Choroby prionowe u ludzi i zwierząt
Gąbczaste encefalopatie ludzi i zwierząt mają wspólne źródło, są śmiertelnymi chorobami występującymi u różnych gatunków ssaków. Obejmują grupę chorób zwyrodnieniowych ośrodkowego układu nerwowego owiec, kóz i muflonów- trzęsawka (scrapie), kotów (FSE), psów (DSE) czy norek (MSE). U ludzi w tej grupie znajdują się zespół Gertsmanna--Strausslera-Scheinkera (GSS), śmiertelna bezsenność rodzinna (FFI), choroba kuru, choroba Creutzfeldta-Jacoba (CJD) z jej wariantami vCJD i nvCVJD. Choroby prionowe charakteryzują się długim okresem inkubacji od kilku miesięcy do nawet kilkudziesięciu lat. Wspólnymi symptomami chorób prionowych są: gąbczaste zwyrodnienie w korze, móżdżku i jądrach podkorowych, zaburzenia równowagi oraz kłopoty z koordynacją, otępienia psychiczne, problemy z pamięcią. Objawiają się zaburzeniami koordynacji i otępieniem. Obecnie posiadają statut chorób nieuleczalnych.
Scrapie- objawy i przyczyny:
Jest to choroba przewlekła (trwa od 2 do 12 miesięcy, najczęściej około pół roku), o długim okresie inkubacji (od 3 miesięcy do 3-4 lat). Pierwszymi objawami są występujące sporadycznie i powtarzające się zmiany w zachowaniu (nagłe pokładanie się, atakowanie psów i przeszkód). Zwierzęta mimo zachowanego apetytu tracą kondycję. U kóz rzadko występuje świąd (charakterystyczny w przebiegu choroby u owiec). Zwierzęta poruszają się w charakterystyczny sposób. Chód staje się podobny do galopu, ogon jest podniesiony do góry. Chore zwierzęta tracą równowagę i upadają. Obserwuje się przemijające napady konwulsji, podniecenie, drżenia mięśniowe, zaburzenia w połykaniu, wymioty. Głos zmienia się, staje się drżący. Istotne zmiany chorobowe dotyczą głównie OUN. Obserwuje się blaszki amyloidowe głównie w przodomózgowiu oraz pniu mózgu. Występuje także obustronnie symetryczna, silna wakuolizacja komórek nerwowych oraz ich zanik.
Polimorfizm w locus genu Prp u owiec
Gen Prp u owiec zlokalizowano na chromosomie 13. i wyróżnia się w nim trzy egzony o wielkości odpowiednio 52, 98, 4028 pz, przedzielone dwoma intronami. W ostatnich latach udowodniony został istotny związek polimorfizmu w kodonach 136, 154 i 171 z podatnością owiec na zachorowanie na scrapie. Stwierdzono, że obecność alaniny w kodonie 136 wiąże się z opornoscią na trzęsawkę, natomiast waliny z podatnoścą na tę chorobę. Występowanie argininy w kodonie 154 związane jest z podatnością, a histydyny z częściową odpornością. Arginina w 171 kodonie zwiększa odporność, natomiast obecność w tym miejscu histydyny lub glutaminy związana jest z podatnością na tę chorobę.
Klasyfikacja owiec uwzględniająca podatność na zachorowanie, programy zwalczania scrapie
Piętnaście podstawowych genotypów PrP podzielono na pięć grup oporności/podatności owiec na scrapie. Jeden z najczęściej stosowanych podziałów to pięć grup oporności/podatności według klasyfikacji podanej przez DEFRA (2006), od G1 do G5, gdzie grupa G1 oznacza osobniki o najwyższej genetycznie ustalonej oporności, czyli owce o genotypie: ARR/ARR. Natomiast grupa G5 skupia osobniki o genotypach najbardziej podatnych na trzęsawkę: AHQ/VRQ, ARH/VRQ, ARQ/VRQ i VRQ/VRQ. Do klas pośrednich G2, G3 i G4 zaliczamy odpowiednio genotypy G2 -
ARR/AHQ, ARR/ARH, ARR/ARQ, G3 – AHQ/AHQ, AHQ/ARH, AHQ/ARQ, ARH/ARH,
ARQ/ARH, ARQ/ARQ i G4 – ARR/VRQ.
Hodowla owiec mająca na celu podwyższenie oporności zwierząt na trzęsawkę, oparta
o wyniki testów DNA, jest obecnie wymogiem stawianym krajom członkowskim przez
Komisję Europejską. W 2001 roku Parlament UE ustanowił reguły prawne dotyczące
zapobiegania, kontroli i zwalczania pasażowalnych encefalopatii gąbczastych (WE, 2001). Jej celem jest zapobieganie powtarzaniu się kryzysów żywnościowych, takich jak w latach 90., i zapewnienie wysokiego poziomu zdrowia publicznego i bezpieczeństwa żywności. W
2003 roku Komisja Europejska ustanowiła obowiązkowe wprowadzenie kojarzeń
ukierunkowanych na zwiększanie genetycznej oporności na trzęsawkę w każdej z ras owiec w
Europie, czyli zwiększenie frekwencji genotypu ARR/ARR. Każde z państw członkowskich przeprowadzi roczny program monitorujący trzęsawkę owiec, obejmujący procedury przesiewowe z zastosowaniem szybkich testów. Przepisy zakazują stosowania białek zwierzęcych oraz pasz zawierających takie białka w żywieniu przeżuwaczy. W przypadku oficjalnego stwierdzenia obecności TSE stosuje się w przypadku potwierdzenia BSE u owiec i kóz, ubój i całkowite zniszczenie wszystkich owiec i kóz w stadzie.
Syndrom DUMPS
Określa się go mianem genu zamieralności zarodków – zarodki homozygotyczne pod względem tego genu recesywnego obumierają w drogach rodnych krowy po około 35 dniach od jej zacielenia. W efekcie tego krowa wchodzi w kolejny cykl rujowy, a więc okazuje się nie cielna mimo opuszczenia jednej rui. U heterozygot brak widocznego szkodliwego oddziaływania. Zamiana C na T powoduje utworzenie na mRNA kodonu stop, skutkiem jest utrata aktywności syntazy urydynomonofosforanu. Wczesne wykrywanie nosicieli mutacji DUMPS za pomocą testu PCR-RFLP. Ze względu na letalny efekt zmutowanego genu w układzie homozygotycznym, niemożliwa jest analiza DNA osobników homozygotycznych DP/DP. Prowadzone są jednak badania blastocyst przewidzianych do embriotransferu pochodzących z kojarzeń osobników heterozygotycznych. Dzięki metodzie RFLP możliwe jest oznaczenie odmienności fragmentów kodu genetycznego pochodzącego od różnych osobników, pociętych specyficznymi enzymami restrykcyjnymi. Odmienność ta polega na różnicach w długości fragmentów DNA, które powstają w wyniku mutacji, powodowanych przez tworzenie lub usuwanie miejsc rozpoznanych przez określone enzymy.
Syndrom BLAD
Wrodzony niedobór leukocytarnych cząsteczek adhezyjnych wywołujący zanik immunologicznych funkcji neutrofilów. W konsekwencji zwierzęta z tą wadą cierpią na częste powtarzające się infekcje bakteryjne.
Zwykle obserwuje się obniżoną masę ciała (60%normy), a długość życia nie przekracza zazwyczaj 10-14 miesięcy.
Normalny gen CD18 określa się jako allel TL
Zmutowany gen D128G jako allel BL. Mutacja punktowa A>G (zmienia kwas asparaginowy na glicynę w128 pozycji sekwencji aminokwasów)
Syndrom BLAD występuje u homozygot recesywnych
Krowy nosicielki (heterozygoty) produkują średnio o 218kg mleka oraz o 7,3g białka więcej niż ich półsiostry o normalnym genotypie, dlatego sprzyja to rozpowszechnianiu się tej mutacji w populacji,
MSUD- choroba syropu klonowego jest letalną, autosomalna cechą recesywną. Zapach moczu chorych osobników, zawiera metabolity rozgałęzionych aminokwasów o charakterystycznym zapachu syropu klonowego.
Przyczyną schorzenia jest niedobór enzymu aktywnej dehydrogenazy rozgałęzionych ketokwasów (BCKADH). Cechą charakterystyczną choroby MSUD jest szybko rozwijająca się dysfunkcja centralnego systemu nerwowego, prowadzącą do śmierci zwierzęcia w ciągu kilku dni po urodzeniu. U cieląt opisywanych jako normalne przy urodzeniu, w ciągu 12 do 48 godzin obserwowano wystąpienie braku koordynacji ruchowej, niezdolność do wstawania, ospałość przechodzącą w śpiączkę, kończącą się śmiercią zwierzęcia w czasie 48 do 72 godzin. Opracowane testy molekularne oparte na analizie DNA, umożliwiają wykrywanie heterozygotycznych nosicieli tych mutacji.
PP- protoporfiria jest schorzeniem dziedziczącym się jako cecha recesywna. Charakteryzuje się ona obniżoną o około 10 do 15% aktywnością mitochondrialnego enzymu ferrochelatazy, przy jednoczesnym wzroście poziomu protoporfiryny w erytrocytach krwi i kale chorych zwierząt. Głównym klinicznym objawem protoporfirii jest nadwrażliwość na światło. U cieląt cierpiących na ten defekt, obserwowano między innymi utratę sierści oraz rozwój wrzodów na powierzchniach ciała bez pigmentu i okrywy włosowej (uszy, nozdrza), wystawionych na działanie światła słonecznego. Następstwem chronicznego zapalenia skóry występującego u niektórych zwierząt dotkniętych chorobą był ich słabszy rozwój i postępujące wyniszczenie organizmu. Skutkowało to często koniecznością wcześniejszej eliminacji takich osobników z hodowli. Protoporfiria występuje głównie u czystorasowego bydła limousine oraz mieszańców z udziałem tej rasy, a także u bydła blonde d’aquitaine. W 1998 roku wykryto mutację przyczynową G1250T w genie ferrochelatazy odpowiedzialną za syntezę nieprawidłowego enzymu ferrochelatazy o obniżonej aktywności katalitycznej oraz opracowano test molekularny do jej identyfikacji.
CVM
Mutacja w genie SLC35A3
Zespół zniekształceń kręgosłupa (CVM; Complex Vertebral Malformation) stanowi zespół wrodzonej deformacji kręgów kręgosłupa u cieląt. Do typowych objawów klinicznych należą zniekształcenia kręgosłupa, charakterystyczna krótka szyja, zmiany w uformowaniu kończyn przejawiające się wykręconymi i sztywnymi pęcinami. Chore osobniki rodzą się najczęściej martwe, a ich waga urodzeniowa jest zdecydowanie niższa niż cieląt zdrowych. CVM może również objawiać się zamieraniem zarodków, resorpcją płodu, poronieniami w różnych okresach ciąży. Występuje u homozygot recesywnych.
Budowa genu organizmów eukariotycznych
Każdy organizm ma genom zawierający informacje biologiczna, potrzebna do powstania tego organizmu i utrzymania go przy życiu. Większość genomów zbudowana jest z DNA (kwas deoksyrybonukleinowy) ale niektóre wirusy mają genomy zbudowane z RNA( kwasu rybonukleinowego). Informacja biologiczna zawarta w genomie eukariotycznym jest zakodowana w sekwencji nukleotydowej DNA, informacja ta dzieli się na odrębne jednostki nazwane genami. Informacja zawarta w genie jest odczytywana przez białka, które przyłączają się do genomu w określonych miejscach, rozpoczynając tym samym szereg procesów biochemicznych, składających się na ekspresje genu. Proces ekspresji genu składa się z wielu etapów. Replikacja jest procesem powielającym DNA, zwykle w sposób semikonserwatywny, w wyniku czego otrzymane są dwie cząsteczki DNA zawierające jedną nic stara i jedna nić nową; transkrypcja, polega na wytworzeniu kopii genu zbudowanej z RNA, oraz translacja, polega na syntezie białka, którego sekwencje aminokwasową określa sekwencja nukleotydowa transkryptu genu za pośrednictwem kodu genetycznego.
Regulacja ekspresji genu
Ekspresja genu - proces, w którym informacja genetyczna zawarta w genie zostaje odczytana i przepisana na jego produkty, które są białkami lub różnymi formami RNA.
REGULACJA EKSPRESJI GENU – to złożony wieloczynnikowy proces. Na każdym z etapów ekspresja genu może być regulowana za pomocą różnych mechanizmów. Ekspresja genu zależy od rodzaju komórki, fazy rozwoju organizmu, metabolicznego – fizjologicznego stanu komórki. Regulacja ekspresji genów stwarza możliwości szybkiego reagowania na zmieniające się warunki środowiska, w którym żyje komórka. Przebieg tego procesu kontrolowania ekspresji genu różni się nieco pomiędzy bakteriami i eukariotami. U bakterii geny są zwykle zorganizowane w grupy genów zwane operonami (np. operon laktozowy), które są regulowane jako grupa i przepisywane na zawierający kilka genów mRNA. U eukariotów regulacja oraz przepisywanie na mRNA odnosi się do pojedynczego genu. Proces ten zachodzi w kilku etapach (Eukariota, w uproszczeniu, dla genu kodującego białko):
Wyjaśnij co to jest marker
Jest to polimorficzna sekwencja DNA (specyficzna) z jednego miejsca na chromosomie, używana do mapowania genetycznego, może być związana z fenotypem. Wyróżniamy markery I klasy- fenotypowe i markery II klasy- markery genetyczne. Charakterystyczna właściwość organizmu wykorzystywana do określenia jego genotypu. Zwykle jest to obecność lub brak jakiegoś genu lub białka, albo występowanie jakiejś szczególnej jego postaci. Markery genetyczne znajdują też zastosowanie do identyfikowania osób lub osobników zwierząt czy roślin, identyfikowania gatunków i szczepów drobnoustrojów oraz do określania wzajemnego położenia poszczególnych genów w genomie jakiegoś organizmu (mapowania genomu). Cechy: polimorfizm, neutralność, informatywność, dziedziczą się kodominacyjnie, bez epistazy i współdziałania genów, przekazywana potomstwu bez zmian
Opisz wykorzystanie markerów genetycznych w hodowli zwierząt
Markery genetyczne znajdują zastosowanie w pracy hodowlanej między innymi w kontroli pochodzenia, ocenie wartości genetycznej zwierząt pod kątem cech użytkowych i selekcji pośredniej, tzw. MAS, ocenie zmienności genetycznej wewnątrz i między (liniami) oraz szacowaniu dystansu genetycznego. Informacje o umiejscowieniu loci markerów genetycznych znajdują się
w markerowych mapach genomu. Kontrola pochodzenia u zwierząt od wielu lat jest prowadzona na podstawie układów grupowych krwi i polimorficznych białek, czyli markerów genetycznych klasy I.
Mutacja- nagła, skokowa, bezkierunkowa, dziedzicząca się lub niedziedzicząca, zmiana w materiale genetycznym organizmu. Mutacja jest zjawiskiem losowym, podlegającym jednak wpływom środowiska (mutagenom - np. chemicznym, promieniowaniu). Częstość mutacji nie jest stała pomiędzy gatunkami i zależy między innymi od doskonałości aparatu powielania DNA i jego naprawy.
Ze względu na mechanizm wyróżnia się trzy główne rodzaje mutacji:
mutacje genowe zwane także nukleotydowymi (zmiany na poziomie pojedynczych nukleotydów): Delecja, Insercja, Substytucja: Tranzycja,Transwersja
mutacje genomowe dotyczące zmiany liczby chromosomów
substytucja- zastępowanie jednej zasady azotowej inna zasadą
delecja- wypadnięcie jednej lub kilku par nukleotydów
insercja- wstawienie jednej lub kilku par nukleotydów
Mutacja nonsensowna- powoduje powstawanie nowych kodonów „stop” i powoduje skracanie produktów białkowych.
Mutacja cicha- występuje w niekodującej lub nieregulatorowej części DNA albo w trzeciej pozycji kodonu, co często nie powoduje zmian w sekwencji aminokwasów wbudowywanych do białka.
Transwersja- rodzaj mutacji genowej (punktowej). Polega ona na zamianie zasady purynowej na pirymidynową lub odwrotnie, np. G na C lub C na A.
Transkrypcja-przepisywanie informacji genetycznej z DNA na RNA. Powstaje cząsteczka RNA komplementarna do jednej z nici DNA. Niezbędne do tej syntezy są trifosforany nukleozydów.Transkrypcja jest kontrolowana przez polimerazę RNA. W komórce eukariotycznej zachodzi w jądrze komórkowym, mitochondriach i plastydach. U Procaryota w cytoplazmie. Jeden z procesów biosyntezy białka.
Translacja- Jeden z procesów biosyntezy białka. Jest to proces syntezy łańcucha polipeptydowego białek na matrycy mRNA. W jego wyniku dochodzi do ostatecznego przetłumaczenia informacji genetycznej zawartej pierwotnie w kodzie genetycznym DNA na konkretną strukturę białka, zależną od uszeregowania aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym.
Przyczyny mutacji i źródło ich powstawania
Mutacje mogą zachodzić spontanicznie, jako skutek pomyłek zachodzących podczas replikacji. Przyczyną takich zmian bywają błędy polimerazy, która ze względu na obniżoną skuteczność selekcji nukleotydów oraz ograniczone zdolności naprawcze wbudowuje w nowozsyntetyzowaną nić niekomplementarne cząstki. Innym powodem jest tzw. tautomeria zasad azotowych, czyli występowanie form iminowych (z grupą iminową =NH zamiast aminowej –NH2) oraz enolowych (z grupą enolową =C-OH zamiast ketonowej –CO), które choć nie zaburzają struktury podwójnej helisy, tworzą wiązania z innymi niż normalnie zasadami (tymina łączy się w parę z guaniną, adenina zaś z cytozyną) i przyczyniają się do powstawania drobnych mutacji punktowych.
Zmiany w informacji genetycznej mogą być również indukowane, tzn. wywołane obecnością czynników mutagennych, działających na cząsteczkę DNA w sposób pośredni lub bezpośredni.
Czynniki fizyczne:
Promieniowanie UV
Promieniowanie jonizujące
Radioaktywne pierwiastki
Temperatura
Czynniki chemiczne:
Czynniki deaminujące - usuwają grupę aminową z zasad azotowych; Przykładem może być kwas azotawy (HNO2
analogi, ze względu na duże podobieństwo do występujących w nukleotydach zasad azotowych mogą być one wbudowywane do DNA podczas replikacji
Reaktywne formy tlenu, czyli takie, które zawierają niesparowany elektron.
Czynniki interkalujące (barwniki akrydynowe, np. bromek etydyny) – wnikają w łańcuch DNA i powodują rozsunięcie się zasad azotowych, deformując tym samym strukturę podwójnej helisy. Prowadzi to do błędów w replikacji, delecji, insercji oraz zmiany ramki odczytu.
Konserwanty, środki ochrony czystości, środki chwastobójcze, owadobójcze.
Czynniki biologiczne:
Wirusy np. różyczki, opryszczki
Pierwotniaki wywołujące toksoplazmozę
Mykotoksyny wytwarzane przez grzyby
Objaśnij pojęcia:
Geny letalne- powodujące śmierć ponad 90% osobników, w których genotypach wystąpią w dawce aktywnej (np. homozygota recesywna),np. platynowe ubarwienie u lisów
Geny semiletalne- powodują ce w aktywnej dawce śmierć od 50 do90% osobników np. katarakta u bydła
Geny subwitalne- które osłabiają wydolność fizjologiczną i mogą powodować śmierć od 10 do 50% osobników
Elektroforeza agarozowa- Żel agarozowy stosuję się do rozdzielania DNA o szerokim zakresie mas cząsteczkowych. Stosowana do stosunkowo dużych cząsteczek DNA.
Elektroforeza w żelu agarozowym prowadzona jest w aparatach ustawionych poziomo, a
rozdział elektroforetyczny prowadzony jest w buforze TBE×1 (90 mM Tris-base, 90 mM kwas borowy, 2 mM EDTA, pH 8) lub TAE×1 (40 mM Tris-base, 40 mM lodowy kwas octowy, 1 mM EDTA, pH 8). ka DNA jest naładowana ujemnie w środowisku obojętnym i alkalicznym, a więc umieszczona w polu elektrycznym, przemieszcza się w kierunku anody. DNA o tych samych masach cząsteczkowych, ale różnych konformacjach charakteryzuje różna ruchliwość elektroforetyczna. Im dłuższa jest cząsteczka DNA lub RNA tym dłużej odnajduje ona drogę poprzez pory żelu. Do uwidocznienia DNA po lub w trakcie elektroforezy stosowany jest rutynowo bromek etydyny (EtBr),
Elektroforeza poliakrylamidowa- jest wykorzystywana do rozdzielania i analizy małych
fragmentów DNA. Najlepszy rozdział uzyskuje się dla DNA o długości mniejszej niż 1000 par zasad . W żelach tych można efektywnie rozdzielać także jednoniciowe fragmenty DNA lub RNA. Elektroforeza w żelach poliakrylamidowych przeprowadzona jest w aparaturze ustawionej pionowo, a więc migracja cząsteczek jest zgodna z kierunkiem siły ciążenia, gdzie jednoniciowe DNA charakteryzują się spowolnioną, w stosunku do dwuniciowego DNA, migracją w żelu. Rozdział elektroforetyczny prowadzony jest w buforze 1x TBE. Rozdzielenie fragmentów przeprowadza się zazwyczaj przy 5 V/cm. Przebieg elektroforezy można śledzić na podstawie migracji
barwników w żelu. DNA w żelu poliakrylamidowym można wybarwiać za pomocą np. EtBr .
Jakie bufory stosujemy do elektroforezy agarozowej?
Bufor TAE do elektroforezy agarozowej (50x stężony, skład na 1000 ml):
Tris 242 g
bezwodny kwas octowy 57.1 ml
KCl 500 mM
EDTA (pH 8.0) (roztwór 0.5 M) 100 ml
Bufor TAE pozwala na lepszy rozdział fragmentów DNA powyżej 2 kpz.
Bufor TBE do elektroforezy agarozowej (10x stężony, skład na 1000 ml):
Tris 108 g
H3BO3 55 g
EDTA (pH 8.0) (roztwór 0.5 M) 40 ml
Posiada wyższą pojemność buforującą oraz niższe przewodnictwo elektryczne od buforu TAE. Zawarty w TBE boran jest silnym inhibitorem enzymów (np. ligaz, restryktaz, czy polimeraz DNA), dlatego nie jest polecany w przypadku konieczności wycinania DNA z żelu i wykorzystania go do dalszych analiz (DNA gel-out). TBE pozwala na rozdział niewielkich fragmentów, poniżej 500 pz (np. produktów reakcji PCR, fragmentów restrykcyjnych).
Co wpływa na szybkość poruszania się cząstek DNA w żelu?
wielkość cząstek DNA – prędkość migracji cząstek liniowych jest odwrotnie proporcjonalna do log10 z ilości par zasad
stężenie agarozy (wzrost stężenia --> spowolnienie rozdziału --> wzrost dokładności rozdziału)
konformacja DNA (Supercoiled – superzwinięte koliste DNA; Nicked circles – koliste DNA; Linear – liniowe DNA)
składu nukleotydowego rozdzielanego fragmentu (konformacje jednoniciowe)
rodzaj, skład, siła jonowa buforu
napięcie prądu – 5V/cm (odcinek pomiędzy elektrodami) przy niskich napięciach prąd jest proporcjonalny do tempa migracji, przy wzroście napięcia przyśpieszenie dużych cząsteczek zmienia się nieproporcjonalnie do prądu, efektywny zakres rozdziału zmniejsza się wraz ze wzrostem napięcia.
obecnośc EtBr (wypadkowy ładunek dodatni, migruje w kierunku przeciwnym niż DNA, spowalnia tempo migracji o 15%).
kierunek działania prądu –dotyczy tylko dużych fragmentów DNA – elektroforeza pulsacyjna – dotyczy DNA wielkości 50-5000 kB. Jeżeli zmienia się kierunek prądu to cząstki większe wolniej zmieniają kierunek niż mniejsze, dzięki temu można je rozdzielić
Co rozumiemy pod skrótem SNP, podaj wykorzystanie polimorfizmu
Polimorfizm pojedynczego nukleotydu- zjawisko zmienności sekwencji DNA, która polega na zmianie pojedynczego nukleotydu (A, T, C lub G) pomiędzy osobnikami danego gatunku lub drugim, odpowiadającym chromosomem danego osobnika.
Wykorzystanie:
1.Poszukiwanie powiązań pomiędzy fenotypem a genotypem
• bezpośrednio → detekcja genów warunkujących fenotyp
• pośrednio → detekcja SNP pozostających w
nierównowadze z genami
2.Medycyna → (wczesne) diagnozowanie stanów
chorobowych
3.Selekcja → (wczesny) wybór zwierząt do hodowli
4.Bioróżnorodność → zróżnicowanie pomiędzy osobnikami
Na postawie DNA
Przyczyny podwójnego umięśnienia u bydła
Odpowiedzialna za podwójne umięśnienie u bydła jest mutacja w genie miostatyny, substancji regulującej zachowanie dzielących się, mioblastów. Recesywny allel mh, warunkujący wystąpienie tzw. podwójnego umięśnienia to zmutowana forma genu MSTN kodującego myostatynę. Mutacja polegająca na, delecji 11 nukleotydów pomiędzy 821 i 831 nukleotydem, licząc od kodonu startowego i jest odpowiedzialna za zmianę sekwencji aminokwasów i przedwczesne pojawienie się kodonu STOP, a w konsekwencji powstanie białka o zmienionej funkcji biologicznej. Mutacja została opisana jako nt821(del 11).
Mutacje w genie miostatyny u owiec
U owiec Textel mutacja w genie miostatyny tworzy miejsce przyłączenia mikroRNA (odpowiedzialnego za regulację produkcji białek) co prowadzi do zahamowania tworzenia miostatyny
Geny plenności uowiec:
FecB- w chromosomie 6, leży w receptorze białka morfogenetycznego kości BMPR1B, polega na zmianie aminokwasów w pozycji 249 aminokwasów Q249R
Introdukowano gen do 48 ras w 19 krajach
Skutki i przyczyny mutacji callipyge u owiec-
mutacja w genie DLK 1 prowadzi do przerostu mięśni zlokalizowana na chromosomie 18.
Syndrom HYPP- hiperkalemiczne porażenie okresowe. choroba genetyczna z grupy kanałopatii, spowodowana mutacją w genie kanału sodowego SCN4A w locus 17q23.1-q25.3. Dziedziczona jest autosomalnie dominująco. Objawia się napadami osłabienia mięśni, z początkiem w 1. i 2. dekadzie życia, trwającymi od 30 minut do kilku godzin. W rozpoznaniu stosuje się często test wysiłkowy, prowokujący objawy
Syndrom pajęczych nóg
Jest to dziedziczna chondrodysplazja. Wada powszechna u owiec Suffolk i Hampshire. Choroba ta charakteryzuje się zaburzeniami we wzroście mięśni i kości młodych owiec. Deformacje mogą występować już przy urodzeniu, zdarza się też, że zauważalne są dopiero w wieku 4-6 tyg. Nieprawidłowości budowy: garbaty nos (profil rzymski), nienaturalnie długie, zgięte i/lub szeroko rozstawione nogi, spłaszczone żebra, spłaszczona klatka piersiowa, słabe umięśnienie. Wada występuje u homozygot recesywnych. Mutacja wywołująca syndrom występuje w genie FGFR3 (receptor czynnika wzrostu fibroblastów), który leży na 6 chromosomie, mutacja obejmuje inaktywację receptora czynnika wzrostu fibroblastów.
Opisz znaczenie polimorfizmów genów białek mleka u bydła
Występuje zależność między formami polimorficznymi białek mleka a wydajnością mleka, jego składem chemicznym oraz właściwościami fizykochemicznymi i przydatnością technologiczną. Białka mleka, takie jak kazeiny i białka serwatkowe, syntetyzowane w gruczole mlecznym, należą właśnie do markerów genetycznych. Decydują przede wszystkim o jego przydatności technologicznej, szczególnie do produkcji serów, a także podatności na działanie enzymów proteolitycznych w procesie trawienia. W mleku krowim wyróżnia się 6 głównych frakcji białek. Należą do nich: alfa-laktoglobulina, beta-laktoglobulina, alfas1-kazeina, alfas2-kazeina, beta-kazeina, kappa-kazeina. Różnią się one poziomem zawartości w mleku i liczbą form polimorficznych.
Opisz najważniejsze polimorfizmy związane z jakością mięsa u trzody chlewnej
Gen wrażliwości świń na stres, zlokalizowany na 6 parze chromosomów. Mutacja odpowiedzialną za wrażliwość na stres (614Arg>Cys). Gen ten (RYR1) koduje receptor ryanodiny, będący kanałem wapniowym w błonie siateczki sarkoplazmatycznej, odpowiedzialny za uwalnianie jonów Ca2+do sarkoplazmy podczas skurczu mięśniowego. Wystąpienie mutacji w genie receptora ryanodiny jest związana z występowaniem wad poubojowych mięsa (mięso PSE), słabszym umięśnieniem tuszy. Występuje najczęściej u rasy Pietrain i Belgijskiej Landrace. Przeprowadza się testy PCR-RLFP lub test halotanowy, który polega na podawaniu halotanu w specjalnej masce, u osobników wrażliwych na stres dochodzi do usztywnienia kończyn i wzrostu temperatury (homozygoty recesywne).
Mutacja w genie „kwaśnego mięsa” u świń
Zidentyfikowany tylko u europejskich i Amerykańskich świń rasy Hampshire
Powoduje wzrost poziomu kwasu mlekowego w mięśniach
Zlokalizowany na chromosomie 5
Obecność mutacji w tym genie powoduje dużo większe straty mięsne niż mutacje w genie RYR1
Efektem kwaśnego mięsa jest punktowa mutacja w genie (G>C) zmiana argininy na glutaminę
Opisz polimorfizmy związane z jakością mięsa u trzody chlewnej
Gen HFAB- gen białka transportującego kwasy tłuszczowe mięśnia sercowego
Odpowiada za zawartość tłuszczu śródmięśniowego i marmurkowatość, otłuszczenie tusz, grubość słoniny. Polimorfizm identyfikowany Mspl. HaeIII
Gen FTO- 9 polimorfizmów SNP (4 w intronie T170G, T276G) region 3’UTR G341A
Rasa duroc- wpływ na tłuszcz śródmięśniowy T276G allel T
Opisz metody pozwalające na zidentyfikowanie mutacji w populacji:
SSCP- single stranded conformation polymorphism;
- jedna z najczęściej stosowanych technik wykorzystywana do wstępnej identyfikacji mutacji punktowych w badanym fragmencie DNA
- badanie polega na amplifikacji techniką PCR wybranego fragmentu DNA, a następnie jego denaturacji i elektroforezie
- pozwala na wykrycie 70-90% mutacji w produktach PCR o długości 200 par zasad
- czułość metody zmniejsza się dla dłuższych produktów tak, że w DNA długości 400 par zasad wykrywa się mniej niż 50% mutacji
- pojedyncze nici równej długości, ale różniące się sekwencją, a przez to konformacją mogą wykazywać różnice w ruchliwości elektroforetycznej
- w konsekwencji po elektroforezie widoczne są różnice w odległości pomiędzy nicmi DNA normalnego, a DNA zmutowanego
- pojedyncze różnice w sekwencji, spowodowane mutacja punktową, wywołują zróżnicowaną migrację i charakterystyczne polożenie w żelu poliakrylamidowym
DGGE- DENATURING GRADIENT GEL ELECTROPHORESIS
- metoda często stosowana w przesiewowym posukiwaniu mutaci punktowych
- pozwala na wykrycie 95% mutacji w produktach PCR o długości 600 par zasad
- w przypadku stosowania dłuższych produktów, interpretacja wyników jest znacznie utrudniona
- badany DNA uzyskuje się zastosowaniem metody amplikacji PCR z zastosowaniem specjalnych starterów bogatych w sekwencje GC.
TGGE- Temperature gradient gel electrophoresis
-metoda również czesto stosowana w przesiewowym poszukiwaniu mutacji punktowych
-oparta na zasadzie podobnej do DGGE, a różnica polega na tym, ze w przypadku TGGE czynnikiem wywołującym denaturację dwuniciowego DNA w trakcie wędrówki w żelu poliakrylamidowym elektroforezy jest wzrastająca temperatura
-podobnie jak w DGGE można analizować produkty o długości do 600 par zasad
HET- podobnie jak SSCP jest techniką względnie prostą. Jeżeli sekwencje niezmienione (typu dzikiego) oraz sekwencje z mutacją są obecne w reakcji PCR (jako matryce) to produktami tej reakcji są cztery różne dwuniciowe fragmenty DNA. Dwa z nich to homodupleksy, czyli struktury dwuniciowe w pełni komplementarne. Dwa inne to heterodupleksy zawierające miejsca niesparowane. Heterodupleksy ze zmianą co najmniej jednej zasady mogą wykazywać inną w porównaniu do homodupleksów ruchliwość podczas elektroforezy na zwykłym poliakrylamidowym żelu. Czułość tej analizy w wykrywaniu mutacji nie jest dobrze znana. Szacuje się, Że w niektórych układach doświadczalnych może wynosić nawet 90%. Według niektórych autorów stosując HET można wykrywać niekiedy zaburzenia genów, które nie są wykrywane przez SSCP.
Sekwencjonowanie DNA
Sekwencjonowanie DNA to analiza, której celem jest poznanie kolejności ułożenia nukleotydów wzdłuż nici DNA w komórkach danego osobnika.
Stosuje się dwie metody sekwencjonowania DNA. Jedna polega na wyznakowaniu radioaktywnym fosforem końców 5' nici DNA, które są potem specyficznie przecinane na końcu 3' w kolejnych miejscach występowania określonej zasady azotowej. Fragmenty DNA uzyskane z czterech prowadzonych równolegle reakcji rozdziela się elektroforetycznie według ich długości, co pozwala odczytać całą sekwencję DNA danej cząsteczki. Druga metoda polega na analizowaniu produktów syntezy DNA, zachodzącej na jednoniciowej matrycy badanego DNA. Syntezę prowadzi się w czterech układach reakcyjnych, do których dodaje się specyficzne cząsteczki, powodujące zakończenie syntezy w miejscu występowania określonej zasady. Po elektroforetycznym rozdziale wszystkich powstałych fragmentów można odczytać sekwencje całej nici wyjściowej. Najczęściej stosowaną metodą sekwencjonowania DNA jest enzymatyczna metoda opracowana przez F. Sangera. Polega na, przebiegającej in vitro i przy udziale polimerazy DNA, syntezie DNA na matrycy jednoniciowego DNA. Dodatek dideoksytrifosforanu jednego z czterech nukleotydów powoduje zakończenie replikacji w momencie włączenia właściwego nukleotydu w syntetyzowany łańcuch.
Metoda PCR- łańcuchowa reakcja polimerazy służąca do amplifikacji (namnożenia) wybranego fragmentu DNA in vitro. Reakcja prowadzona w termocyklerach wymaga termostabilnej polimerazy DNA (np. polimerazy Taq) wolnych trójfosforanów nukleotydów, jonów MGg+ oraz primerów. Startery są krótkimi (zazwyczaj 18-24 nukleotydów) jednoniciowymi fragmentami DNA, które łączą się z komplementarnym fragmentem DNA i umożliwiają polimerazie DNA rozpoczęcie reakcji. Pierwszym etapem reakcji jest denaturacja podwójnej helisy DNA w temp. 95C, następnie temp jest obniżana do 50C- umożliwia połączenie się primerów z komplementarnymi sekwencjami. W końcu temp. Jest podnoszona do 72C i rozpoczyna się reakcja polimeryzacji, w wyniku której powielany jest fragment pomiędzy dwoma pimerami. Cały cykl powtarza się wiele razy, w zależności od ilości materiału, który chce się uzyskać.
Macierze DNA (chipy DNA) są zbiorem sond molekularnych związanych ze
stałym podłożem w ściśle określonym porządku, stanowiąc dwuwymiarowy układ mikroskopijnych miejsc, z określonymi sekwencjami kwasu nukleinowego. Mikromacierze DNA to niewielkie szklane lub plastikowe płytki, na które naniesiono wiele tysięcy sond, z których każda jest specyficzna dla tylko dla jednego genu.Technologia ta pozwala na wykrywanie tysięcy cząsteczek kwasów nukleinowych, dzięki możliwości przeprowadzenia wielu eksperymentów hybrydyzacyjnych w jednym czasie. Wyróżnia się: mikromacierze cDNA oraz mikromacierze oligonukleotydowe. Na mikromacierzach cDNA immobilizowane są stosunkowo długie cząsteczki DNA, co odbywa się przy użyciu urządzeń automatycznych na powierzchni membran, szkła lub silikonu. Mikromacierze oligonukleotydowe są wytwarzane w procesie sterowanej światłem syntezy chemicznej in situ lub też syntezy oligonukleotydów, z immobilizacją na stałej powierzchni. Mikromacierze z krótkimi kwasami nukleinowymi (10-80 pz) są przydatne w detekcji mutacji oraz monitorowaniu ekspresji, odkrywaniu i mapowaniu genów. Zaletą w ich przygotowywaniu jest ominięcie etapu PCR.
Wykorzystanie macierzy DNA
Umoliwiają one analizę w pojedynczym eksperymencie praktycznie całego genomu badanego organizmu. Mikromacierze DNA wykorzystywane są głównie w celu określania zmian w poziomie ekspresji genów, ale również do badań nad alternatywnym splicingiem, do analizy jednonukleotydowych polimorfizmów DNA, czy określania rejonów oddziaływań białko-DNA, wykrywania nowych transkryptów, badania takich procesów jak metylacja czy acetylacja chromatyny oraz innych zmian epigenomicznych (tiling arrays).
Mikromacierze DNA znalazły szerokie zastosowanie w medycynie, gdzie wykorzystywane są do poznawania mechanizmów chorobotwórczych, identyfikacji wskaźników pozwalających na ocenę ryzyka rozwoju chorób oraz określenia nowych obiektów, na których powinno koncentrować się działanie leków. Technika ta umożliwia również postawienie dokładniejszej diagnozy i dostosowanie leczenia do indywidualnego przypadku pacjenta.
Szczególnie szerokie zastosowanie technika mikromacierzy DNA znalazła w onkologii. Mikromacierze DNA znalazły również zastosowanie w diagnostyce chorób zakaźnych, gdzie wykorzystywane są do detekcji i identyfikacji rodzaju wirusa, a także wykrywania genów odporności na antybiotyki w szczepach bakteryjnych.
Typy endonukleaz restrykcyjnych
Rozróżniamy trzy klasy enzymów restrykcyjnych, różniące się mechanizmem cięcia, rodzajem
substratu, produktu i kofaktorami:
Klasa I – białka multimeryczne wymagające jako kofaktorówATP, S-adenylometioniny i Mg2+
● działają zarówno jako restryktazy oraz kodyfikacyjne metylazy
● substrat to dwuniciowy DNA zawierający zdefiniowaną sekwencję kilkunastu nukleotydów
● enzym rozpoznaje sekwencje i w pewnej odległości od niej nacina obie nici DNA, nie
uzyskuje się ściśle określonych fragmentów DNA
Klasa II – białka proste, występują w postaci dimerów i tetramerów, in vitro aktywowane Mg2+
● odpowiadające im metylazy występują jako oddzielne białka monomeryczne
● substratem jest dwuniciowy DNA zawierający kilku nukleotydową sekwencje specyficznie
rozpoznawaną przez dany enzym
● cięcie obu nici zachodzi w obrębie tej rozpoznanej sekwencji lub jej pobliżu (klasa IIS)
● większość enzymów rozpoznaje palindromowe sekwencje (posiadające oś symetrii) cztero-,
sześcio-, lub ośmionukleotydowe. Wwyniku ich cięcia mogą powstać dwa rodzaje końców
tzw „lepkie” i „tępe” końce
● enzymy te znalazły największe zastosowanie w biologii molekularnej
Klasa III – aktywowane przez jony Mg2+ i ATP, czasem potrzebna jest S-adenylometionin
37. Objaśnij co oznacza polimorfizm fragmentów restrykcyjnych.
Polimorfizm fragmentów Dna powstaje w wyniku działania enzymów restrykcyjnych na nić Dna. Polimorfizm ten może być wynikiem tranzycji ( zmiana prawidłowych nukleotydów w DNA na inne w ramach jednej grupy zasad azotowych) transwersji (punktowa zmiana chemiczna w obrębie nici DNA) , delecji (utrata jednej lub większej liczby par nukleotydów z DNA genowego), inercji co prowadzi do powstania lub zaniku miejsca rozpoznawanego przez enzymy restrykcyjne. Mutacje zachodzące w obrębie miejsc restrykcyjnych zmieniają długość fragmentów restrykcyjnych, które można wykrywać .Polimorfizm fragmentów restrykcyjnych jest dość powszechny , szczególnie w niekodujących regionach DNA.
Geny o dużym efekcie
• Gen o dużym efekcie identyfikowany jest gdy u przeciwstawnych homozygot
wartość cechy różni się przynajmniej o jedno odchylenie standardowe
• Geny o dużym efekcie identyfikowane są przypadkowo, albo poprzez poszukiwanie
QTL dla określonej cechy.
- Są to dające się zlokalizować markery genetyczne (typowo w obszarze o zmiennej liczbie tandemowych powtórzeń), które są ściśle sprzężone (fizycznie blisko DNA) z genami kontrolującymi interesujące nas cechy. Korelacja między markerami i cecha jest wykorzystywana do znalezienia położenia genu kontrującego daną cechę) dla określonej cechy.
39. Determinacja płci ssaków
Ukształtowanie się cech płciowych ssaków obejmuje trzy zasadnicze etapy:
1) powstanie w wyniku zapłodnienia układu chromosomów płci XX lub XY w zygocie — kształtuje się wówczas tzw. płeć chromosomowa,
2) rozwój niezróżnicowanych gonad zarodka w kierunku jądra lub jajnika — wykształcenie tzw. płci gonadowej
3) uformowanie się wewnętrznych i zewnętrznych cech płciowych — powstanie tzw. pici fenotypowej. Pleć fenotypowa obejmuje również zmiany powstające w mózgu, które są odpowiedzialne za ukształtowanie się zachowania samczego bądź samiczego.
różnicowanie się gonad w okresie rozwoju płodowego jest kontrolowane przez co najmniej 15 genów, a w tym: WT1, SF1, SOX9, SRY, Fgf9, ZFX i FOXL2.
40. Interseksualizm- Zaburzenie procesu determinacji i różnicowania płci prowadzi do powstania wrodzonych wad rozwojowych układu rozrodczego, które określa się terminem interseksualizmu lub obojnactwa. Zaburzenia tego typu wywoływane są przez mutacje chromosomów płci lub mutacje genów zaangażowanych w proces determinacji i różnicowania płci oraz mogą być skutkiem nieprawidłowego przebiegu ciąży (np. frymartynizm).
41. Imprinting genetyczny - polega na różnym stopniu metylacji genów w komórkach jajowych i komórkach plemnikowych. Gen jest metylowany na allelu pochodzącym od jednego z rodziców. Nakładanie imprintingu zachodzi w czasie gametogenezy. Zjawisko to pozwala zapobiegać partenogenezie, która jest możliwa u niewielkiej liczby gatunków (np. u pszczół) i powoduje zmniejszenie zmienności organizmów. Imprinting jest wynikiem konkurencji materiału genetycznego żeńskiego i męskiego.
42. Mutacje genowe odpowiedzialne za odporność/ podatność zwierząt na patogeny.
Gen odporności na kleszcze- w niektórych krajach głównie pół. Australia, inne regiony tropikalne jak również Europa bydło jest szczególnie podatne na inwazje kleszczy, z kolei bydło indyjskie jest bardzo odporne. Linie pochodzące z krzyżowania bydła mięsnego ras hereford i shorthorn gen o dużym efekcie, determinujący odporność na kleszcze. Wykorzystanie tego genu stwarza możliwość stosunkowo szybkiego zwiększenia odporności na kleszcze różnych ras bydła.
Gen K88 i F18- ???????????????