DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA

1. Rodzaje diagnostyki molekularnej:

- diagnostyka bezpo rednia – ma zastosowanie w przypadku, gdy prawidłowy

gen jest poznany, a jego sekwencja mo e by wykorzystana jako sonda

molekularna lub starter w celu wykrycia mutacji w DNA;

- diagnostyka po rednia – stosujemy, kiedy gen zwi zany z wyst powaniem

okre lonej choroby genetycznej jest nieznany; wykorzystuj c analiz sprz e

lub analiz asocjacji mo emy wyselekcjonowa geny, w ród których znajduje

si nasz poszukiwany gen-kandydat.

2. Metody stosowane w diagnostyce molekularnej:

- hybrydyzacja z sondami molekularnymi

- metoda PCR – ła cuchowej reakcji polimerazy

• Hybrydyzacja (renaturacja) – tworzenie podwójnej helisy mi dzy komplementarnymi

niciami DNA lub RNA, pochodz cymi z ró nych ródeł.

Techniki hybrydyzacyjne:

- hybrydyzacja punktowa – pozwala na jednoczesne wykrywanie i identyfikacje

wielu próbek na tym samym filtrze,

- hybrydyzacja typu Southern – stosowana najcz ciej, dotyczy hybrydyzacji

DNA-DNA. Ma na celu wyszukanie sekwencji DNA spo ród mieszaniny

fragmentów otrzymanych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi,

- hybrydyzacja Nothern – dotyczy hybrydyzacji RNA-DNA i dostarcza

informacji o ekspresji genów,

• Amplifikacja DNA metod PCR (ła cuchowej reakcji polimerazy) – reakcja ta

odzwierciedla naturalny proces replikacji i umo liwia w warunkach in vitro szybkie

powielenie wybranych odcinków DNA lub RNA. Badana sekwencja DNA jest

powielana przy u yciu pary oligonukleotydowych starterów, z których ka dy jest

komplementarny do jednego ko ca sekwencji docelowej DNA. Startery te s

wydłu ane w kierunku przeciwnym, za pomoc termostabilnej polimerazy DNA, w

cyklu który obejmuje trzy podstawowe etapy:

- denaturacja dwuniciowej matrycy – 90-95

°C,

- wi zanie starterów do jednoniciowej matrycy 50-65

°C,

- synteza nici komplementarnej 68-72

°C

Produkty PCR – wizualizacja nast puje poprzez rozdział elektroforetyczny. Cz steczki

DNA umieszczone w elu migruj w polu elektrycznym od ujemnie do dodatnie naładowanej

elektrody, a ich szybko zale y od wielko ci cz steczki – im mniejsze tym szybciej b d si

przesuwały w elu. Wybarwione bromkiem etydyny (mutagen interkaluj cy DNA) s

widoczne po na wietleniu wiatłem UV.

Strategia diagnostyki molekularnej:

Du e zmiany genowe :delecje, duplikacje , insercje

Delecje mog by wykryte metod Southerna lub PCR-Multiplex. W duplikacjach

najcz ciej stosuje si metody ilo ciowe: Q-PCR.

Przykład: dystrofia mi niowa Duchenne’a

Znane mutacje w miejscu restrykcyjnym

Analiza RFLP (analiza polimorfizmu długo ci fragmentów restrykcyjnych), która mo e

wykaza odmienny układ fragmentów DNA po ci ciu okre lonym enzymem restrykcyjnym.

Przykład: fenyloketonuria, anemia sierpowata, hemofilia

Znane mutacje punktowe poza miejscem restrykcyjnym

Strategia wykrywania opiera si na metodzie ASO lub ASA, czyli wykorzystaniu znajomo ci

mutacji do skonstruowania odpowiednich sond lub starterów, które wykryj zarówno allel

prawidłowy, jak i zmutowany.

Przykład: mukowiscydoza (CF)

Nieznane mutacje

Techniki przesiewowe - identyfikacja zmian w sekwencjach oparta na porównaniu

wielokrotno ci i/lub konformacji badanych dwu- i jednoniciowych fragmentów kwasów

nukleinowych. Wspólnym elementem jest powielenie badanego fragmentu DNA technik

PCR i rozdział elektroforetyczny w elu poliakrylamidowym np. PCR-HD (heterodupleksy),

PCR-SSCP (polimorfizm konformacji fragmentów jednoniciowych), PCR-DGGE.

Przykład: zespół Marfana

Sekwencjonowanie

Najcz ciej u ywan metod jest metoda Sangera, oparta o syntez DNA przez polimeraz

DNA in vitro. Do reakcji dodaje si niewielk ilo dideoksynukleotydów, które s

wbudowywane w DNA, ale nie mog by substratem do dalszego wydłu ania nici. W ten

sposób otrzymuje si fragmenty DNA zako czone specyficznym nukleotydem. Produkty

reakcji rozdziela si elektroforetycznie, co powoduj ich segregacj pod wzgl dem wielko ci

produktów.

Analiza sprz e

Metoda stosowana w sytuacji kiedy nie znamy genu zwi zanego z wyst powaniem okre lonej

choroby genetycznej. Celem tej metody jest znalezienie sekwencji DNA (markera

genetycznego), która jest dziedziczona ł cznie z poszukiwanym przez nas genem. Analiza

sprz e wymaga pobrania materiału od wielu członków rodziny w celu ustalenia segregacji

markerów genetycznych z locus poszukiwanego genu. Aby wynik był jednoznaczny, osoba

obci ona ryzykiem przeniesienia genu warunkuj cego chorob musi by heterozygot pod

wzgl dem markera. Stosowana dla chorób jednogenowych o mendlowskim typie

dziedziczenia.

Analiza asocjacji

Polega na badaniu porównawczym rozkładu alleli ró nych polimorfizmów pomi dzy grup

chorych niespokrewnionych a grup kontroln . Analiza asocjacji wykrywa ró nice w

rozkładzie alleli – stwierdzenie bezpo redniej asocjacji identyfikuje zarówno gen, jak i

polimorfizm odpowiedzialny za zwi kszone ryzyko wyst pienia choroby. Stosowana w

chorobach uwarunkowanych wielogenowo/wieloczynnikowo.

Polskie Towarzystwo Genetyki Człowieka: www.ibb.waw.pl/

∼ptg c

GeneTests

www.geneclinics.org

S

S

t

t

r

r

a

a

t

t

e

e

g

g

i

i

a

a

d

d

i

i

a

a

g

g

n

n

o

o

s

s

t

t

y

y

k

k

i

i

g

g

e

e

n

n

e

e

t

t

y

y

c

c

z

z

n

n

e

e

j

j

g

g

e

e

n

n

z

z

n

n

a

a

n

n

y

y

g

g

e

e

n

n

n

n

i

i

e

e

z

z

n

n

a

a

n

n

y

y

p

p

o

o

s

s

z

z

u

u

k

k

i

i

w

w

a

a

n

n

i

i

e

e

m

m

u

u

t

t

a

a

c

c

j

j

i

i

a

a

n

n

a

a

l

l

i

i

z

z

a

a

s

s

p

p

r

r

z

z

e

e

P

P

o

o

s

s

z

z

u

u

k

k

i

i

w

w

a

a

n

n

i

i

e

e

m

m

u

u

t

t

a

a

c

c

j

j

i

i

m

m

u

u

t

t

a

a

c

c

j

j

e

e

z

z

n

n

a

a

n

n

e

e

m

m

u

u

t

t

a

a

c

c

j

j

e

e

n

n

i

i

e

e

z

z

n

n

a

a

n

n

e

e

m

m

u

u

t

t

a

a

c

c

j

j

e

e

r

r

e

e

a

a

r

r

a

a

n

n

a

a

c

c

j

j

e

e

m

m

e

e

t

t

o

o

d

d

y

y

p

p

u

u

n

n

k

k

t

t

o

o

w

w

e

e

g

g

e

e

n

n

o

o

w

w

e

e

p

p

r

r

z

z

e

e

s

s

i

i

e

e

w

w

o

o

w

w

e

e

P

P

C

C

R

R

-

-

R

R

F

F

L

L

P

P

P

P

C

C

R

R

-

-

m

m

u

u

l

l

t

t

i

i

p

p

l

l

e

e

x

x

P

P

C

C

R

R

-

-

H

H

D

D

P

P

C

C

R

R

-

-

A

A

S

S

A

A

Q

Q

-

-

P

P

C

C

R

R

P

P

C

C

R

R

-

-

S

S

S

S

C

C

P

P

A

A

S

S

O

O

S

S

o

o

u

u

t

t

h

h

e

e

r

r

n

n

b

b

l

l

o

o

t

t

P

P

C

C

R

R

-

-

D

D

G

G

G

G

E

E

W

W

y

y

n

n

i

i

k

k

p

p

r

r

a

a

w

w

i

i

d

d

ł

ł

o

o

w

w

y

y

n

n

i

i

e

e

p

p

r

r

a

a

w

w

i

i

d

d

ł

ł

o

o

w

w

y

y

i

i

n

n

n

n

e

e

m

m

u

u

t

t

a

a

c

c

j

j

e

e

/

/

w

w

y

y

k

k

l

l

u

u

c

c

z

z

e

e

n

n

i

i

e

e

p

p

o

o

t

t

w

w

i

i

e

e

r

r

d

d

z

z

e

e

n

n

i

i

e

e

m

m

u

u

t

t

a

a

c

c

j

j

e

e

w

w

c

c

h

h

o

o

r

r

o

o

b

b

y

y

r

r

o

o

z

z

p

p

o

o

z

z

n

n

a

a

n

n

i

i

a

a

i

i

n

n

n

n

y

y

c

c

h

h

g

g

e

e

n

n

a

a

c

c

h

h