odżywcze, są prototrofami. To względne beztlenowce,
które wyrastają zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych, prowadząc metabolizm
fermentacyjny. Na podłożach stałych tworzą duże, błyszczące, przeważnie szare kolonie.

Tabela: Miejsca bytowania i chorobotwórczość pałeczek rodziny Enterobacteriaceae

Rodzaj

Chorobotwórczość

Es
ch
eri
ch
ia

flora jelitowa człowieka; infekcje oportunistyczne; serotypy
bezwzględnie chorobotwórcze

Sh
ig
ell
a

bezwzględnie chorobotwórcze, nosicielstwo

Sa
lm
on
ell
a

bezwzględnie chorobotwórcze, nosicielstwo

Ci
tro
ba
ct
er

flora jelitowa człowieka; infekcje oportunistyczne, zakażenia szpitalne

Ed
w
ar
ds
iel
la

infekcje oportunistyczne

Kl
uy
ve
ra

flora jelitowa człowieka; infekcje oportunistyczne

Ce
de
ce
a

flora jelitowa człowieka; infekcje oportunistyczne

Ye
rsi
ni
a

środowisko, serotypy chorobotwórcze, nosicielstwo

Kl
eb
sie
lla

flora jelitowa człowieka; infekcje oportunistyczne, zakażenia szpitalne

En
ter

środowisko, flora jelitowa człowieka; infekcje oportunistyczne,
zakażenia szpitalne

ob
ac
ter
Se
rr
ati
a

flora jelitowa człowieka; infekcje oportunistyczne, zakażenia szpitalne

Pa
nt
oe
a

flora jelitowa człowieka; infekcje oportunistyczne

H
af
ni
a

flora jelitowa człowieka; infekcje oportunistyczne

Pr
ot
eu
s

środowisko, flora jelitowa człowieka; infekcje oportunistyczne,
zakażenia szpitalne

M
or
ga
ne
lla

środowisko, flora jelitowa człowieka; infekcje oportunistyczne,
zakażenia szpitalne

Pr
ov
id
en
ci
a

środowisko, flora jelitowa człowieka; infekcje oportunistyczne,
zakażenia szpitalne

Wszystkie pałeczki Enterobacteriaceae mają wspólne cechy biochemiczne:
-

fermentują glukozę (często z wytworzeniem gazu),

-

nie wytwarzają oksydazy cytochromowej,

co wyraźnie odróżnia je od innych, podobnych morfologicznie i żywieniowo gramujemnych
pałeczek. Pałeczki jelitowe mają także dwie inne wspólne, ale słabiej dyskryminujące je
cechy:
-

zdolność redukcji azotanów do azotynów,

-

wytwarzanie katalazy.

194.Zastosowanie mikroorganizmów w biotechnologii.

195. WEKTORY PLAZMIDOWE

Kilka słów o wektorach: Wszystkie wykonywane obecnie doświadczenia nad

rekombinowaniem DNA polegają nad podłączeniem fragmentów DNA do niewielkich cząsteczek
DNA mających zdolność do autonomicznej replikacji i spełniających rolę wektorów. Przy pomocy
wektorów geny zawarte we fragmencie DNA zostają wprowadzone do komórek odpowiedniego
gospodarza, w których ulegają powieleniu i ewentualnie ekspresji. Najczęściej stosowanym obecnie
gospodarzem dla „obcego” DNA są komórki bakteryjne, a zwłaszcza Escherichia coli K12.
Właściwości jakimi powinien charakteryzować się dobry wektor )zarówno prokariotyczny jak i
eukariotyczny):

1) Wektorem powinna być zdolna do autonomicznej replikacji niewielka cząsteczka DNA,

dobrze scharakteryzowana genetycznie i fizycznie.

2) Wektor powinien zawierać markery pozwalające na wyróżnienie komórek, w których się

znajduje.

3) Cząsteczka DNA stanowiąca wektor powinna mieć pojedyncze miejsce rozpoznawane i

cięte przez przynajmniej jeden z enzymów restrykcyjnych.

4) Miejsce przecinania cząsteczki DNA przez enzym restrykcyjny jest tym , w które

wprowadziliśmy fragment obcego DNA.

5) Pożądane jest, by wektor posiadał jeden lub kilka silnych promotorów, tak by

wstawiając w ich sąsiedztwo fragment obcego DNA można było liczyć na wydajną
ekspresję wprowadzonych genów.

6) Dla szeregu eksperymentów pożądane jest, by wektor występował w komórce w dużej

liczbie kopii lub by jego replikacja mogła zachodzić przy zahamowanej replikacji
chromosomalnego DNA.

7) Wektory nie powinny zawierać genów, których rozpowszechnienie mogłoby stanowić

zagrożenie dla człowieka lub innych organizmów. Do niektórych doświadczeń wskazane
jest stosowanie wektorów wyposażonych w specjalne właściwości, uniemożliwiające
przeżycie wektora i klonowanie w nim obcego DNA poza ściśle określonym
gospodarzem.

W przypadku bakterii rolę plazmidów pełnić mogą plazmidy i bakteriofagii.

Budowa plazmidu- kowalentnie zamknięte, koliste cząsteczki DNA występujące u wielu bakterii
zawierają ori replikacji , gen markera selekcyjnego (najczęściej oporność na antybiotyk) oraz
miejsce do klonowania.
Ich obecność nie jest niezbędna dla komórek gospodarza, choć w określonych warunkach może im
dawać znaczną przewagę selekcyjną. Plazmidy różnią się między sobą, zarówno pod względem
wielkości od 1 do 100 Md; liczby kopii; a także pod względem przenoszonych przez nie genów.
Przykładami cech kodowanych przez geny plazmidowe są: oporność na antybiotyki, oporność na
jony metali ciężkich, oporność na działanie promieniowania nadfioletowego, produkcja
entreotoksyn i hemolizyn. Na plazmidach mogą być zlokalizowane geny odpowiedzialne za
metabolizm takich związków, jak kamfora i toluen, dobrze poznane są też geny determinujące płeć
bakterii.

Najczęściej stosowane obecnie wektory plazmidowe zawierają region inicjacji replikacji

DNA pochodzący z ColEl. A pozostałą część DNA pochodzącą z plazmidów typu R warunkujących
odporność na szereg antybiotyków. Plazmidy z grupy R nie mogą być wykorzystywane same jako
wektory ze względu na ich zbyt dużą wielkość i zbyt dużą liczbę miejsc rozpoznawalnych przez
poszczególne enzymy restrykcyjne. Jednym z pierwszych wektorów zastosowanych do klonowania
DNA był plazmid pSC101. Plazmid pSC101 warunkuje odporność na tetracyklinę. Plazmid ten był
następnie wykorzystany do konstrukcji całej serii plazmidów, które zawierały geny warunkujące
odporność na inne antybiotyki oraz odcinek DNA pochodzący z plazmidu colEl. Zawierający
miejsce startu replikacji DNA. Przykładem wektora z tej serii jest plazmid pBR322.
Plazmid pBR322 posiada większość cech charakteryzujących idealny wektor. Jest łatwy do
namnożenia, posiada kilka unikalnych miejsc rozpoznawalnych przez enzymy restrykcyjne, a także
właściwości pozwalające na selekcję komórek bakteryjnych zawierających plazmidy i odróżnienia
tych, które zawierają plazmidy zrekombinowane i nierekombinowane. Można w tym plazmidzie
klonować fragmenty DNA nie wyposażone we własne promotory i uzyskać ekspresję
wprowadzonych genów. Co więcej, w roku 1978 poznana została pełna sekwencja nukleotydowa
tego plazmidu. Znajomość sekwencji nukleotydowej wektora daje możliwość przewidywania, czy
wprowadzony fragment DNA (również o znanej sekwencji) będzie czytany we właściwej fazie

kodu genetycznego. Ma to szczególne znaczenie dla klonowania genów zsyntezowanych
chemicznie. Ekspresja genów zawartych we fragmencie DNA wprowadzonym do wektora jest dla
eksperymentatora często sprawą kluczową. Stąd też podjęto szereg prób uzyskania wektorów
dających nie tylko możliwie dużą szansę ekspresji, ale również możliwość regulowania działania
wprowadzonych genów. Przykładem wektorów konstruowanych z tą myślą są plazmidy pBGP120 i
pBGP123. Konstrukcja tych wektorów polegała na wprowadzeniu do plazmidu pSF2124 (plazmid
pochodny colEl) odcinka DNA E.coli, stanowiącego część operonu laktozowego zawierającą
promotor, operator i prawie cały gen struktury

β

-galaktozydazy. Odcinek ten został uzyskany

poprzez wycięcie endonukleazą Eco RI odpowiedniego fragmentu DNA faga

λ

plac, czyli faga

przenoszącego cały operon laktozowy E.coli. Fragment DNA z operonem laktozowym połączono in
vitro z DNA plazmidu pSF2124, uprzednio przeciętego endonukleazą Eco RI (pSF2124 posiada
tylko jedno miejsce rozpoznawalne przez tę endonukleazę). Zrekombinowany plazmid posiadał
więc dwa miejsca rozpoznawalne przez Eco RI, po obu stronach włączonego fragmentu DNA.
Jedno z tych miejsc usunięto pozostawiając to, które znajduje się w genie lacZ z kodującym

β

-

galaktozydazę. Fragmenty obcego DNA uzyskane w wyniku trawienia endonukleazą Eco RI,
wprowadzane do takiego wektora, mogą być podłączane bezpośrednio za genem struktury

β

-

galaktozydazy i ich transkrypcja będzie podlegała regulacji przez te same czynniki, które kontrolują
transkrypcję operonu laktozowego.

196. BAKTERYJNE SYSTEMY RESTRYKCYJNO-MODYFIKACYJNE

Systemy restrykcyjno-modyfikacyjne – stanowią obronę bakterii przed wnikaniem DNA

fagowego. Niektóre bakterie zawierają pary enzymów: restryktazę mającą zdolność cięcia DNA w
specyficznie rozpoznawanych przez siebie sekwencjach (np. enzym rozpoznający
czteronukleotydową sekwencję GATC będzie ciął średnio co 4

4

=256 nukleotydów), oraz metylazę,

która w tej samej sekwencji metyluje którąś z zasad. Metylowany DNA jest chroniony przed
cięciem. Chromosom bakterii jest zmetylowany na skutek działania metylazy. Wnikający, obcy
DNA metylowany nie jest, skutkiem czego stanowi obiekt dla działania restryktazy.

197.Klonowanie DNA.

Klonowanie – w potocznym rozumieniu proces tworzenia idealnej kopii z oryginału.

W biologii mianem klonu określa się organizmy mające identyczny lub prawie identyczny materiał
genetyczny. Klonami są więc organizmy powstałe w procesie rozmnażania wegetatywnego, takie
jak kolonie bakterii, jednokomórkowców, odrośla i rozmnóżki roślin etc.
Termin klonowanie jest używany w kilku znaczeniach:
Klonowanie to proces tworzenia organizmów mających taką samą informację genetyczną jak
dawca. Szczególnym przypadkiem jest twinning, czyli powstawanie lub otrzymywanie bliźniąt
monozygotycznych, gdzie nie można wyróżnić dawcy.
Klonowanie organizmów oznacza procedurę otrzymywania organizmów o takiej samej informacji
genetycznej, z reguły poprzez procedurę transferu jądra z komórki somatycznej do komórki jajowej
pozbawionej uprzednio jądra. W przypadku klonowania roślin stosuje się procedurę
odróżnicowania komórek dawcy do komórek merystematycznych.
Klonowanie genów - w genetyce i biologii molekularnej proces wyosobniania genu. Polega na
łączeniu fragmentów materiału genetycznego z wektorem molekularnym i ich namnażaniu w innym
organizmie. Otrzymuje się w ten sposób wiele kopii tego samego genu. Termin klonowanie genów
odnosi się też do identyfikacji genów poprzez wykorzystanie procedury klonowania genów. Jeśli
pojedynczy fragment genomu jest przenoszony z jednego wektora do drugiego, taki proces określa
się mianem subklonowania.
Opanowano obecnie metody klonowania wielu gatunków roślin i zwierząt. W przypadku zwierząt
zazwyczaj stosuje się technikę polegającą na przeniesieniu jądra komórki somatycznej pobranej z
klonowanego osobnika, do komórki jajowej pozbawionej jądra. Proces ten tworzy funkcjonalną
zygotę. Zygota ta może, jeśli się jej na to pozwoli, rozwinąć w żywego osobnika. Dawca komórki

jajowej z reguły pochodzi z tego samego gatunku. Transfer jądra do komórki jajowej innego
gatunku rzadko jest skuteczny.
Klony otrzymane w procesie transferu jądrowego nie są w 100% genetycznie identyczne z
dawcami. W trakcie tego procesu wymienia się bowiem tylko materiał genetyczny zawarty w jądrze
komórkowym pozostawiając DNA mitochondrialny biorcy. Mitochondrialne DNA ma jednak
minimalny wkład w dziedziczenie cech genetycznych.