Diagnostyka molekularna

Diagnostyka molekularna

w medycynie

w medycynie

Aneta Bąk – Katedra i Zakład Genetyki Klinicznej CM

Aneta Bąk – Katedra i Zakład Genetyki Klinicznej CM

UMK

UMK

Główne kierunki analizy DNA

Główne kierunki analizy DNA

Genomowy DNA

Genomowy DNA

Amplifikacja DNA

Amplifikacja DNA

Hybrydyzacja molekularna

Hybrydyzacja molekularna

Amplifikacja in-vitro

Amplifikacja in-vitro

- Southern Blot

- Southern Blot

PCR

PCR

- Northern Blot

- Northern Blot

- Dot Blot

- Dot Blot

- DNA Fingerprinting

- DNA Fingerprinting

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych



metoda badania oparta na zdolności tworzenia kompleksu

metoda badania oparta na zdolności tworzenia kompleksu

dwuniciowego przez jednoniciowe fragmenty kwasów

dwuniciowego przez jednoniciowe fragmenty kwasów

nukleinowych,

nukleinowych,



polega na wzajemnym oddziaływaniu pomiędzy badanym

polega na wzajemnym oddziaływaniu pomiędzy badanym

fragmentem kwasu nukleinowego a sondą molekularną,

fragmentem kwasu nukleinowego a sondą molekularną,

które prowadzi do wytworzenia hybrydu (dupleksu) o

które prowadzi do wytworzenia hybrydu (dupleksu) o

dwuniciowej strukturze,

dwuniciowej strukturze,



w przypadku dwuniciowego fragmentu kwasu

w przypadku dwuniciowego fragmentu kwasu

nukleinowego tworzenie hybrydu poprzedzone jest

nukleinowego tworzenie hybrydu poprzedzone jest

denaturacją pod wpływem działania zasad lub wysokich

denaturacją pod wpływem działania zasad lub wysokich

temperatur,

temperatur,

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

cd.

cd.



proces łączenia sondy molekularnej z fragmentem

proces łączenia sondy molekularnej z fragmentem

docelowym kwasu nukleinowego jest wysoce specyficzny i

docelowym kwasu nukleinowego jest wysoce specyficzny i

zachodzi zgodnie z zasadą komplementarności,

zachodzi zgodnie z zasadą komplementarności,



odpowiednio przygotowana sonda molekularna, w

odpowiednio przygotowana sonda molekularna, w

optymalnych warunkach rozpoznaje sekwencje różniące się

optymalnych warunkach rozpoznaje sekwencje różniące się

zaledwie kilkoma nukleotydami i tworzy trwałe kompleksy,

zaledwie kilkoma nukleotydami i tworzy trwałe kompleksy,



badany kwas nukleinowy może być denaturowany i

badany kwas nukleinowy może być denaturowany i

unieruchamiany na filtrach, a następnie poddawany

unieruchamiany na filtrach, a następnie poddawany

procesowi identyfikacji za pomocą znakowanej

procesowi identyfikacji za pomocą znakowanej

radioaktywnie lub nieradioaktywnie sondy molekularnej.

radioaktywnie lub nieradioaktywnie sondy molekularnej.

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

cd.

cd.



Tm

Tm

– jest to tzw.

– jest to tzw.

odwracalny punkt topnienia

odwracalny punkt topnienia

– temperatura

– temperatura

przy której istnieje równowaga dynamiczna pomiędzy

przy której istnieje równowaga dynamiczna pomiędzy

hybrydami rozpadającymi się w wyniku denaturacji i

hybrydami rozpadającymi się w wyniku denaturacji i

tworzącymi się w wyniku renaturacji,

tworzącymi się w wyniku renaturacji,



ze statycznego punktu widzenia w tej temperaturze 50%

ze statycznego punktu widzenia w tej temperaturze 50%

hybryd ulega rozpadowi,

hybryd ulega rozpadowi,



Tm zależy od wielu czynników: stężenia jonów Na

Tm zależy od wielu czynników: stężenia jonów Na

+

+

, liczby par

, liczby par

G-C, długość hybrydy, stężenia formamidu lub mocznika.

G-C, długość hybrydy, stężenia formamidu lub mocznika.

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

cd.

cd.

Zjawisko hybrydyzacji umożliwia tworzenie kompleksów

Zjawisko hybrydyzacji umożliwia tworzenie kompleksów

różnych molekuł zwanych inaczej hybrydami:

różnych molekuł zwanych inaczej hybrydami:

•

DNA – DNA, gdy sonda (wyznakowany ssDNA) wiąże się do

DNA – DNA, gdy sonda (wyznakowany ssDNA) wiąże się do

komplementarnego ssDNA analizowanej sekwencji,

komplementarnego ssDNA analizowanej sekwencji,

•

DNA – RNA, gdy sonda (wyznakowany ssDNA) tworzy

DNA – RNA, gdy sonda (wyznakowany ssDNA) tworzy

hybryd z komplementarną cząsteczką RNA,

hybryd z komplementarną cząsteczką RNA,

•

RNA – RNA, gdy sonda (wyznakowany RNA) łączy się z

RNA – RNA, gdy sonda (wyznakowany RNA) łączy się z

komplementarna cząsteczką RNA.

komplementarna cząsteczką RNA.

Stabilność wyżej wymienionych hybrydów jest

Stabilność wyżej wymienionych hybrydów jest

zróżnicowana:

zróżnicowana:

RNA –RNA > DNA –RNA > DNA –DNA

RNA –RNA > DNA –RNA > DNA –DNA

Sondy molekularne

Sondy molekularne

W analityce molekularnej wykorzystuje się sondy

W analityce molekularnej wykorzystuje się sondy

oligonukleotydowe pochodzenia naturalnego (kilkaset

oligonukleotydowe pochodzenia naturalnego (kilkaset

nukleotydów), które można otrzymać przez określone zabiegi

nukleotydów), które można otrzymać przez określone zabiegi

molekularne np. klonowanie lub sondy syntetyzowane

molekularne np. klonowanie lub sondy syntetyzowane

chemicznie (zwykle o długości 10 – 50 nukleotydów).

chemicznie (zwykle o długości 10 – 50 nukleotydów).

Zalety sond syntetycznych:

Zalety sond syntetycznych:

- stosunkowo łatwa dostępność,

- stosunkowo łatwa dostępność,

- możliwość dowolnego programowania sekwencji sond,

- możliwość dowolnego programowania sekwencji sond,

- nie ma potrzeby denaturacji, gdyż sonda jest jednoniciowa,

- nie ma potrzeby denaturacji, gdyż sonda jest jednoniciowa,

- krótki czas hybrydyzacji,

- krótki czas hybrydyzacji,

- wysoka selektywność.

- wysoka selektywność.

Znakowanie sond molekularnych

Znakowanie sond molekularnych

Znakowanie najczęściej wykonuje się poprzez wprowadzenie

Znakowanie najczęściej wykonuje się poprzez wprowadzenie

radioizotopu

radioizotopu

32

32

P w miejsce niepromieniotwórczych atomów

P w miejsce niepromieniotwórczych atomów

fosforu.

fosforu.

Można tego dokonać poprzez:

Można tego dokonać poprzez:

- przeniesienie z udziałem kinazy polinukleotydowej reszty

- przeniesienie z udziałem kinazy polinukleotydowej reszty

fosfonowej [

fosfonowej [

γ

γ

32

32

P] ze znakowanego ATP na koniec 5’ cząsteczki

P] ze znakowanego ATP na koniec 5’ cząsteczki

sondy

sondy

lub

lub

- wbudowując w łańcuch sondy [

- wbudowując w łańcuch sondy [

γ

γ

32

32

P] – deoksyfosfonukleozydy w

P] – deoksyfosfonukleozydy w

procesie „nick translation” (uzupełnienie przerw w dwuniciowej

procesie „nick translation” (uzupełnienie przerw w dwuniciowej

cząsteczce DNA, wywołanych uprzednio przez endonukleazę).

cząsteczce DNA, wywołanych uprzednio przez endonukleazę).

W korzystaniu z tego typu sond metodą wykrywania utworzonych

W korzystaniu z tego typu sond metodą wykrywania utworzonych

struktur hybrydowych jest bezpośrednia autoradiografia.

struktur hybrydowych jest bezpośrednia autoradiografia.

Znakowanie sond molekularnych

Znakowanie sond molekularnych

Powszechnie stosuje się również techniki niepromieniotwórcze w

Powszechnie stosuje się również techniki niepromieniotwórcze w

znakowaniu sond molekularnych, polegające na dołączaniu biotyny

znakowaniu sond molekularnych, polegające na dołączaniu biotyny

lub digoksygeniny.Produkty hybrydyzacji wykrywa się wówczas w

lub digoksygeniny.Produkty hybrydyzacji wykrywa się wówczas w

procesach dwustopniowych:

procesach dwustopniowych:

Etap I:

Etap I:

-

-

użycie streptawidyny wiążącej się wybiórczo z biotyną lub

użycie streptawidyny wiążącej się wybiórczo z biotyną lub

przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko biotynie czy

przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko biotynie czy

digoksygeninie,

digoksygeninie,

-

streptawidyna i przeciwciała sprzężone są z enzymami

streptawidyna i przeciwciała sprzężone są z enzymami

(peroksydaza chrzanowa lub fosfataza zasadowa).

(peroksydaza chrzanowa lub fosfataza zasadowa).

Etap II:

Etap II:

-

-

w/w enzymy w obecności odpowiednich substratów powodują

w/w enzymy w obecności odpowiednich substratów powodują

reakcje barwne lub wywołują zjawisko chemiluminescencji.

reakcje barwne lub wywołują zjawisko chemiluminescencji.

Hybrydyzacja Southern

Hybrydyzacja Southern

(ang. Southern blot hybridization)

(ang. Southern blot hybridization)



hybrydyzacja mająca na celu identyfikację określonego

hybrydyzacja mająca na celu identyfikację określonego

fragmentu DNA,

fragmentu DNA,



najczęściej dotyczy hybrydyzacji DNA – DNA,

najczęściej dotyczy hybrydyzacji DNA – DNA,

Hybrydyzacja Southern cd.

Hybrydyzacja Southern cd.

Etapy :

Etapy :

1. Izolacja i oczyszczanie DNA

1. Izolacja i oczyszczanie DNA

z komórek lub tkanek.

z komórek lub tkanek.

2. Trawienie DNA

2. Trawienie DNA

odpowiednimi restryktazami.

odpowiednimi restryktazami.

3. Rozdział elektroforetyczny

3. Rozdział elektroforetyczny

fragmentów DNA według

fragmentów DNA według

wielkości i ich denaturacja

wielkości i ich denaturacja

in

in

situ

situ

.

.

Hybrydyzacja Southern cd.

Hybrydyzacja Southern cd.

4. Przeniesienie fragmentów DNA z

4. Przeniesienie fragmentów DNA z

żelu na filtr nitrocelulozowy lub

żelu na filtr nitrocelulozowy lub

nylonowy.

nylonowy.

5. Związanie DNA z filtrem: w

5. Związanie DNA z filtrem: w

temperaturze 80°C lub poprzez

temperaturze 80°C lub poprzez

naświetlanie UV.

naświetlanie UV.

6. Hybrydyzacja z sondą.

6. Hybrydyzacja z sondą.

7. Ustalenie położenia fragmentów ,

7. Ustalenie położenia fragmentów ,

do których zhybrydyzowała sonda z

do których zhybrydyzowała sonda z

użyciem autoradiografii , reakcji

użyciem autoradiografii , reakcji

barwnych lub fluorescencji.

barwnych lub fluorescencji.

Hybrydyzacja Southern cd.

Hybrydyzacja Southern cd.

Hybrydyzację z sondą dzielimy na trzy etapy:

Hybrydyzację z sondą dzielimy na trzy etapy:

1. Prehybrydyzacja:

1. Prehybrydyzacja:

- eliminacja niespecyficznego tła poprzez moczenie filtru w

- eliminacja niespecyficznego tła poprzez moczenie filtru w

roztworze, którego składniki blokują miejsca mogące

roztworze, którego składniki blokują miejsca mogące

związać kwasy nukleinowe na filtrze,

związać kwasy nukleinowe na filtrze,

- w celu zminimalizowania tła dodaje się również

- w celu zminimalizowania tła dodaje się również

niehomologiczne DNA nośnikowe.

niehomologiczne DNA nośnikowe.

2. Właściwa hybrydyzacja:

2. Właściwa hybrydyzacja:

- wyznakowana sonda wiąże się z unieruchomionymi na

- wyznakowana sonda wiąże się z unieruchomionymi na

filtrze kwasami nukleinowymi,

filtrze kwasami nukleinowymi,

- wysoka homologia: temperatura (65°C), mniejsze

- wysoka homologia: temperatura (65°C), mniejsze

stężenie soli, dodatek formamidu,

stężenie soli, dodatek formamidu,

- częściowa homologia: temperatura (55°C) , wyższe

- częściowa homologia: temperatura (55°C) , wyższe

stężenie soli.

stężenie soli.

3. Płukanie filtru:

3. Płukanie filtru:

- usunięcie niezhybrydyzowanej sondy – jest to warunek

- usunięcie niezhybrydyzowanej sondy – jest to warunek

specyficznego obrazu hybrydyzacji.

specyficznego obrazu hybrydyzacji.

Zastosowanie hybrytyzacji Southern

Zastosowanie hybrytyzacji Southern

Hybrydyzacja Southern umożliwia:

Hybrydyzacja Southern umożliwia:

- wykrycie rearanżacji genowych (np. delecje, insercje)

- wykrycie rearanżacji genowych (np. delecje, insercje)

większych niż 50 pz,

większych niż 50 pz,

- badanie polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych

- badanie polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych

DNA – RFLP (restriction fragment length polymorphism).

DNA – RFLP (restriction fragment length polymorphism).

Polimorfizm może mieć charakter naturalny lub może

Polimorfizm może mieć charakter naturalny lub może

wystąpić w wyniku zmian mutacyjnych w DNA, które

wystąpić w wyniku zmian mutacyjnych w DNA, które

powodują zanikanie bądź pojawianie się miejsc

powodują zanikanie bądź pojawianie się miejsc

restrykcyjnych.

restrykcyjnych.

Analiza RFLP wykorzystywana jest m.in. w badaniach

Analiza RFLP wykorzystywana jest m.in. w badaniach

dziedzicznych uwarunkowań chorób jak również w

dziedzicznych uwarunkowań chorób jak również w

wykrywaniu mutacji somatycznych w badanych genach.

wykrywaniu mutacji somatycznych w badanych genach.

Hybrydyzacja Northern

Hybrydyzacja Northern

(ang. Northern blot hybridization)

(ang. Northern blot hybridization)

Jest to metoda

Jest to metoda

służąca

służąca

detekcji kwasów rybonukleinowych

detekcji kwasów rybonukleinowych

(RNA).

(RNA).

Najczęściej stosuje się ją do badania aktywności określonych

Najczęściej stosuje się ją do badania aktywności określonych

genów

genów

(badanie ekspresji genów).

(badanie ekspresji genów).

Metodyka zbliżona jest do hybrydyzacji Southern:

Metodyka zbliżona jest do hybrydyzacji Southern:

-

-

rozdział elektroforetyczny RNA na żelu w warunkach

rozdział elektroforetyczny RNA na żelu w warunkach

denaturujących,

denaturujących,

-

przeniesienie RNA na odpowiednią membranę,

przeniesienie RNA na odpowiednią membranę,

-

utrwalenie RNA na membranie,

utrwalenie RNA na membranie,

-

hybrydyzacja RNA z sondą,

hybrydyzacja RNA z sondą,

-

odpłukanie nadmiaru sondy i detekcja.

odpłukanie nadmiaru sondy i detekcja.

Sonda daje syngał proporcjonalny do ilości RNA obecnego na

Sonda daje syngał proporcjonalny do ilości RNA obecnego na

membranie, stąd po intensywności sygnału po detekcji można

membranie, stąd po intensywności sygnału po detekcji można

ilościowo oszacować poziom wykrytego RNA.

ilościowo oszacować poziom wykrytego RNA.

Hybrydyzacja Dot - blot

Hybrydyzacja Dot - blot

- metoda półilościowa,

- metoda półilościowa,

- umożliwia jednoczesne wykrywanie i

- umożliwia jednoczesne wykrywanie i

identyfikację wielu próbek na tym

identyfikację wielu próbek na tym

samym filtrze,

samym filtrze,

- pozwala na bezpośrednie stosowanie

- pozwala na bezpośrednie stosowanie

komórek hodowanych

komórek hodowanych

in vitro

in vitro

lub

lub

bakterii w miejsce kwasów

bakterii w miejsce kwasów

nukleinowych,

nukleinowych,

- stosowana do wykrywania wirusów w

- stosowana do wykrywania wirusów w

diagnostyce chorób zakaźnych

diagnostyce chorób zakaźnych

zwierząt chodowlanych.

zwierząt chodowlanych.

DNA Fingerprinting

DNA Fingerprinting

(genetyczny odcisk palca)

(genetyczny odcisk palca)



Metoda oparta na hybrydyzacji Southerna.

Metoda oparta na hybrydyzacji Southerna.



Opracowana w 1984 roku przez Brytyjczyka Aleca Jeffreysa.

Opracowana w 1984 roku przez Brytyjczyka Aleca Jeffreysa.



Polega na izolowaniu i sporządzaniu obrazów fragmentów

Polega na izolowaniu i sporządzaniu obrazów fragmentów

DNA.

DNA.



Wykorzystuje obecność w genomie polimorficznych

Wykorzystuje obecność w genomie polimorficznych

sekwencji powtórzonych VNTR (variable number of tandem

sekwencji powtórzonych VNTR (variable number of tandem

repeats) – zmienna liczba tandemowych powtórzeń.

repeats) – zmienna liczba tandemowych powtórzeń.

Występowanie w eukariotycznym DNA sekwencji

Występowanie w eukariotycznym DNA sekwencji

powtórzonych, cechujących się dużą zmiennością, nadaje

powtórzonych, cechujących się dużą zmiennością, nadaje

DNA poszczególnych osobników cechy indywidualne.

DNA poszczególnych osobników cechy indywidualne.

DNA Fingerprinting cd.

DNA Fingerprinting cd.

Metedyka:

Metedyka:

- trawienie wyizolowanego DNA odpowiednimi enzymami

- trawienie wyizolowanego DNA odpowiednimi enzymami

restrykcyjnymi, które tną kwasy nukleinowe w specyficznych

restrykcyjnymi, które tną kwasy nukleinowe w specyficznych

miejscach,

miejscach,

- rozdzielenie i sortowanie poprzez rozdział elektroforeteczny

- rozdzielenie i sortowanie poprzez rozdział elektroforeteczny

pocięte fragmenty DNA,

pocięte fragmenty DNA,

- przeniesienie rozdzielonych fragmentów DNA na filtr

- przeniesienie rozdzielonych fragmentów DNA na filtr

nitrocelulozowy i hybrydyzacja z wyznakowanymi sondami,

nitrocelulozowy i hybrydyzacja z wyznakowanymi sondami,

- detekcja.

- detekcja.

DNA Fingerprinting cd.

DNA Fingerprinting cd.

W wyniku hybrydyzacji VNTR z sondami molekularnymi

W wyniku hybrydyzacji VNTR z sondami molekularnymi

rozpoznajacymi jednocześnie od kilkunastu do

rozpoznajacymi jednocześnie od kilkunastu do

kilkudziesięciu

kilkudziesięciu

loci

loci

otrzymuje się dla każdego osobnika

otrzymuje się dla każdego osobnika

charakterystyczny obraz fragmentów DNA tzw. DNA

charakterystyczny obraz fragmentów DNA tzw. DNA

fingerprint.

fingerprint.

DNA Fingerprinting cd.

DNA Fingerprinting cd.

Zastosowanie:

Zastosowanie:

-

-

badania medyczno – sądowe,

badania medyczno – sądowe,

-

-

ustalanie ojcostwa.

ustalanie ojcostwa.

PCR - reakcja łańcuchowa polimerazy

PCR - reakcja łańcuchowa polimerazy

(ang. polymerase chain reaction)

(ang. polymerase chain reaction)



Należy do najczęściej stosowanych technik biologii

Należy do najczęściej stosowanych technik biologii

molekularnej.

molekularnej.



W znaczny sposób przyśpieszyła uzyskiwanie wyników

W znaczny sposób przyśpieszyła uzyskiwanie wyników

w pracach nad poznaniem struktury i funkcji genów.

w pracach nad poznaniem struktury i funkcji genów.



Umożliwia specyficzną amplifikacje

Umożliwia specyficzną amplifikacje

in vitro

in vitro

wybranych

wybranych

odcinków DNA i RNA.

odcinków DNA i RNA.



Charakteryzuje się wysoką czułością.

Charakteryzuje się wysoką czułością.

PCR

PCR

Rys historyczny

Rys historyczny



Izolacja polimerazy DNA z

Izolacja polimerazy DNA z

Thermus aquaticus

Thermus aquaticus

(Chien

(Chien

1974).

1974).



Wydłużanie starterów przy udziale fragmentu Klenowa

Wydłużanie starterów przy udziale fragmentu Klenowa

polimerazy I z

polimerazy I z

E.coli

E.coli

(Panet i Khorana 1974).

(Panet i Khorana 1974).



Cykliczne wydłużanie starterów (Saiki i wsp. 1985).

Cykliczne wydłużanie starterów (Saiki i wsp. 1985).



Zastosowanie termostabilnej polimerazy (Mullis i

Zastosowanie termostabilnej polimerazy (Mullis i

Faloona 1987, Saiki i wsp. 1998).

Faloona 1987, Saiki i wsp. 1998).



Klonowanie genu (Lawyer i wsp. 1989).

Klonowanie genu (Lawyer i wsp. 1989).

PCR

PCR

Rekordy

Rekordy

1. Długość fragmentu 6 kpz (obecnie 40 kpz fag lambda)

1. Długość fragmentu 6 kpz (obecnie 40 kpz fag lambda)

Ponce MR, Micol JL. PCR amplification of long fragments.

Ponce MR, Micol JL. PCR amplification of long fragments.

Nucleic Acids Res. 20, 623, 1992

Nucleic Acids Res. 20, 623, 1992

2. Pojedynczy włos

2. Pojedynczy włos

Higuchi R., von Beroldingen C.H., Sensabauch S.A., Erlich H.A.

Higuchi R., von Beroldingen C.H., Sensabauch S.A., Erlich H.A.

DNA typing from single cells. Nature 340, 35-42, 1988

DNA typing from single cells. Nature 340, 35-42, 1988

3. Pojedyncza komórka

3. Pojedyncza komórka

Li H., Gyllensten U.B., Cui X., Saiki R.K., Erlich H.A., Arnheim N.

Li H., Gyllensten U.B., Cui X., Saiki R.K., Erlich H.A., Arnheim N.

Amplification and analysis of DNA sequences in single human

Amplification and analysis of DNA sequences in single human

sperm and diploid cells. Nature 335, 414-417, 1988

sperm and diploid cells. Nature 335, 414-417, 1988

4. Pojedynczy oocyt

4. Pojedynczy oocyt

Coutelle C., Williams C., Handyside A., Hardy K., Winston R.,

Coutelle C., Williams C., Handyside A., Hardy K., Winston R.,

Williamson R. Genetic analysis of DNA from single human

Williamson R. Genetic analysis of DNA from single human

oocytes: a model for preimplantation diagnosis of cystic fibrosis.

oocytes: a model for preimplantation diagnosis of cystic fibrosis.

Br. Med.. J. 299, 22-24, 1989

Br. Med.. J. 299, 22-24, 1989

PCR

PCR

Założenia reakcji

Założenia reakcji

1.

1.

Technika enzymatycznej amplifikacji określonych

Technika enzymatycznej amplifikacji określonych

sekwencji DNA.

sekwencji DNA.

2.

2.

Specyficzność reakcji zapewniają dwa startery

Specyficzność reakcji zapewniają dwa startery

komplementarne do sekwencji docelowej.

komplementarne do sekwencji docelowej.

3.

3.

Czułość reakcji pozwala amplifikować DNA

Czułość reakcji pozwala amplifikować DNA

pojedynczych genów ponad 1 000 000 razy mimo

pojedynczych genów ponad 1 000 000 razy mimo

obecności innych sekwencji.

obecności innych sekwencji.

4.

4.

Możliwość amplifikacji pojedynczych matryc.

Możliwość amplifikacji pojedynczych matryc.

PCR

PCR

Przebieg reakcji

Przebieg reakcji

Cykle reakcji PCR:

Cykle reakcji PCR:

PCR

PCR

Przebieg reakcji

Przebieg reakcji

Cykle reakcji PCR:

Cykle reakcji PCR:

1.

1.

Denaturacja wstępna -

Denaturacja wstępna -

92-95

92-95

º

º

C

C

2.

2.

Cykle (25-35)

Cykle (25-35)

Denaturacja

Denaturacja

-

-

92-95

92-95

º

º

C

C

Wiązanie starterów -

Wiązanie starterów -

40-62

40-62

º

º

C

C

Synteza

Synteza

-

-

68-72

68-72

º

º

C

C

3.

3.

Synteza końcowa

Synteza końcowa

-

-

68-72

68-72

º

º

C

C

4.

4.

Przechowywanie

Przechowywanie

-

-

4

4

º

º

C

C

PCR

PCR

Przebieg reakcji

Przebieg reakcji

PCR

PCR

Skład mieszaniny reakcyjnej

Skład mieszaniny reakcyjnej

1. Matryca DNA (RNA)

1. Matryca DNA (RNA)

2. Startery

2. Startery

3. dNTP

3. dNTP

4. MgCl

4. MgCl

2

2

5. Polimeraza Taq

5. Polimeraza Taq

6. Bufor

6. Bufor

PCR

PCR

Matryca

Matryca

1. Ilość DNA

1. Ilość DNA

1ng - 1

1ng - 1

μ

μ

l

l

2. Wyjściowa liczba matryc

2. Wyjściowa liczba matryc

3 x 10

3 x 10

5

5

DNA człowieka

DNA człowieka

1

1

μ

μ

g

g

DNA drożdży

DNA drożdży

10 ng

10 ng

DNA

DNA

E.coli

E.coli

1 ng

1 ng

3. Stopień czystości

3. Stopień czystości

Pomiar UV

Pomiar UV

Elektroforeza

Elektroforeza

4. Metoda izolacji

4. Metoda izolacji

Inhibitory

Inhibitory

PCR

PCR

Startery

Startery

1. Stężenie

1. Stężenie

0.1 - 0.5

0.1 - 0.5

μ

μ

M

M

2. Stężenie wyjściowe

2. Stężenie wyjściowe

18 - 28 nt

18 - 28 nt

3. Zawartość GC

3. Zawartość GC

50 - 60%

50 - 60%

4. Tm

4. Tm

55 - 72

55 - 72

º

º

C

C

5. Stężenie wyjściowe

5. Stężenie wyjściowe

200 - 1000 pmoli/

200 - 1000 pmoli/

μ

μ

l

l

6. Stężenie robocze

6. Stężenie robocze

10 pmoli/

10 pmoli/

μ

μ

l

l

Uwagi:

Uwagi:

Zbyt duże stężenie – niespecyficzny produkt

Zbyt duże stężenie – niespecyficzny produkt

Dimery starterów – komplementarne końce

Dimery starterów – komplementarne końce

3’

3’

PCR

PCR

dNTP

dNTP

1. pH

1. pH

7.0

7.0

2. Stężenie wyjściowe

2. Stężenie wyjściowe

5 - 10 mM

5 - 10 mM

3. Stężenie w reakcji

3. Stężenie w reakcji

20 - 200

20 - 200

μ

μ

M

M

4. Przechowywanie

4. Przechowywanie

-20

-20

º

º

C

C

Uwagi:

Uwagi:

Po 30 cyklach PCR 50% nukleotydów występuje jako

Po 30 cyklach PCR 50% nukleotydów występuje jako

dNTP. Korzystniej stosować mniej dNTP niż zbyt dużo.

dNTP. Korzystniej stosować mniej dNTP niż zbyt dużo.

20

20

μ

μ

M każdego dNTP wystarcza do syntezy 2.6 ng

M każdego dNTP wystarcza do syntezy 2.6 ng

DNA

DNA

lub 10 pmoli sekwencji o długości 400 pz.

lub 10 pmoli sekwencji o długości 400 pz.

PCR

PCR

MgCl

MgCl

2

2

1. Jony Mg

1. Jony Mg

2+

2+

wiązane są przez

wiązane są przez

Startery

Startery

Matrycę

Matrycę

Polimerazę

Polimerazę

dNTP

dNTP

2. Stężenie

2. Stężenie

0.5 - 2.0 mM

0.5 - 2.0 mM

PCR

PCR

Polimeraza

Polimeraza

1. Stężenie

1. Stężenie

0.5 - 5 jedn./100

0.5 - 5 jedn./100

μ

μ

l

l

2. Przechowywanie

2. Przechowywanie

-20

-20

º

º

C

C

3. Okres półtrwania

3. Okres półtrwania

92.5

92.5

º

º

C 2 godz.

C 2 godz.

92.0

92.0

º

º

C 40 min.

C 40 min.

97.5

97.5

º

º

C

C

5 min.

5 min.

4. Temperatura

4. Temperatura

68 - 72

68 - 72

º

º

C

C

5. Synteza

5. Synteza

30 - 100 nt/sek. (2 kpz/min)

30 - 100 nt/sek. (2 kpz/min)

Uwagi:

Uwagi:

Za dużo polimerazy – niespecyficzne produkty

Za dużo polimerazy – niespecyficzne produkty

Za mało polimerazy – brak produktu

Za mało polimerazy – brak produktu

Najczęstszy błąd – za dużo cykli

Najczęstszy błąd – za dużo cykli

Liczba matryc

Liczba matryc

Liczba cykli

Liczba cykli

3 x 10

3 x 10

5

5

25 - 30

25 - 30

1.5 x 10

1.5 x 10

4

4

30 - 35

30 - 35

PCR

PCR

Bufor

Bufor

1. pH

1. pH

8.3 - 8.8

8.3 - 8.8

2. Tris-HCL

2. Tris-HCL

10 - 50 mM

10 - 50 mM

3. Sole

3. Sole

<50 mM

<50 mM

4. „Wzmacniacze” reakcji

4. „Wzmacniacze” reakcji

DMSO, Żelatyna, BSA, Tween 20

DMSO, Żelatyna, BSA, Tween 20

Analiza produktów PCR

Analiza produktów PCR

1. Elektroforeza w żelach agarozowych

1. Elektroforeza w żelach agarozowych

- barwienie bromkiem etydyny,

- barwienie bromkiem etydyny,

- autoradiografia.

- autoradiografia.

2. Elektroforeza w żelach poliakryloamidowych

2. Elektroforeza w żelach poliakryloamidowych

- barwienie bromkiem etydyny, srebrzenie,

- barwienie bromkiem etydyny, srebrzenie,

- autoradiografia, fluorografia.

- autoradiografia, fluorografia.

Analiza produktów PCR cd.

Elektroforeza w żelu

agarozowym:

Główne zastosowanie PCR

Główne zastosowanie PCR

Klonowanie

Klonowanie

YAC, BAC, minigeny, produkty PCR

YAC, BAC, minigeny, produkty PCR

Hybrydyzacja

Hybrydyzacja

Klony cDNA, produkty PCR

Klony cDNA, produkty PCR

Amplifikacja

Amplifikacja

PCR, RT-PCR, PCR multipleks, RFLP-PCR,

PCR, RT-PCR, PCR multipleks, RFLP-PCR,

Real-time PCR, nasted-PCR, RAPD-PCR,

Real-time PCR, nasted-PCR, RAPD-PCR,

RACE-PCR, ASA-PCR, competitive-PCR

RACE-PCR, ASA-PCR, competitive-PCR

Sekwencjonowanie

Sekwencjonowanie

Klony genomowe i cDNA, produkty PCR

Klony genomowe i cDNA, produkty PCR

RT-PCR

RT-PCR

(ang. reverse transcriptase PCR)

(ang. reverse transcriptase PCR)

Matrycą wyjściową jest RNA, które w procesie

Matrycą wyjściową jest RNA, które w procesie

odwrotnej

odwrotnej

transkrypcji jest przepisywane na

transkrypcji jest przepisywane na

komplementarne DNA

komplementarne DNA

(

(

ang. complementary DNA –

ang. complementary DNA –

cDNA). Następnie cDNA

cDNA). Następnie cDNA

ulega amplifikacji, jak w zwykłym PCR.

ulega amplifikacji, jak w zwykłym PCR.

Zastosowanie:

Zastosowanie:

Badanie ekspresji genów.

Badanie ekspresji genów.

PCR multipleks

PCR multipleks

Metoda polega na jednoczesnej amplifikacji kilku

Metoda polega na jednoczesnej amplifikacji kilku

fragmentów DNA, różniących się wielkością, co w

fragmentów DNA, różniących się wielkością, co w

praktyce polega na użyciu w jednej mieszaninie

praktyce polega na użyciu w jednej mieszaninie

reakcyjnej kilku par starterów.

reakcyjnej kilku par starterów.

Zastosowanie:

Zastosowanie:

Jednoczesna amplifikacja kilku regionów

Jednoczesna amplifikacja kilku regionów

jednego lub kilku genów. W jednej

jednego lub kilku genów. W jednej

reakcji

reakcji

uzyskać można nawet 13

uzyskać można nawet 13

amplikonów.

amplikonów.

PCR-RFLP

PCR-RFLP

(ang. restriction fragment length polymorphism PCR)

(ang. restriction fragment length polymorphism PCR)

Połączenie reakcji PCR z analizą restrykcyjną. Produkty

Połączenie reakcji PCR z analizą restrykcyjną. Produkty

amplifikacji poddaje się działaniu enzymu restrykcyjnego

amplifikacji poddaje się działaniu enzymu restrykcyjnego

i porównuje wzór powstałych prążków.

i porównuje wzór powstałych prążków.

Zastosowanie:

Zastosowanie:

Wykrywanie znanych mutacji/polimorfizmów.

Wykrywanie znanych mutacji/polimorfizmów.

Analiza bezpośrednia – mutacje

Analiza bezpośrednia – mutacje

Analiza pośrednia – polimorfizmy

Analiza pośrednia – polimorfizmy

Real-time PCR

Real-time PCR

(PCR w czasie rzeczywistym)

(PCR w czasie rzeczywistym)

Metoda ilościowa pozwalająca na obserwowanie amplifikacji

Metoda ilościowa pozwalająca na obserwowanie amplifikacji

w czasie rzeczywistym. Wraz z przybywaniem produktów PCR

w czasie rzeczywistym. Wraz z przybywaniem produktów PCR

wzrasta intensywność fluorescencji rejestrowanej przez detektor.

wzrasta intensywność fluorescencji rejestrowanej przez detektor.

Odzwierciedlone jest to w postaci wykresu na monitorze

Odzwierciedlone jest to w postaci wykresu na monitorze

komputera.

komputera.

Zastosowanie:

Zastosowanie:

Pomiar liczby cząsteczek wirusów lub bakterii w

Pomiar liczby cząsteczek wirusów lub bakterii w

materiałach

materiałach

klinicznych.

klinicznych.

Umożliwia monitorowanie postępów leczenia

Umożliwia monitorowanie postępów leczenia

(określenie wyjściowego poziomu wiremii lub

(określenie wyjściowego poziomu wiremii lub

bakteriemii jest

bakteriemii jest

wskazaniem koniecznym do

wskazaniem koniecznym do

rozpoczęcia właściwego leczenia).

rozpoczęcia właściwego leczenia).

Nested-PCR

Nested-PCR

(PCR gniazdowy)

(PCR gniazdowy)

Stosowane są dwie pary starterów: zewnętrzna

Stosowane są dwie pary starterów: zewnętrzna

(komplementarna do końców poszukiwanej sekwencji)

(komplementarna do końców poszukiwanej sekwencji)

i wewnętrzna (przyłącza się przyśrodkowo w stosunku do

i wewnętrzna (przyłącza się przyśrodkowo w stosunku do

pierwszej pary starterów). Produkt powstały po amplifikacji

pierwszej pary starterów). Produkt powstały po amplifikacji

z pierwszą parą starterów poddaje się kolejnej amplifikacji z

z pierwszą parą starterów poddaje się kolejnej amplifikacji z

druga parą. Zapewnia to większą specyficzność metody.

druga parą. Zapewnia to większą specyficzność metody.

Zastosowanie:

Zastosowanie:

Szybka diagnostyka zakażeń wirusowych.

Szybka diagnostyka zakażeń wirusowych.

RAPD-PCR

RAPD-PCR

(ang. random amplified polymorphic DNA)

(ang. random amplified polymorphic DNA)

Wykorzystywana, gdy nieznane są sekwencje specyficzne.

Wykorzystywana, gdy nieznane są sekwencje specyficzne.

Stosuje się krótkie uniwersalne startery, którymi amplifikuje

Stosuje się krótkie uniwersalne startery, którymi amplifikuje

się zbiór produktów, a ich liczba i długość są zależne od

się zbiór produktów, a ich liczba i długość są zależne od

sekwencji nukleotydowej matrycy oraz warunków reakcji.

sekwencji nukleotydowej matrycy oraz warunków reakcji.

Zastosowanie:

Zastosowanie:

Określenie zmienności genetycznej bez

Określenie zmienności genetycznej bez

informacji o sekwencji

informacji o sekwencji

analizowanego DNA

analizowanego DNA

RACE-PCR

RACE-PCR

(ang. rapid amplification of cDNA ends)

(ang. rapid amplification of cDNA ends)

Technika umożliwiająca otrzymanie pełnej długości

Technika umożliwiająca otrzymanie pełnej długości

sekwencji gdy znany jest tylko fragment.

sekwencji gdy znany jest tylko fragment.

Zastosowanie:

Zastosowanie:

Klonowanie cDNA.

Klonowanie cDNA.

ASA-PCR

ASA-PCR

(ang. allele specific amplification)

(ang. allele specific amplification)

Technika umożliwiająca wykrywanie mutacji przy

Technika umożliwiająca wykrywanie mutacji przy

pomocy specyficznych oligonukleotydów. Oprócz

pomocy specyficznych oligonukleotydów. Oprócz

starterów flankujących stosuje się starter w pełni

starterów flankujących stosuje się starter w pełni

komplementarny do allela z mutacją lub startery, z

komplementarny do allela z mutacją lub startery, z

kórych jeden jest w pełni komplementarny do allela

kórych jeden jest w pełni komplementarny do allela

z mutacją a drugi do allela niezmutowanego.

z mutacją a drugi do allela niezmutowanego.

Startery są tak zlokalizowane, że w wyniku PCR

Startery są tak zlokalizowane, że w wyniku PCR

powstają produkty różniące się długością w

powstają produkty różniące się długością w

zależności od genotypu użytej próbki DNA.

zależności od genotypu użytej próbki DNA.

Zastosowanie:

Zastosowanie:

Wykrywanie znanych mutacji.

Wykrywanie znanych mutacji.

Competitive-PCR

Competitive-PCR

(PCR konkurujący)

(PCR konkurujący)

W mieszaninie reakcyjnej umieszcza się DNA badane

W mieszaninie reakcyjnej umieszcza się DNA badane

oraz DNA kontrolne o znanym stężeniu. W wyniku

oraz DNA kontrolne o znanym stężeniu. W wyniku

konkurowania o reagenty ilość produktu DNA

konkurowania o reagenty ilość produktu DNA

kontrolnego będzie odwrotnie proporcjonalna do

kontrolnego będzie odwrotnie proporcjonalna do

ilości DNA badanego w probówce.

ilości DNA badanego w probówce.

Zastosowanie:

Zastosowanie:

Ocena ilościowa produktu.

Ocena ilościowa produktu.