Diagnostyka molekularna w medycynie

Wydział Lekarski II rok
Osoba prowadząca: Dr n.biol. Anna Wawrocka

Diagnostyka molekularna chorób genetycznych

 Zmiany materiału genetycznego są submikroskopowe, dostępne do badania jedynie metodami biologii

molekularnej.

 Są to głównie choroby jednogenowe, ale również wieloczynnikowe i nowotworowe.

 Molekularne badania diagnostyczne pozwalają na szybką weryfikację rozpoznania klinicznego i

stanowią nowoczesną metodę diagnostyki wielu chorób uwarunkowanych genetycznie.

Izolacja DNA

- pełna krew obwodowa (limfocyty)
- komórki płynu owodniowego (AFC)

- komórki kosmówki (CVS)
- hodowle fibroblastów

- komórki epitelialne
- cebulki włosów

- plamy krwi, nasienia
- fragmenty tkanek

- szpik kostny

Metody izolacji DNA:

1. Izolacja DNA z zastosowaniem fenolu i chloroformu celem odbiałczenia preparatów
2. Izolacja DNA przebiegająca przez wysolenie białek z lizatów komórek
3. Izolacja DNA poprzez związanie z nośnikiem, odmycie zanieczyszczeń i uwolnienie DNA

Izolacja DNA z krwi obwodowej – metodą wysalania białek
Etapy:
1. Liza komórek bezjądrzastych
2. Liza leukocytów
3. Odbiałczanie
4. Wytrącanie DNA alkoholem

Hybrydyzacja (renaturacja) –
Tworzenie podwójnej helisy między komplementarnymi niciami DNA lub RNA pochodzącymi z różnych
źródeł. Oddziaływanie badanego fragmentu DNA i sondy molekularnej prowadzi do utworzenia hybrydu
(dupleksu) o dwuniciowej strukturze.
Metody hybrydyzacji molekularnej:
-Southern Blotting,
-DNA fingerprinting,
-Northern blotting,
-In situ hybridization (FISH).

Sondą molekularną mogą być:
-syntetyczne oligomery
-syntetyczne bądź naturalne geny lub ich fragmenty
-cDNA
-fragmenty chromosomów
-całe genomy bakteryjne
Sonda molekularna musi być zdenaturowana (jednoniciowa). Łączenie sondy molekularnej z docelowym
fragmentem kwasu nukleinowego zachodzi zgodnie z komplementarnością zasad.
Sonda jest wyznakowana radioaktywnie lub nieradioaktywnie np. fluorescencyjnie.

Hybrydyzacja typu Southern (ang. Southern blot hybridization) –
Stosowana najczęściej, dotyczy hybrydyzacji DNA-DNA. Ma na celu wyszukanie sekwencji DNA spośród
mieszaniny fragmentów otrzymanych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi.
Stosując hybrydyzację typu Southern można wykryć:
- rearanżacje genowe np. delecje albo insercje, większe od 50-100 pz (Dystrofia mięśniowa Duchenne’a)
-mutacje punktowe, które tworzą nowe lub zmieniają dotychczasowe miejsce restrykcyjne dla enzymu,
stosowanego do trawienia DNA

Hybrydyzacja typu Northern Blot (ang. Northern blot hybridization) – dotyczy hybrydyzacji RNA pacjenta
z sondą molekularną. Stosowana w celu badania ekspresji genów.

DNA Fingerprinting
W metodzie tej wykorzystuje się obecność w genomie polimorficznych sekwencji powtórzonych VNTR
(variable number of tandem repeats) – zmienna liczba tandemowych powtórzeń. W wyniku hybrydyzacji VNTR
z sondami molekularnymi rozpoznającymi jednocześnie kilkanaście loci otrzymuje się dla każdego osobnika
charakterystyczny obraz fragmentów DNA tzw. fingerprint, odcisk genetyczny
Zastosowanie:
-ustalanie ojcostwa
-badania medyczno-sądowe

PCR- (ang.polymerase chain reaction) reakcja łańcuchowa polimerazy

 Metoda PCR przyspieszyła uzyskiwanie wyników w pracach nad poznaniem struktury i funkcji genów.
 Kary Mullis zastosował termostabilną polimerazę w reakcji łańcuchowej polimerazy, w 1987r.
 Nagroda Nobla z chemii w 1993r.
 Reakcja ta odzwierciedla naturalny proces replikacji i umożliwia w warunkach in vitro szybkie

powielenie wybranych odcinków DNA lub RNA (przepisanego na cDNA przy użyciu reakcji odwrotnej
transkrypcji).

 Badana sekwencja DNA jest powielana przy użyciu pary oligonukleotydowych starterów, z których

każdy jest komplementarny do jednego końca sekwencji docelowej DNA. Startery te są wydłużane w
kierunku przeciwnym, za pomocą termostabilnej polimerazy DNA

 W cyklu który obejmuje trzy podstawowe etapy:

- denaturacja dwuniciowej matrycy – 90-95°C,
- wiązanie starterów do jednoniciowej matrycy 50-65°C,

- synteza nici komplementarnej 68-72°C
 Wizualizacja produktów PCR następuje poprzez rozdział elektroforetyczny. Cząsteczki DNA

umieszczone w żelu migrują w polu elektrycznym od ujemnie do dodatnio naładowanej elektrody, a ich
szybkość zależy od wielkości cząsteczki – im mniejsze tym szybciej będą się przesuwały w żelu.
Wybarwione bromkiem etydyny (mutagen interkalujący DNA) są widoczne po naświetleniu światłem
UV.

PCR-RFLP (ang. restriction fragments length polymorphism)
Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych. Polega ona na amplifikacji fragmentu DNA, w
obrębie którego występuje marker RFLP (fragment DNA zawierający miejsce restrykcyjne), a następnie jego
trawieniu odpowiednim enzymem restrykcyjnym.
Zastosowanie:
- identyfikacja mutacji punktowych w obrębie miejsca rozpoznawanego przez enzym restrykcyjny
Przykład: fenyloketonuria, anemia sierpowata, hemofilia

Multipleks PCR

 jednorazowo można amplifikować

ok.10 markerów

 można badać DNA zmieszany

i zdegradowany

Zastosowanie: duże mutacje genowe: delecje, duplikacje, insercje

Hybrydyzacja ASO (ang. allele specific oligonucleotide)

 polega na hybrydyzacji z sondą specyficzną

dla produktu PCR

 sonda rozpoznaje allel dziki (prawidłowy) lub zmutowany

Zastosowanie:
wykrywanie mutacji punktowych, które nie zmieniają miejsc restrykcyjnych
Przykład: głuchota wrodzona, mukowiscydoza

MSP-PCR - PCR specyficzny dla metylacji (ang.methylation specific PCR)

 Do wykrywania metylacji CpG w genomowym DNA
 Dwusiarczyn sodu przekształca niemetylowaną cytozynę na uracyl
 W celu uwidocznienia efektu metylacji, DNA modyfikuje się kwaśnym siarczynem sodowym

Porównanie próbki DNA poddanej działaniu dwusiarczynu i próbki normalnej ujawnia metylację
cytozyny

 PCR prowadzi się z dwoma zestawami starterów, specyficznymi dla kopii metylowanej i

niemetylowanej.

Przykłady: Zespół Pradera - Williego (PWS), Zespół Angelmana (AS)
U podstaw patogentycznych PWS znajduje się regulacja ekspresji genów nazywana

rodzicielskim piętnem

genomowym. PWS spowodowany jest brakiem aktywności genów w regionie chromosomu 15 pochodzącym od
ojca, które ulegają piętnowaniu (są nieaktywne) na chromosomie 15 pochodzącym od matki. Zmiany w DNA w
tym samym cytogenetycznie regionie, ale pochodzące od matki odpowiedzialne są za zespół Angelmana.

Wynik badania molekularnego dla pacjentów z zespołem PWS i AS:
Kontrola- obecność kopii matczynej i ojcowskiej
PWS - obecny tylko fragment pochodzący z kopii matczynej
AS - obecny tylko fragment pochodzący z kopii ojcowskiej

Sekwencjonowanie DNA, główne metody

 Metoda enzymatyczna – polimeraza DNA syntetyzuje komplementarną kopię matrycy DNA

 Metoda chemiczna – znakowany fragment DNA ulega reakcji ze związkami specyficznymi dla

poszczególnych zasad

Sekwencjonowanie DNA, metodą enzymatyczną

 Metoda enzymatyczna została opracowana przez Sangera i wsp. W 1977r.

 Opiera się na zdolności polimerazy DNA do wbudowywania 2’3’-dideoksynukleozydotrifosforanów

(ddNTP). Wbudowanie ddNTP (terminatora) powoduje zatrzymanie elongacji w miejscu A, C, G lub T.
W każdej reakcji stosowany jest tylko jeden nukleotyd terminujący.

QF-PCR (ang. Quantitive fluorescence polymerase chain reaction)

 QF-PCR znalazła zastosowanie w diagnostyce prenatalnej (wybranych aberracji chromosomowych).

Jest to ocena ilości kopii chromosomów 13, 18, 21, X i Y.

 Opiera się na wykorzystaniu jako markerów sekwencji STR (ang. short tandem repeats)

 Rutynowo źródłem DNA są amniocyty występujące w płynie owodniowym, pobieranym na drodze

amniopunkcji od około 13 tygodnia ciąży

 Startery do amplifikacji poszczególnych STR są znakowane fluorescencyjnie, odczyt odbywa się za

pomocą sekwenatora kapilarnego

PCR w czasie rzeczywistym – (ang. Real Time PCR)

 Metoda ilościowa oparta na amplifikacji DNA in vitro- opiera się na pomiarze liczby kopii DNA, przez

pomiar fluorescencji

Zastosowania aplikacji real-time PCR:

 Ilościowe określanie ekspresji genów
 Testowanie stabilności genetycznej
 Wydajność terapii lekowych/monitorowanie leków
 Ilościowe określanie DNA wirusowego

 Detekcja patogenów
 Uszkodzenia DNA (niestabilność mikrosatelitarna)
 Określanie czasu ekspozycji na promieniowanie
 Obrazowanie in vivo procesów komórkowych
 Studia nad DNA mitochondrialnym
 Detekcja metylacji
 Detekcja inaktywacji chromosomu X
 Genotypowanie, analiza krzywej topnienia kwasów nukleinowych
 Wykrywanie trisomii, poszczególnych kopii jednogenowych
 Wykrywanie mikrodelecji

Mikromacierze (ang. DNA microarray)- rodzaje

 Ze względu na rodzaj wykrywanych sekwencji -
 mikromacierze do badania ekspresji genów

 najczęściej stosowane - sondy w obrębie sekwencji mRNA
 mikromacierze eksonowe (sondy to sekwencje eksonów)
 mikromacierze pokrywajace genom (ang. tiling array)-do badania ekspresji obszarów

pozagenowych

 mikromacierze do badania splicingu (ang. splicing array)- badanie ekspresji różnych form

splicingowych tego samego genu

 mikromacierze do badania sekwencji genów (genotypowania)

 mikromacierze SNP - odróżnianie jednonukleotydowych polimorfizmów DNA

Mikromacierze typu SNP

 Zastosowanie mikromacierzy DNA typu SNP umożliwia analizę w pojedynczym eksperymencie nawet

kilkuset mutacji i polimorfizmów odpowiedzialnych za rozwój chorób genetycznych.

 Mikromacierze DNA wykorzystywane są do poznawania mechanizmów chorobotwórczych oraz oceny

ryzyka rozwoju chorób mających podłoże genetyczne.

Mikromacierze ekspresyjne

 Przykłady zastosowań

 Znajdowanie genów reagujących zmianą ekspresji na zmiany:

 w środowisku (np. podanie leku)
 w genotypie (np. obecność transgenu)

 Znajdowanie genów, których ekspresja różni się

 między tkankami
 podczas rozwoju
 w tkance chorej i zdrowej
 między gatunkami.