DIAGNOSTYKA

DIAGNOSTYKA

MOLEKULARNA

MOLEKULARNA

METODY MOLEKULARNE

METODY MOLEKULARNE



PCR

PCR



Hybrydyzacja

Hybrydyzacja



FISH

FISH



Sekwencjonowanie

Sekwencjonowanie

ŁAŃCUCHOWA REAKCJA

ŁAŃCUCHOWA REAKCJA

POLIMERAZY

POLIMERAZY

P

P

olimerase

olimerase C

C

hain

hain R

R

eaction (

eaction (PCR

PCR

)

)



Pozwala na powielenie dowolnej

Pozwala na powielenie dowolnej

sekwencji DNA o długości od kilkuset

sekwencji DNA o długości od kilkuset

do kilku tysięcy nukleotydów

do kilku tysięcy nukleotydów



Polega na przeprowadzeniu wielu

Polega na przeprowadzeniu wielu

cykli syntezy kwasu nukleinowego

cykli syntezy kwasu nukleinowego

z wykorzystaniem starterów

z wykorzystaniem starterów

flankujących określony odcinek DNA

flankujących określony odcinek DNA

MECHANIZM REAKCJI

MECHANIZM REAKCJI

CZYNNIKI:

CZYNNIKI:



Matryca DNA

Matryca DNA



Startery (primery)

Startery (primery)



dNTP (trójfosforany deoksynukleotydów)

dNTP (trójfosforany deoksynukleotydów)



Polimeraza DNA

Polimeraza DNA

IZOLACJA

IZOLACJA

1.

1.

Przygotowanie próbek krwi, skóry

Przygotowanie próbek krwi, skóry

itd.

itd.

2.

2.

Dezintegracja komórek – TRIZOL,

Dezintegracja komórek – TRIZOL,

Chloroform

Chloroform

3.

3.

Odwirowanie zanieczyszczeń

Odwirowanie zanieczyszczeń

4.

4.

Zamrożenie (- 80

Zamrożenie (- 80

0

0

C)

C)

STARTERY

STARTERY



Starterem

Starterem

nazywany jest oligonukleotyd

nazywany jest oligonukleotyd

zbudowany z 6 do 40 zasad nukleotydowych,

zbudowany z 6 do 40 zasad nukleotydowych,

którego sekwencja jest komplementarna z

którego sekwencja jest komplementarna z

badaną matrycą DNA lub RNA. Startery o

badaną matrycą DNA lub RNA. Startery o

długości ponad 18 nukleotydów w sposób

długości ponad 18 nukleotydów w sposób

wybiórczy mogą hybrydyzować z sekwencją

wybiórczy mogą hybrydyzować z sekwencją

komplementarną, jeśli nawet pojedyncze

komplementarną, jeśli nawet pojedyncze

kopie matrycy zmieszane są z milionami

kopie matrycy zmieszane są z milionami

innych cząsteczek DNA. Koniec 3'

innych cząsteczek DNA. Koniec 3'

przyłączonego startera wyznacza początek

przyłączonego startera wyznacza początek

replikacji DNA.

replikacji DNA.

CYKL PCR

CYKL PCR

1.

1.

Denaturacja DNA (92-96

Denaturacja DNA (92-96

0

0

C)

C)

2.

2.

Przyłączanie starterów do

Przyłączanie starterów do

matrycy (37-72

matrycy (37-72

0

0

C)

C)

3.

3.

Polimeryzacja DNA (72

Polimeryzacja DNA (72

0

0

C

C

)

)

DENATURACJA (> 90

DENATURACJA (> 90

0

0

C)

C)

PRZYŁĄCZANIE STARTERÓW

PRZYŁĄCZANIE STARTERÓW

(37-72

(37-72

0

0

C)

C)

Sekwencja du

plikowana

Sekwencja du

plikowana

Starter 1

Starter 2

5’

3’

5’

5’

3’

5’

3’

3’

WYDŁUŻANIE ŁAŃCUCHÓW

WYDŁUŻANIE ŁAŃCUCHÓW

(72

(72

0

0

C)

C)

Sekwencja du

plikowana

Sekwencja du

plikowana

Primer 1

Primer 2

5’

3’

5’

5’

3’

5’

3’

3’

Polimeraza

Taq DNA

Wolne nukleo

tydy

POWIELONA SEKWENCJA DNA

POWIELONA SEKWENCJA DNA

LICZBA KOPII SEKWENCJI DNA

LICZBA KOPII SEKWENCJI DNA

PODCZAS REAKCJI PCR

PODCZAS REAKCJI PCR

Cykle

Liczba łańcuchów

DNA
1

2

2

4

3

8

4

16

5

32

6

64

20

1,048,576

30

1,073,741,824

PROFIL TERMICZNY PCR

PROFIL TERMICZNY PCR

DENATURACJA

DENATURACJA

(ok. 1 minuty)

(ok. 1 minuty)

PRZYŁĄCZANIE

PRZYŁĄCZANIE

STARTERÓW

STARTERÓW

(ok. 30 sekund)

(ok. 30 sekund)

POLIMERYZACJA

POLIMERYZACJA

(ok. 30 sekund)

(ok. 30 sekund)

DENATURACJA

DENATURACJA

(ok. 1 minuty)

(ok. 1 minuty)

METODY DIAGNOSTYCZNE

METODY DIAGNOSTYCZNE

OPARTE NA PCR

OPARTE NA PCR



PCR

PCR



PCR MULTIPLEKSOWY

PCR MULTIPLEKSOWY

:

:

Równoczesna amplifikacja kilku

Równoczesna amplifikacja kilku

regionów genomu w jednej probówce

regionów genomu w jednej probówce

stosując różne pary starterów.

stosując różne pary starterów.

(Diagnostyka chorób genetycznych,

(Diagnostyka chorób genetycznych,

wykrywanie mutacji, wykrywanie

wykrywanie mutacji, wykrywanie

czynników zakaźnych)

czynników zakaźnych)



NESTED PCR

NESTED PCR

:

:

Dodanie zestawu nowych (bardziej

Dodanie zestawu nowych (bardziej

swoistych) starterów po

swoistych) starterów po

przeprowadzeniu wstępnej reakcji

przeprowadzeniu wstępnej reakcji

PCR.

PCR.

(Kontrola swoistości reakcji,

(Kontrola swoistości reakcji,

stworzenie sondy molekularnej z

stworzenie sondy molekularnej z

produktu PCR)

produktu PCR)



Real Time PCR

Real Time PCR

:

:

Analiza ilościowa badanego

Analiza ilościowa badanego

fragmentu genomu z

fragmentu genomu z

wykorzystaniem barwników

wykorzystaniem barwników

fluorescencyjnych (np. SYBR Green).

fluorescencyjnych (np. SYBR Green).

Po każdym cyklu barwnik łączy się z

Po każdym cyklu barwnik łączy się z

2-niciowym produktem, dzięki

2-niciowym produktem, dzięki

czemu możliwe jest określenie jego

czemu możliwe jest określenie jego

ilości (w czasie rzeczywistym).

ilości (w czasie rzeczywistym).



PCR-RFLP

PCR-RFLP

Produkt PCR jest poddawany procesowi

Produkt PCR jest poddawany procesowi

cięcia enzymami restrykcyjnymi, w

cięcia enzymami restrykcyjnymi, w

wyniku czego otrzymuje się fragmenty

wyniku czego otrzymuje się fragmenty

DNA różnej długości, które następnie

DNA różnej długości, które następnie

rozdziela się elektroforetycznie.

rozdziela się elektroforetycznie.

Już zmiana pojedynczego nukleotydu w

Już zmiana pojedynczego nukleotydu w

sekwencji rozpoznawanej przez enzym

sekwencji rozpoznawanej przez enzym

(restryktazę) spowoduje, że nie dokona

(restryktazę) spowoduje, że nie dokona

on rozcięcia DNA -> Inny rozkład

on rozcięcia DNA -> Inny rozkład

prążków w żelu .

prążków w żelu .



RT-PCR

RT-PCR

Umożliwia przeprowadzenie PCR-u na

Umożliwia przeprowadzenie PCR-u na

RNA:

RNA:

1 etap to odwrotna transkrypcja

1 etap to odwrotna transkrypcja

(przepisanie informacji z RNA na DNA,

(przepisanie informacji z RNA na DNA,

dzięki enzymowi: odwrotna

dzięki enzymowi: odwrotna

transkryptaza)

transkryptaza)

2 etap to standardowy PCR

2 etap to standardowy PCR

ODWROTNA TRANSKRYPCJA (RT-PCR)

ODWROTNA TRANSKRYPCJA (RT-PCR)

Stabilizator

(DTT)

Bufor

z jonami

(np. Mg)

Nukleotydy

(dNTP)

Odwrotna

transkryptaza

Wyizolowane

RNA

Mieszanina

RT-PCR

Stała temperatura
(37

0

C) w czasie 30

min.

Nazwa i pochodzenie

Nazwa i pochodzenie

enzymu

enzymu

Jon

Jon

aktywując

aktywując

y

y

Uwagi

Uwagi

Tth

Tth

Polymerase

Polymerase

<-

<- Th

Th

ermus

ermus t

t

hermophilus

hermophilus

Mn++

Mn++

Termostabilna, z jonami

Termostabilna, z jonami

Mg wykazuje aktywność

Mg wykazuje aktywność

polimerazy DNA

polimerazy DNA

MMuLV

MMuLV

Reverse Transcriptase

Reverse Transcriptase

<-

<- M

M

oloney

oloney Mu

Mu

rine

rine

L

L

eucemia

eucemia V

V

irus

irus

Mg++

Mg++

najpowszechniej

najpowszechniej

stosowana odwrotna

stosowana odwrotna

Transkryptaza

Transkryptaza

AMV

AMV

Reverse

Reverse

Transcriptase <-

Transcriptase <- A

A

vian

vian

M

M

yeloblastosis

yeloblastosis V

V

irus

irus

Mg++

Mg++

Coraz powszechniej

Coraz powszechniej

stosowana odwrotna

stosowana odwrotna

Transkryptaza

Transkryptaza

Cth

Cth

Polymerase Klenow

Polymerase Klenow

<- Fragment

<- Fragment

C

C

arbohydro

arbohydrot

t

hermus

hermus

h

h

ydrogenoformans

ydrogenoformans

Mg++

Mg++

Stosowana w mieszaninie

Stosowana w mieszaninie

z Taq polimerazą do

z Taq polimerazą do

jednostopniowej

jednostopniowej

reakcji

reakcji

RT-PCR

RT-PCR



ASYMETRYCZNY PCR

ASYMETRYCZNY PCR

:

:

Dodanie pary starterów z których jeden

Dodanie pary starterów z których jeden

zostaje całkowicie zużyty podczas pierwszych

zostaje całkowicie zużyty podczas pierwszych

cykli amplifikacji DNA.

cykli amplifikacji DNA.

(Produkt może być sondą molekularną w

(Produkt może być sondą molekularną w

reakcji hybrydyzacji lub matrycą w reakcji

reakcji hybrydyzacji lub matrycą w reakcji

sekwencjonowania.)

sekwencjonowania.)



AMPLIFIKACJA ALLELOSPECYFICZNA

AMPLIFIKACJA ALLELOSPECYFICZNA

:

:

Ważna jest tu komplementarność

Ważna jest tu komplementarność

nukleotydów przy końcach 3` primerów,

nukleotydów przy końcach 3` primerów,

ponieważ umożliwia ona elongację DNA przez

ponieważ umożliwia ona elongację DNA przez

polimerazę.

polimerazę.

(Badanie polimorfizmu alleli, punktowych

(Badanie polimorfizmu alleli, punktowych

mutacji, powiązań genetycznych, wyjaśnienie

mutacji, powiązań genetycznych, wyjaśnienie

działania substancji mutagennych,

działania substancji mutagennych,

wykrywanie genów sprzężonych z chorobami,

wykrywanie genów sprzężonych z chorobami,

badanie lekooporności mikroorganizmów

badanie lekooporności mikroorganizmów



ELEKTROFOREZA

ELEKTROFOREZA

Elektroforeza kwasów nukleinowych

Elektroforeza kwasów nukleinowych

obecnie przeprowadzana jest

obecnie przeprowadzana jest

głównie na żelach agarozowym i

głównie na żelach agarozowym i

akryloamidowym oraz w tzw.

akryloamidowym oraz w tzw.

płynnych (nisko

płynnych (nisko

spolimeryzowanych) żelach

spolimeryzowanych) żelach

akryloamidowych w kapilarach.

akryloamidowych w kapilarach.

ANALIZA PRODUKTÓW PCR

ANALIZA PRODUKTÓW PCR



JAK DZIAŁA?

JAK DZIAŁA?

DNA nałożony na żel agarozowy

DNA nałożony na żel agarozowy

zachowuje się jak ujemnie

zachowuje się jak ujemnie

naładowana cząsteczka o dużej

naładowana cząsteczka o dużej

masie. Wędruje w kierunku

masie. Wędruje w kierunku

anody (bieguna dodatniego), a

anody (bieguna dodatniego), a

migracja jest hamowana przez sieć

migracja jest hamowana przez sieć

agarozową proporcjonalnie do

agarozową proporcjonalnie do

wielkości cząsteczki DNA.

wielkości cząsteczki DNA.



ELEKTROFOREZA AKRYLOAMIDOWA

ELEKTROFOREZA AKRYLOAMIDOWA

Jest powszechnie, chociaż niesłusznie

Jest powszechnie, chociaż niesłusznie

uważana za bardziej precyzyjną od

uważana za bardziej precyzyjną od

agarozowej oraz (słusznie) za tańszą.

agarozowej oraz (słusznie) za tańszą.

Zaletami tego podłoża są niskie

Zaletami tego podłoża są niskie

koszta oraz możliwość wybarwiania

koszta oraz możliwość wybarwiania

rozdzielonych frakcji DNA poprzez

rozdzielonych frakcji DNA poprzez

srebrzenie, które daje wyraźne,

srebrzenie, które daje wyraźne,

widoczne gołym okiem i trwałe

widoczne gołym okiem i trwałe

obrazy

obrazy

.

.

ŻELE AKRYLOAMIDOWE

ŻELE AKRYLOAMIDOWE

Barwienie żeli

Barwienie żeli

może

może

być

być

przeprowadzane za pomocą bromku

przeprowadzane za pomocą bromku

etydyny lub innego, podobnego

etydyny lub innego, podobnego

barwnika (np. SYBR Gold, który jest o

barwnika (np. SYBR Gold, który jest o

wiele czulszy lecz znacznie droższy),

wiele czulszy lecz znacznie droższy),

natomiast w przypadku elektroforezy

natomiast w przypadku elektroforezy

kapilarnej szczególnie popularne jest

kapilarnej szczególnie popularne jest

wielokolorowe barwienie

wielokolorowe barwienie

fluorescencyjne, wykorzystujące

fluorescencyjne, wykorzystujące

wzbudzoną laserem fluorescencję

wzbudzoną laserem fluorescencję

wbudowanych w łańcuch DNA

wbudowanych w łańcuch DNA

fluorochromów.

fluorochromów.

PODSUMOWANIE:

PODSUMOWANIE:



PCR umożliwia kopiowanie DNA startując

PCR umożliwia kopiowanie DNA startując

z b małych ilości.

z b małych ilości.



Reakcja opiera się na cyklicznych

Reakcja opiera się na cyklicznych

zmianach temperatury środowiska

zmianach temperatury środowiska

reakcyjnego.

reakcyjnego.



Polimeraza DNA amplifikuje (kopiuje) DNA

Polimeraza DNA amplifikuje (kopiuje) DNA

przy współudziale starterów.

przy współudziale starterów.



Wyniki otrzymujemy najczęściej z

Wyniki otrzymujemy najczęściej z

wykorzystaniem elektroforezy.

wykorzystaniem elektroforezy.

HYBRYDYZACJA

HYBRYDYZACJA

Wykorzystuje sondy molekularne

Wykorzystuje sondy molekularne

(kwas nukleinowy o określonej

(kwas nukleinowy o określonej

sekwencji), będące odcinkami

sekwencji), będące odcinkami

komplementarnymi do szukanych

komplementarnymi do szukanych

fragmentów genomu.

fragmentów genomu.



Technika, która pozwoliła na wierne

Technika, która pozwoliła na wierne

przeniesienie DNA z żelu na podłoże

przeniesienie DNA z żelu na podłoże

umożliwiające wykonanie hybrydyzacji, nosi

umożliwiające wykonanie hybrydyzacji, nosi

nazwę

nazwę Southern blot

Southern blot

. Nazwa tej techniki

. Nazwa tej techniki

pochodzi od nazwiska jej wynalazcy, E.M.

pochodzi od nazwiska jej wynalazcy, E.M.

Southerna, oraz od pomysłu polegającego

Southerna, oraz od pomysłu polegającego

na wykorzystaniu zjawiska włosowatości dla

na wykorzystaniu zjawiska włosowatości dla

wymuszenia wędrówki DNA, podobnie jak

wymuszenia wędrówki DNA, podobnie jak

przy wciąganiu plamy wody przez bibułę.

przy wciąganiu plamy wody przez bibułę.

Biolodzy molekularni szybko nazwali

Biolodzy molekularni szybko nazwali

transfer rozdzielonego elektroforetycznie

transfer rozdzielonego elektroforetycznie

RNA -

RNA - Northern blot

Northern blot

, a transfer białka -

, a transfer białka -

Western blot

Western blot

.

.

HYBRYDYZACJA

HYBRYDYZACJA

METODĄ SOUTHERN BLOT

METODĄ SOUTHERN BLOT

Mikromacierz
nylonowa
8 x 12 cm

Mikromacierz
nylonowa
(powiększenie)
4 x 5 mm





Nowoczesne
mikromacierze

Powiększeni
e



SONDY MOLEKULARNE

SONDY MOLEKULARNE

SONDY MOLEKULARNE

SONDY MOLEKULARNE



HYBRYDYZACJA

HYBRYDYZACJA

in situ

in situ

(FISH)

(FISH)

Pozwala zlokalizować sekwencję

Pozwala zlokalizować sekwencję

kwasu nukleinowego w komórce lub

kwasu nukleinowego w komórce lub

odpowiednim rejonie chromosomu.

odpowiednim rejonie chromosomu.

Znakomita większość sond

Znakomita większość sond

wykorzystywanych w metodzie FISH

wykorzystywanych w metodzie FISH

znakowana jest bezpośrednio

znakowana jest bezpośrednio

fluorochromem. Najczęściej

fluorochromem. Najczęściej

stosowanymi fluorochromami są

stosowanymi fluorochromami są

fluoresceina (FITC), rodamina,

fluoresceina (FITC), rodamina,

czerwień teksańska (Texas Red) i

czerwień teksańska (Texas Red) i

Aqua (DEAC).

Aqua (DEAC).

Obraz
chromosomów
komórek linii raka
prostaty



Metoda M-FISH
Hybrydyzacja
in situ multipleksowa



Hybrydyzacja

Hybrydyzacja

in situ

in situ

genu

genu

Pax3

Pax3

(zarodek myszy)

(zarodek myszy)

Hybrydyzacja

Hybrydyzacja

in situ

in situ

gadzich

gadzich

komórek wątroby

komórek wątroby

(wykrywanie adenowirusów)

(wykrywanie adenowirusów)

SEKWENCJONOWANIE

SEKWENCJONOWANIE

Polega na określeniu sekwencji nukleotydów w

Polega na określeniu sekwencji nukleotydów w

łańcuchu DNA

łańcuchu DNA

Metoda chemiczna

Metoda chemiczna

– chemiczne

– chemiczne

rozszczepianie

rozszczepianie

kolejnych

kolejnych

nukleotydów

nukleotydów

badanego

badanego

fragmentu DNA.

fragmentu DNA.

Metoda enzymatyczna (Sangera)

Metoda enzymatyczna (Sangera)

–

–

synteza komplementarnej nici DNA

synteza komplementarnej nici DNA

na matrycy wykorzystująca system

na matrycy wykorzystująca system

znakowania trójfosforanów czterech

znakowania trójfosforanów czterech

dideoksynukleotydów

dideoksynukleotydów

fluorochromami w czterech różnych

fluorochromami w czterech różnych

kolorach oraz PCR, są 3 warianty:

kolorach oraz PCR, są 3 warianty:

1.

1. Dye Primer Sequencing

Dye Primer Sequencing

- przeprowadza się cztery

- przeprowadza się cztery

niezależne reakcje PCR z czterema porcjami

niezależne reakcje PCR z czterema porcjami

primera, każda porcja znakowana jest

primera, każda porcja znakowana jest

fluorochromem w innym kolorze. Produkty

fluorochromem w innym kolorze. Produkty

czterech reakcji miesza się i analizuje wspólnie.

czterech reakcji miesza się i analizuje wspólnie.

2.

2. Cycle Sequencing

Cycle Sequencing

- startuje się z bardzo małą

- startuje się z bardzo małą

ilością DNA, przeprowadza reakcję PCR, a po

ilością DNA, przeprowadza reakcję PCR, a po

każdej denaturacji termicznej uzyskuje się coraz

każdej denaturacji termicznej uzyskuje się coraz

dłuższy łańcuch zakończony znakowanym

dłuższy łańcuch zakończony znakowanym

nukleotydem.

nukleotydem.

3.

3. Dye Terminator Sequencing

Dye Terminator Sequencing

- używa się mieszanki

- używa się mieszanki

nie znakowanych trójfosforanów nukleotydów i

nie znakowanych trójfosforanów nukleotydów i

znakowanych trójfosforanów dideoksynukleotydów.

znakowanych trójfosforanów dideoksynukleotydów.

Była stosowana przez konkurujące zespoły

Była stosowana przez konkurujące zespoły

naukowe które z sukcesem zakończyły

naukowe które z sukcesem zakończyły

sekwencjonowanie genomu człowieka.

sekwencjonowanie genomu człowieka.

Starter komplementarny do matrycy DNA

3’

5’

5’

3’

GCCTAGGGTTTGCGCTAC

Wydłużanie startera przy użyciu polimerazy DNA

CGGATCCCAAACGCGATG

CAGGCATGCAATGACC

Schemat automatycznego sekwencjonowania DNA

dATP
dGTP
dTTP
dCTP

ddCTP

ddTTP

ddATP
ddGTP

Terminatory

znakowane
fluorescencyjnie



dd

G

GTdd

C

Gdd

T

GTCCdd

G

GTCdd

C

GTCCGdd

T

GTCCGTdd

A

GTCCGTACdd

G

GTCCGTAdd

C

GTCCGTACGdd

T

GTCCGTACGTdd

T

GTCCGTACGTTdd

A

GTCCGTACGTTAdd

C

GTCCGTACGTTACdd

T

GTCCGTACGTTACTdd

G

GTCCGTACGTTACTGdd

G

Lase

r

Detektor

Rozdział produktów reakcji w
automatycznym sekwenatorze

Metoda

Metoda

Sangera

Sangera

Typowe obrazy wyświetlane

Typowe obrazy wyświetlane

przez sekwencjonometr

przez sekwencjonometr

-

=

=

*

*

=

=

-