Metody stosowane w

Metody stosowane w

diagnostyce

diagnostyce

mikrobiologicznej cz. II

mikrobiologicznej cz. II

Identyfikacja

Identyfikacja

drobnoustrojów

drobnoustrojów

•

Wstępna

Wstępna

•

Wynik barwienia metodą Grama

Wynik barwienia metodą Grama

•

Morfologia kolonii na podłożu stałym

Morfologia kolonii na podłożu stałym

•

Zdolność do wzrostu na określonych

Zdolność do wzrostu na określonych

podłożach wybiórczych i wybiórczo –

podłożach wybiórczych i wybiórczo –

różnicujących

różnicujących

•

Wymagania dotyczące gazowego składu

Wymagania dotyczące gazowego składu

środowiska

środowiska

•

Proste testy diagnostyczne

Proste testy diagnostyczne

Proste testy diagnostyczne

Proste testy diagnostyczne

•

Oznaczenie katalazy

Oznaczenie katalazy

•

Pozwala odróżnić drobnoustroje katalazo-

Pozwala odróżnić drobnoustroje katalazo-

dodatnie (np.

dodatnie (np.

Staphylococcus

Staphylococcus

spp,

spp,

Coryneforms

Coryneforms

) od katalazo-ujemnych (np.

) od katalazo-ujemnych (np.

Streptococcus

Streptococcus

spp.)

spp.)

•

Wykonanie: pobrać 1-2 kolonie bakteryjne i

Wykonanie: pobrać 1-2 kolonie bakteryjne i

nanieść na szkiełko podstawowe, dodać 1-2

nanieść na szkiełko podstawowe, dodać 1-2

krople 3% H

krople 3% H

2

2

O

O

2

2

pojawienie się pęcherzyków

pojawienie się pęcherzyków

gazu – wynik dodatni

gazu – wynik dodatni

•

Nie używać do oznaczenia hodowli na podłożu

Nie używać do oznaczenia hodowli na podłożu

krwawym

krwawym

Proste testy diagnostyczne

Proste testy diagnostyczne

•

Oznaczenie koagulazy związanej (Clumping

Oznaczenie koagulazy związanej (Clumping

Factor, CF)

Factor, CF)

•

CF (+)

CF (+)

Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus

, CF(-) pozostałe

, CF(-) pozostałe

Staphylococcus

Staphylococcus

spp. (Coagulase-Negative

spp. (Coagulase-Negative

Staphylococci, CNS)

Staphylococci, CNS)

•

Wykonanie: Pobrać 1-2 kolonie bakteryjne,

Wykonanie: Pobrać 1-2 kolonie bakteryjne,

rozprowadzić na szkiełku podstawowym,

rozprowadzić na szkiełku podstawowym,

zawiesić w 0,9% NaCl i dodać osocza króliczego

zawiesić w 0,9% NaCl i dodać osocza króliczego

•

Pojawienie się „kłaczków” – wynik dodatni

Pojawienie się „kłaczków” – wynik dodatni

Proste testy diagnostyczne

Proste testy diagnostyczne

•

Oznaczenie koagulazy wolnej

Oznaczenie koagulazy wolnej

•

Koagulazo-dodatni – tylko

Koagulazo-dodatni – tylko

Staphylococcus

Staphylococcus

aureus

aureus

, koagulazo-ujemne – CNS

, koagulazo-ujemne – CNS

•

Wykonanie: 2-3 kolonie bakteryjne

Wykonanie: 2-3 kolonie bakteryjne

zawiesić w 0,5 ml osocza króliczego,

zawiesić w 0,5 ml osocza króliczego,

inkubować 4-12 h w temperaturze 37

inkubować 4-12 h w temperaturze 37

0

0

C

C

•

Pojawienie się skrzepu – wynik dodatni

Pojawienie się skrzepu – wynik dodatni

Proste testy diagnostyczne

Proste testy diagnostyczne

•

Oznaczenie oksydazy cytochromowej

Oznaczenie oksydazy cytochromowej

•

Stosuje się do różnicowania laktozo-

Stosuje się do różnicowania laktozo-

ujemnych pałeczek Gram-ujemnych

ujemnych pałeczek Gram-ujemnych

•

Oksydazo (+) np.

Oksydazo (+) np.

Pseudomonas

Pseudomonas

spp,

spp,

oksydazo (-) np.

oksydazo (-) np.

Stenotrophomonas

Stenotrophomonas

maltophilia

maltophilia

•

Wykonanie: kolonie bakteryjne polać

Wykonanie: kolonie bakteryjne polać

odczynnikiem Kovacsa

odczynnikiem Kovacsa

•

Pojawienie się fioletowego zabarwienia

Pojawienie się fioletowego zabarwienia

kolonii – wynik dodatni

kolonii – wynik dodatni

Proste testy diagnostyczne

Proste testy diagnostyczne

•

Wykrywanie indolu i ureazy

Wykrywanie indolu i ureazy

•

Przeprowadza się w podłożu MIR

Przeprowadza się w podłożu MIR

•

Drobnoustroje ureazo (+) w czasie wzrostu

Drobnoustroje ureazo (+) w czasie wzrostu

powodują zabarwienie podłoża na kolor

powodują zabarwienie podłoża na kolor

różowo-fioletowy

różowo-fioletowy

•

Wytwarzanie indolu – na powierzchnię

Wytwarzanie indolu – na powierzchnię

podłoża dodaje się odczynnika Jamesa –

podłoża dodaje się odczynnika Jamesa –

pojawienie się czerwonego pierścienia –

pojawienie się czerwonego pierścienia –

wynik dodatni

wynik dodatni

Proste testy diagnostyczne

Proste testy diagnostyczne

•

Test filamentacji

Test filamentacji

•

Służy do odróżnienia

Służy do odróżnienia

Candida albicans

Candida albicans

od

od

Candida non-albicans

Candida non-albicans

(

(

Candida

Candida

spp.)

spp.)

•

Wykonanie: 1-2 kolonie badanych

Wykonanie: 1-2 kolonie badanych

drożdżaków zawiesza się w surowicy,

drożdżaków zawiesza się w surowicy,

inkubacja 24 h, 37

inkubacja 24 h, 37

0

0

C

C

•

Obserwacja w mikroskopie: pojawienie się

Obserwacja w mikroskopie: pojawienie się

wypustków – wynik dodatni

wypustków – wynik dodatni

Proste testy diagnostyczne

Proste testy diagnostyczne

•

Izolacja z optochiną

Izolacja z optochiną

•

Służy do różnicowania paciorkowców alfa-

Służy do różnicowania paciorkowców alfa-

hemolizujących

hemolizujących

•

Streptococcus pneumoniae

Streptococcus pneumoniae

– wrażliwy na

– wrażliwy na

optochinę, pozostałe

optochinę, pozostałe

Streptococcus

Streptococcus

spp. -

spp. -

oporne

oporne

Proste testy diagnostyczne

Proste testy diagnostyczne

•

Ocena zapotrzebowania na czynniki

Ocena zapotrzebowania na czynniki

wzrostowe

wzrostowe

Haemophilus

Haemophilus

spp.

spp.

•

Haemophilus influenzae

Haemophilus influenzae

wymaga do wzrostu

wymaga do wzrostu

czynników V i X, a

czynników V i X, a

Haemophilus

Haemophilus

parainfluenzae

parainfluenzae

tylko czynnika V

tylko czynnika V

•

Na posiane podłoże Mueller - Hinton’a układa

Na posiane podłoże Mueller - Hinton’a układa

się dwa krążki diagnostyczne V i V+X

się dwa krążki diagnostyczne V i V+X

•

Wzrost wokół krążka pozwala na

Wzrost wokół krążka pozwala na

identyfikację

identyfikację

Identyfikacja w oparciu o

Identyfikacja w oparciu o

cechy biochemiczne

cechy biochemiczne

•

Bada się:

Bada się:

•

zdolność do wzrostu przy wykorzystaniu

zdolność do wzrostu przy wykorzystaniu

określonych substratów jako jedynego

określonych substratów jako jedynego

źródła węgla

źródła węgla

•

Wytwarzania określonych produktów ze

Wytwarzania określonych produktów ze

znanych substratów

znanych substratów

•

Wytwarzania gazu

Wytwarzania gazu

•

Fermentacji określonych cukrów

Fermentacji określonych cukrów

•

Wytwarzania określonych enzymów

Wytwarzania określonych enzymów

Identyfikacja w oparciu o

Identyfikacja w oparciu o

cechy biochemiczne

cechy biochemiczne

•

Dawniej stosowano szeregi biochemiczne

Dawniej stosowano szeregi biochemiczne

złożone z kilku – kilkunastu podłóż

złożone z kilku – kilkunastu podłóż

specjalnych na płytkach lub w probówkach

specjalnych na płytkach lub w probówkach

•

Obecnie te metody stosowane są w

Obecnie te metody stosowane są w

ośrodkach referencyjnych

ośrodkach referencyjnych

•

W rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej

W rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej

wykorzystuje się gotowe panele

wykorzystuje się gotowe panele

biochemiczne np. API, ID, SCEPTOR lub

biochemiczne np. API, ID, SCEPTOR lub

systemy półautomatyczne i automatyczne

systemy półautomatyczne i automatyczne

Metody serologiczne

Metody serologiczne

i

i

biologii

biologii

molekularnej

molekularnej

•

Aglutynacja

Aglutynacja

•

Odczyny lityczne

Odczyny lityczne

•

Precypitacja

Precypitacja

•

Immunodyfuzja

Immunodyfuzja

•

Immunofluorescencja i metody radioimmunologiczne

Immunofluorescencja i metody radioimmunologiczne

•

Odczyny immunoenzymatyczne

Odczyny immunoenzymatyczne

•

Immunobloting

Immunobloting

•

PCR

PCR

•

Sondy genetyczne

Sondy genetyczne

•

Chipy

Chipy

Aglutynacja

Aglutynacja

•

Immunochemiczna, swoista agregacja

Immunochemiczna, swoista agregacja

cząstek (bakterie, grzyby, erytrocyty,

cząstek (bakterie, grzyby, erytrocyty,

syntetyczne koloidy) opłaszczonych

syntetyczne koloidy) opłaszczonych

antygenami lub przeciwciałami

antygenami lub przeciwciałami

•

Wyróżniamy aglutynację czynną

Wyróżniamy aglutynację czynną

(bezpośrednią) i bierną (pośrednią)

(bezpośrednią) i bierną (pośrednią)

Aglutynacja czynna

Aglutynacja czynna

•

P/ciała reagują bezpośrednio z Ag występującymi

P/ciała reagują bezpośrednio z Ag występującymi

naturalnie na powierzchni komórek

naturalnie na powierzchni komórek

•

Typy: typu H (Ag rzęskowy)

Typy: typu H (Ag rzęskowy)

typu O (Ag somatyczny)

typu O (Ag somatyczny)

typu Vi (Ag powierzchniowy)

typu Vi (Ag powierzchniowy)

•

Obecnie wykorzystywana przede wszystkim do

Obecnie wykorzystywana przede wszystkim do

typowania serologicznego bakterii

typowania serologicznego bakterii

•

Salmonella

Salmonella

spp. (odczyn Widala)

spp. (odczyn Widala)

•

Brucella spp.

Brucella spp.

(odczyn Wrighta)

(odczyn Wrighta)

•

Rikettsia prowazeki

Rikettsia prowazeki

(odczyn Weigla)

(odczyn Weigla)

•

+

+

Neisseria meningitidis, Shigella spp., Yersinia spp.,

Neisseria meningitidis, Shigella spp., Yersinia spp.,

Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa,

Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa,

Streptococcus agalactiae...

Streptococcus agalactiae...

Aglutynacja bierna

Aglutynacja bierna

•

Ag jest opłaszczony na nośniku np.

Ag jest opłaszczony na nośniku np.

lateksie, polistyrenie lub erytrocytach

lateksie, polistyrenie lub erytrocytach

•

Metoda stosowana

Metoda stosowana

•

do wykrywania czynnika reumatoidalnego

do wykrywania czynnika reumatoidalnego

(RF) i antystreptolizyny (ASO), antygenów

(RF) i antystreptolizyny (ASO), antygenów

bakteryjnych w materiale biologicznym

bakteryjnych w materiale biologicznym

•

do identyfikacji grupowej paciorkowców

do identyfikacji grupowej paciorkowców

Odczyny lityczne

Odczyny lityczne

•

Odczyn wiązania dopełniacza

Odczyn wiązania dopełniacza



Dopełniacz (surowica świnki morskiej) –

Dopełniacz (surowica świnki morskiej) –

ma zdolność hemolizy

ma zdolność hemolizy



Brak lizy krwinek świadczy o związaniu

Brak lizy krwinek świadczy o związaniu

dopełniacza przez poszukiwane p/ciała

dopełniacza przez poszukiwane p/ciała



Służy wykrywaniu swoistych p/ciał

Służy wykrywaniu swoistych p/ciał

(diagnostyka trądu, salmonellozy, zakazeń

(diagnostyka trądu, salmonellozy, zakazeń

pierwotniakowych, kiły - o. Wassermana)

pierwotniakowych, kiły - o. Wassermana)

Odczyny lityczne

Odczyny lityczne

•

Oznaczanie stężenia antystreptolizyny

Oznaczanie stężenia antystreptolizyny

O (ASO)

O (ASO)



obecność streptolizyny O (hemolizyna

obecność streptolizyny O (hemolizyna

Streptococcus pyogenes

Streptococcus pyogenes

) powoduje

) powoduje

powstawanie antystreptolizyny i

powstawanie antystreptolizyny i

zahamowanie lizy krwinek królika (układ

zahamowanie lizy krwinek królika (układ

wskaźnikowy)

wskaźnikowy)



Miano patognomiczne >200j.

Miano patognomiczne >200j.



Służy diagnostyce gorączki reumatycznej

Służy diagnostyce gorączki reumatycznej

Precypitacja

Precypitacja

•

Reakcja między precypityną, a precypitogenem,

Reakcja między precypityną, a precypitogenem,

które dyfundują w swoim kierunku

które dyfundują w swoim kierunku

•

W miejscach gdzie stężenie obu jest równe,

W miejscach gdzie stężenie obu jest równe,

powtałe kopleksy widoczne są gołym okiem (osad)

powtałe kopleksy widoczne są gołym okiem (osad)

•

odmianą jest immunodyfuzja – presypitacja w

odmianą jest immunodyfuzja – presypitacja w

elektrolicie zestalonym żelem (powstają prążki)

elektrolicie zestalonym żelem (powstają prążki)

oraz immunoelektroforeza

oraz immunoelektroforeza

•

Zastosowanie przy wykrywaniu toksyn błoniczych,

Zastosowanie przy wykrywaniu toksyn błoniczych,

toksyn rodziny

toksyn rodziny

Pseudomonas

Pseudomonas

, enterotoksyny

, enterotoksyny

E.

E.

Coli

Coli

oraz antygenów grzybiczych

oraz antygenów grzybiczych

Immunofluorescencja i

Immunofluorescencja i

metody radioimmunologiczne

metody radioimmunologiczne

•

Metody wykrywania Ag lub p/ciał przy pomocy

Metody wykrywania Ag lub p/ciał przy pomocy

odpowiednio p/ciał lub Ag znakowanych bądź

odpowiednio p/ciał lub Ag znakowanych bądź

barwnikiem fluoryzującym lub izotopami

barwnikiem fluoryzującym lub izotopami

•

Domeną tych metod jest wysoka czułość

Domeną tych metod jest wysoka czułość

•

Radioimmunologiczne

Radioimmunologiczne



J 125 służy ocenie poziomu hormonów,

J 125 służy ocenie poziomu hormonów,

immunoglobin, HBs, HBc

immunoglobin, HBs, HBc

•

Immunofuorescencja (bezpośrednia, pośrednia)

Immunofuorescencja (bezpośrednia, pośrednia)



świecenie fluorochromu ocenia sie w mikroskopie

świecenie fluorochromu ocenia sie w mikroskopie

fluorescencyjnym oznaczając obecność Ag

fluorescencyjnym oznaczając obecność Ag

Ch.

Ch.

trachomatis, T. gondii, CMV, P carini

trachomatis, T. gondii, CMV, P carini

lub p/ciał kiły,

lub p/ciał kiły,

M. pneumoniae, Ch. pneumoniae...

M. pneumoniae, Ch. pneumoniae...

Odczyny

Odczyny

immunoenzymatyczne

immunoenzymatyczne

•

Znacznikiem jest enzym

Znacznikiem jest enzym

•

Najważniejsz

Najważniejsz

test ELISA

test ELISA

(enzyme linked

(enzyme linked

immunosorbent test) pozwala na jakościowe i

immunosorbent test) pozwala na jakościowe i

ilosciowe oznaczenie antygenów i przeciwciał w

ilosciowe oznaczenie antygenów i przeciwciał w

materiale biologicznym

materiale biologicznym

•

Znany czynnik(Ag lub p/ciało) absorbuje na stałym

Znany czynnik(Ag lub p/ciało) absorbuje na stałym

podlożu – łaczy sie on z (odpowiednio)p/ciałem lub

podlożu – łaczy sie on z (odpowiednio)p/ciałem lub

Ag, do takiego kompleksu przyłącza się znakowana

Ag, do takiego kompleksu przyłącza się znakowana

enzymem antyglobulina. Dodaje sie substrat.

enzymem antyglobulina. Dodaje sie substrat.

Oznacza sie intensywnośc reakcji barwnej.

Oznacza sie intensywnośc reakcji barwnej.

•

Służy diagnostyce HSV, HBV, HCV, VZV, CMV, odra,

Służy diagnostyce HSV, HBV, HCV, VZV, CMV, odra,

świnka, mykoplazma, markery nowotworowe....

świnka, mykoplazma, markery nowotworowe....

Immunobloting

Immunobloting

•

4 etapy: elektroforeza białek,

4 etapy: elektroforeza białek,

przeniesienie prążków na membranę

przeniesienie prążków na membranę

nitrocelulozową, ikubacja z roztworem

nitrocelulozową, ikubacja z roztworem

swoistych p/ciał znakowanych enzymem,

swoistych p/ciał znakowanych enzymem,

inkubacja z substratem = reakcja barwna

inkubacja z substratem = reakcja barwna

•

Jest to rozszerzenie met. serologicznych

Jest to rozszerzenie met. serologicznych

wykazujące obecność swoistych Ag

wykazujące obecność swoistych Ag

różnych patogenów

różnych patogenów

Polimerazowa reakcja

Polimerazowa reakcja

amplifikacji

amplifikacji

•

Przy obecności dwóch starterów, w

Przy obecności dwóch starterów, w

podwyższonej temperaturze, dochodzi do

podwyższonej temperaturze, dochodzi do

denaturacji DNA. Startery wyznaczają odcinki

denaturacji DNA. Startery wyznaczają odcinki

swoiste gatunkowo, które są następnie

swoiste gatunkowo, które są następnie

powielene enzymatycznie. Tak

powielene enzymatycznie. Tak

zwielokrotniony odcinek jest oznaczany sondą

zwielokrotniony odcinek jest oznaczany sondą

i wykrywany w świetle UV. Już 10 kopii

i wykrywany w świetle UV. Już 10 kopii

genomu moze byc w ten sposób wykryte.

genomu moze byc w ten sposób wykryte.

•

Metody te służą wykrywaniu drobnoustrojów

Metody te służą wykrywaniu drobnoustrojów

wolnorosnących i niehodowlanych,

wolnorosnących i niehodowlanych,

oznaczaniu zdolności wytwarzania toksyn,

oznaczaniu zdolności wytwarzania toksyn,

wykrywaniu genów oporności na antybiotyki

wykrywaniu genów oporności na antybiotyki