Metody stosowane w
Metody stosowane w
diagnostyce
diagnostyce
mikrobiologicznej cz. II
mikrobiologicznej cz. II
Metody stosowane w
Metody stosowane w
diagnostyce
diagnostyce
mikrobiologicznej cz. II
mikrobiologicznej cz. II
Identyfikacja
Identyfikacja
drobnoustrojów
drobnoustrojów
•
Wstępna
Wstępna
•
Wynik barwienia metodą Grama
Wynik barwienia metodą Grama
•
Morfologia kolonii na podłożu stałym
Morfologia kolonii na podłożu stałym
•
Zdolność do wzrostu na określonych
Zdolność do wzrostu na określonych
podłożach wybiórczych i wybiórczo –
podłożach wybiórczych i wybiórczo –
różnicujących
różnicujących
•
Wymagania dotyczące gazowego składu
Wymagania dotyczące gazowego składu
środowiska
środowiska
•
Proste testy diagnostyczne
Proste testy diagnostyczne
Proste testy diagnostyczne
Proste testy diagnostyczne
•
Oznaczenie katalazy
Oznaczenie katalazy
•
Pozwala odróżnić drobnoustroje katalazo-
Pozwala odróżnić drobnoustroje katalazo-
dodatnie (np.
dodatnie (np.
Staphylococcus
Staphylococcus
spp,
spp,
Coryneforms
Coryneforms
) od katalazo-ujemnych (np.
) od katalazo-ujemnych (np.
Streptococcus
Streptococcus
spp.)
spp.)
•
Wykonanie: pobrać 1-2 kolonie bakteryjne i
Wykonanie: pobrać 1-2 kolonie bakteryjne i
nanieść na szkiełko podstawowe, dodać 1-2
nanieść na szkiełko podstawowe, dodać 1-2
krople 3% H
krople 3% H
2
2
O
O
2
2
pojawienie się pęcherzyków
pojawienie się pęcherzyków
gazu – wynik dodatni
gazu – wynik dodatni
•
Nie używać do oznaczenia hodowli na podłożu
Nie używać do oznaczenia hodowli na podłożu
krwawym
krwawym
Proste testy diagnostyczne
Proste testy diagnostyczne
•
Oznaczenie koagulazy związanej (Clumping
Oznaczenie koagulazy związanej (Clumping
Factor, CF)
Factor, CF)
•
CF (+)
CF (+)
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus
, CF(-) pozostałe
, CF(-) pozostałe
Staphylococcus
Staphylococcus
spp. (Coagulase-Negative
spp. (Coagulase-Negative
Staphylococci, CNS)
Staphylococci, CNS)
•
Wykonanie: Pobrać 1-2 kolonie bakteryjne,
Wykonanie: Pobrać 1-2 kolonie bakteryjne,
rozprowadzić na szkiełku podstawowym,
rozprowadzić na szkiełku podstawowym,
zawiesić w 0,9% NaCl i dodać osocza króliczego
zawiesić w 0,9% NaCl i dodać osocza króliczego
•
Pojawienie się „kłaczków” – wynik dodatni
Pojawienie się „kłaczków” – wynik dodatni
Proste testy diagnostyczne
Proste testy diagnostyczne
•
Oznaczenie koagulazy wolnej
Oznaczenie koagulazy wolnej
•
Koagulazo-dodatni – tylko
Koagulazo-dodatni – tylko
Staphylococcus
Staphylococcus
aureus
aureus
, koagulazo-ujemne – CNS
, koagulazo-ujemne – CNS
•
Wykonanie: 2-3 kolonie bakteryjne
Wykonanie: 2-3 kolonie bakteryjne
zawiesić w 0,5 ml osocza króliczego,
zawiesić w 0,5 ml osocza króliczego,
inkubować 4-12 h w temperaturze 37
inkubować 4-12 h w temperaturze 37
0
0
C
C
•
Pojawienie się skrzepu – wynik dodatni
Pojawienie się skrzepu – wynik dodatni
Proste testy diagnostyczne
Proste testy diagnostyczne
•
Oznaczenie oksydazy cytochromowej
Oznaczenie oksydazy cytochromowej
•
Stosuje się do różnicowania laktozo-
Stosuje się do różnicowania laktozo-
ujemnych pałeczek Gram-ujemnych
ujemnych pałeczek Gram-ujemnych
•
Oksydazo (+) np.
Oksydazo (+) np.
Pseudomonas
Pseudomonas
spp,
spp,
oksydazo (-) np.
oksydazo (-) np.
Stenotrophomonas
Stenotrophomonas
maltophilia
maltophilia
•
Wykonanie: kolonie bakteryjne polać
Wykonanie: kolonie bakteryjne polać
odczynnikiem Kovacsa
odczynnikiem Kovacsa
•
Pojawienie się fioletowego zabarwienia
Pojawienie się fioletowego zabarwienia
kolonii – wynik dodatni
kolonii – wynik dodatni
Proste testy diagnostyczne
Proste testy diagnostyczne
•
Wykrywanie indolu i ureazy
Wykrywanie indolu i ureazy
•
Przeprowadza się w podłożu MIR
Przeprowadza się w podłożu MIR
•
Drobnoustroje ureazo (+) w czasie wzrostu
Drobnoustroje ureazo (+) w czasie wzrostu
powodują zabarwienie podłoża na kolor
powodują zabarwienie podłoża na kolor
różowo-fioletowy
różowo-fioletowy
•
Wytwarzanie indolu – na powierzchnię
Wytwarzanie indolu – na powierzchnię
podłoża dodaje się odczynnika Jamesa –
podłoża dodaje się odczynnika Jamesa –
pojawienie się czerwonego pierścienia –
pojawienie się czerwonego pierścienia –
wynik dodatni
wynik dodatni
Proste testy diagnostyczne
Proste testy diagnostyczne
•
Test filamentacji
Test filamentacji
•
Służy do odróżnienia
Służy do odróżnienia
Candida albicans
Candida albicans
od
od
Candida non-albicans
Candida non-albicans
(
(
Candida
Candida
spp.)
spp.)
•
Wykonanie: 1-2 kolonie badanych
Wykonanie: 1-2 kolonie badanych
drożdżaków zawiesza się w surowicy,
drożdżaków zawiesza się w surowicy,
inkubacja 24 h, 37
inkubacja 24 h, 37
0
0
C
C
•
Obserwacja w mikroskopie: pojawienie się
Obserwacja w mikroskopie: pojawienie się
wypustków – wynik dodatni
wypustków – wynik dodatni
Proste testy diagnostyczne
Proste testy diagnostyczne
•
Izolacja z optochiną
Izolacja z optochiną
•
Służy do różnicowania paciorkowców alfa-
Służy do różnicowania paciorkowców alfa-
hemolizujących
hemolizujących
•
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pneumoniae
– wrażliwy na
– wrażliwy na
optochinę, pozostałe
optochinę, pozostałe
Streptococcus
Streptococcus
spp. -
spp. -
oporne
oporne
Proste testy diagnostyczne
Proste testy diagnostyczne
•
Ocena zapotrzebowania na czynniki
Ocena zapotrzebowania na czynniki
wzrostowe
wzrostowe
Haemophilus
Haemophilus
spp.
spp.
•
Haemophilus influenzae
Haemophilus influenzae
wymaga do wzrostu
wymaga do wzrostu
czynników V i X, a
czynników V i X, a
Haemophilus
Haemophilus
parainfluenzae
parainfluenzae
tylko czynnika V
tylko czynnika V
•
Na posiane podłoże Mueller - Hinton’a układa
Na posiane podłoże Mueller - Hinton’a układa
się dwa krążki diagnostyczne V i V+X
się dwa krążki diagnostyczne V i V+X
•
Wzrost wokół krążka pozwala na
Wzrost wokół krążka pozwala na
identyfikację
identyfikację
Identyfikacja w oparciu o
Identyfikacja w oparciu o
cechy biochemiczne
cechy biochemiczne
•
Bada się:
Bada się:
•
zdolność do wzrostu przy wykorzystaniu
zdolność do wzrostu przy wykorzystaniu
określonych substratów jako jedynego
określonych substratów jako jedynego
źródła węgla
źródła węgla
•
Wytwarzania określonych produktów ze
Wytwarzania określonych produktów ze
znanych substratów
znanych substratów
•
Wytwarzania gazu
Wytwarzania gazu
•
Fermentacji określonych cukrów
Fermentacji określonych cukrów
•
Wytwarzania określonych enzymów
Wytwarzania określonych enzymów
Identyfikacja w oparciu o
Identyfikacja w oparciu o
cechy biochemiczne
cechy biochemiczne
•
Dawniej stosowano szeregi biochemiczne
Dawniej stosowano szeregi biochemiczne
złożone z kilku – kilkunastu podłóż
złożone z kilku – kilkunastu podłóż
specjalnych na płytkach lub w probówkach
specjalnych na płytkach lub w probówkach
•
Obecnie te metody stosowane są w
Obecnie te metody stosowane są w
ośrodkach referencyjnych
ośrodkach referencyjnych
•
W rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej
W rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej
wykorzystuje się gotowe panele
wykorzystuje się gotowe panele
biochemiczne np. API, ID, SCEPTOR lub
biochemiczne np. API, ID, SCEPTOR lub
systemy półautomatyczne i automatyczne
systemy półautomatyczne i automatyczne
Metody serologiczne
Metody serologiczne
i
i
biologii
biologii
molekularnej
molekularnej
•
Aglutynacja
Aglutynacja
•
Odczyny lityczne
Odczyny lityczne
•
Precypitacja
Precypitacja
•
Immunodyfuzja
Immunodyfuzja
•
Immunofluorescencja i metody radioimmunologiczne
Immunofluorescencja i metody radioimmunologiczne
•
Odczyny immunoenzymatyczne
Odczyny immunoenzymatyczne
•
Immunobloting
Immunobloting
•
PCR
PCR
•
Sondy genetyczne
Sondy genetyczne
•
Chipy
Chipy
Aglutynacja
Aglutynacja
•
Immunochemiczna, swoista agregacja
Immunochemiczna, swoista agregacja
cząstek (bakterie, grzyby, erytrocyty,
cząstek (bakterie, grzyby, erytrocyty,
syntetyczne koloidy) opłaszczonych
syntetyczne koloidy) opłaszczonych
antygenami lub przeciwciałami
antygenami lub przeciwciałami
•
Wyróżniamy aglutynację czynną
Wyróżniamy aglutynację czynną
(bezpośrednią) i bierną (pośrednią)
(bezpośrednią) i bierną (pośrednią)
Aglutynacja czynna
Aglutynacja czynna
•
P/ciała reagują bezpośrednio z Ag występującymi
P/ciała reagują bezpośrednio z Ag występującymi
naturalnie na powierzchni komórek
naturalnie na powierzchni komórek
•
Typy: typu H (Ag rzęskowy)
Typy: typu H (Ag rzęskowy)
typu O (Ag somatyczny)
typu O (Ag somatyczny)
typu Vi (Ag powierzchniowy)
typu Vi (Ag powierzchniowy)
•
Obecnie wykorzystywana przede wszystkim do
Obecnie wykorzystywana przede wszystkim do
typowania serologicznego bakterii
typowania serologicznego bakterii
•
Salmonella
Salmonella
spp. (odczyn Widala)
spp. (odczyn Widala)
•
Brucella spp.
Brucella spp.
(odczyn Wrighta)
(odczyn Wrighta)
•
Rikettsia prowazeki
Rikettsia prowazeki
(odczyn Weigla)
(odczyn Weigla)
•
+
+
Neisseria meningitidis, Shigella spp., Yersinia spp.,
Neisseria meningitidis, Shigella spp., Yersinia spp.,
Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa,
Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa,
Streptococcus agalactiae...
Streptococcus agalactiae...
Aglutynacja bierna
Aglutynacja bierna
•
Ag jest opłaszczony na nośniku np.
Ag jest opłaszczony na nośniku np.
lateksie, polistyrenie lub erytrocytach
lateksie, polistyrenie lub erytrocytach
•
Metoda stosowana
Metoda stosowana
•
do wykrywania czynnika reumatoidalnego
do wykrywania czynnika reumatoidalnego
(RF) i antystreptolizyny (ASO), antygenów
(RF) i antystreptolizyny (ASO), antygenów
bakteryjnych w materiale biologicznym
bakteryjnych w materiale biologicznym
•
do identyfikacji grupowej paciorkowców
do identyfikacji grupowej paciorkowców
Odczyny lityczne
Odczyny lityczne
•
Odczyn wiązania dopełniacza
Odczyn wiązania dopełniacza
Dopełniacz (surowica świnki morskiej) –
Dopełniacz (surowica świnki morskiej) –
ma zdolność hemolizy
ma zdolność hemolizy
Brak lizy krwinek świadczy o związaniu
Brak lizy krwinek świadczy o związaniu
dopełniacza przez poszukiwane p/ciała
dopełniacza przez poszukiwane p/ciała
Służy wykrywaniu swoistych p/ciał
Służy wykrywaniu swoistych p/ciał
(diagnostyka trądu, salmonellozy, zakazeń
(diagnostyka trądu, salmonellozy, zakazeń
pierwotniakowych, kiły - o. Wassermana)
pierwotniakowych, kiły - o. Wassermana)
Odczyny lityczne
Odczyny lityczne
•
Oznaczanie stężenia antystreptolizyny
Oznaczanie stężenia antystreptolizyny
O (ASO)
O (ASO)
obecność streptolizyny O (hemolizyna
obecność streptolizyny O (hemolizyna
Streptococcus pyogenes
Streptococcus pyogenes
) powoduje
) powoduje
powstawanie antystreptolizyny i
powstawanie antystreptolizyny i
zahamowanie lizy krwinek królika (układ
zahamowanie lizy krwinek królika (układ
wskaźnikowy)
wskaźnikowy)
Miano patognomiczne >200j.
Miano patognomiczne >200j.
Służy diagnostyce gorączki reumatycznej
Służy diagnostyce gorączki reumatycznej
Precypitacja
Precypitacja
•
Reakcja między precypityną, a precypitogenem,
Reakcja między precypityną, a precypitogenem,
które dyfundują w swoim kierunku
które dyfundują w swoim kierunku
•
W miejscach gdzie stężenie obu jest równe,
W miejscach gdzie stężenie obu jest równe,
powtałe kopleksy widoczne są gołym okiem (osad)
powtałe kopleksy widoczne są gołym okiem (osad)
•
odmianą jest immunodyfuzja – presypitacja w
odmianą jest immunodyfuzja – presypitacja w
elektrolicie zestalonym żelem (powstają prążki)
elektrolicie zestalonym żelem (powstają prążki)
oraz immunoelektroforeza
oraz immunoelektroforeza
•
Zastosowanie przy wykrywaniu toksyn błoniczych,
Zastosowanie przy wykrywaniu toksyn błoniczych,
toksyn rodziny
toksyn rodziny
Pseudomonas
Pseudomonas
, enterotoksyny
, enterotoksyny
E.
E.
Coli
Coli
oraz antygenów grzybiczych
oraz antygenów grzybiczych
Immunofluorescencja i
Immunofluorescencja i
metody radioimmunologiczne
metody radioimmunologiczne
•
Metody wykrywania Ag lub p/ciał przy pomocy
Metody wykrywania Ag lub p/ciał przy pomocy
odpowiednio p/ciał lub Ag znakowanych bądź
odpowiednio p/ciał lub Ag znakowanych bądź
barwnikiem fluoryzującym lub izotopami
barwnikiem fluoryzującym lub izotopami
•
Domeną tych metod jest wysoka czułość
Domeną tych metod jest wysoka czułość
•
Radioimmunologiczne
Radioimmunologiczne
J 125 służy ocenie poziomu hormonów,
J 125 służy ocenie poziomu hormonów,
immunoglobin, HBs, HBc
immunoglobin, HBs, HBc
•
Immunofuorescencja (bezpośrednia, pośrednia)
Immunofuorescencja (bezpośrednia, pośrednia)
świecenie fluorochromu ocenia sie w mikroskopie
świecenie fluorochromu ocenia sie w mikroskopie
fluorescencyjnym oznaczając obecność Ag
fluorescencyjnym oznaczając obecność Ag
Ch.
Ch.
trachomatis, T. gondii, CMV, P carini
trachomatis, T. gondii, CMV, P carini
lub p/ciał kiły,
lub p/ciał kiły,
M. pneumoniae, Ch. pneumoniae...
M. pneumoniae, Ch. pneumoniae...
Odczyny
Odczyny
immunoenzymatyczne
immunoenzymatyczne
•
Znacznikiem jest enzym
Znacznikiem jest enzym
•
Najważniejsz
Najważniejsz
test ELISA
test ELISA
(enzyme linked
(enzyme linked
immunosorbent test) pozwala na jakościowe i
immunosorbent test) pozwala na jakościowe i
ilosciowe oznaczenie antygenów i przeciwciał w
ilosciowe oznaczenie antygenów i przeciwciał w
materiale biologicznym
materiale biologicznym
•
Znany czynnik(Ag lub p/ciało) absorbuje na stałym
Znany czynnik(Ag lub p/ciało) absorbuje na stałym
podlożu – łaczy sie on z (odpowiednio)p/ciałem lub
podlożu – łaczy sie on z (odpowiednio)p/ciałem lub
Ag, do takiego kompleksu przyłącza się znakowana
Ag, do takiego kompleksu przyłącza się znakowana
enzymem antyglobulina. Dodaje sie substrat.
enzymem antyglobulina. Dodaje sie substrat.
Oznacza sie intensywnośc reakcji barwnej.
Oznacza sie intensywnośc reakcji barwnej.
•
Służy diagnostyce HSV, HBV, HCV, VZV, CMV, odra,
Służy diagnostyce HSV, HBV, HCV, VZV, CMV, odra,
świnka, mykoplazma, markery nowotworowe....
świnka, mykoplazma, markery nowotworowe....
Immunobloting
Immunobloting
•
4 etapy: elektroforeza białek,
4 etapy: elektroforeza białek,
przeniesienie prążków na membranę
przeniesienie prążków na membranę
nitrocelulozową, ikubacja z roztworem
nitrocelulozową, ikubacja z roztworem
swoistych p/ciał znakowanych enzymem,
swoistych p/ciał znakowanych enzymem,
inkubacja z substratem = reakcja barwna
inkubacja z substratem = reakcja barwna
•
Jest to rozszerzenie met. serologicznych
Jest to rozszerzenie met. serologicznych
wykazujące obecność swoistych Ag
wykazujące obecność swoistych Ag
różnych patogenów
różnych patogenów
Polimerazowa reakcja
Polimerazowa reakcja
amplifikacji
amplifikacji
•
Przy obecności dwóch starterów, w
Przy obecności dwóch starterów, w
podwyższonej temperaturze, dochodzi do
podwyższonej temperaturze, dochodzi do
denaturacji DNA. Startery wyznaczają odcinki
denaturacji DNA. Startery wyznaczają odcinki
swoiste gatunkowo, które są następnie
swoiste gatunkowo, które są następnie
powielene enzymatycznie. Tak
powielene enzymatycznie. Tak
zwielokrotniony odcinek jest oznaczany sondą
zwielokrotniony odcinek jest oznaczany sondą
i wykrywany w świetle UV. Już 10 kopii
i wykrywany w świetle UV. Już 10 kopii
genomu moze byc w ten sposób wykryte.
genomu moze byc w ten sposób wykryte.
•
Metody te służą wykrywaniu drobnoustrojów
Metody te służą wykrywaniu drobnoustrojów
wolnorosnących i niehodowlanych,
wolnorosnących i niehodowlanych,
oznaczaniu zdolności wytwarzania toksyn,
oznaczaniu zdolności wytwarzania toksyn,
wykrywaniu genów oporności na antybiotyki
wykrywaniu genów oporności na antybiotyki