Badanie mikrobiologiczne pasz

Wymagania mikrobiologiczne - wg PN 64 791:1994 dla pasz roślinnych

Bakterie:ogólna licz drobnoustrojów tlenowych mezofilnych-nie więcej niż 3,0 x10

6

/1g

- beztlen laseczki przetrwalnikujące (Clostridium sp.) - niedopuszczalne w 0,0001 g
- tlenowe laseczki przetrwalnikujące (laseczki wąglika) - niedopuszczalne w 0,1 g
-gronkowce choro - niedopuszczalne pow. 10

4

/1g - Salmonella spp. - nieobecna w 25 g

Drożdże i pleśnie (dopuszczalna li w 1 g): 1.mieszaniki paszowe 2x10

5,

premiksy 1x 10

5,

poekstracyjna śruta z roślin

oleistych 7x10

5

, inne surowce poch roslinnego 2x10

5

,

Wymagania mikrobiologiczne dla pasz pochodzenia zwierzęcego (obligatoryjne)
Rozporządzenie Komisji nr 142/2011 z dnia 25 lutego 2011r. – (załącznik XIII, rozdział II)
I. gryzaki dla psów oraz przetworzona karma
Salmonella- nieobecna w 25 g/n = 5/c = 0/m = 0/M = 0;
pałeczki jelitowe (Enterobacteriaceae): n = 5/c = 2 /m = 10/M = 300 jtk/1 g
II. Karma surowa Salmonella – nieobecna w 25 g/n = 5/c = 0/m = 0/M = 0;
Pałeczki jelitowe (Enterobacteriaceae) n = 5/c = 2/m = 10 jtk/g/M = 5 000 jtk/g
n - ilość próbek, c - liczba próbek, w których licz bakterii zawiera się między m i M, próbka jest w dalszym ciągu
uznawana za zadowalającą, jeżeli liczba bakterii pozostałych próbek jest równa m lub mniej.
m - wartość graniczna liczby bakterii (jeśli wszystkie próbki poniżej m – wynik zadowalający)
M – maksymalna wartość dla liczby bakterii (jeżeli choć jedna próbka = M – wynik niezadowalający)
Metodyka badań mikrobiologicznych
1. Przygotowanie próbek do badań mikro zgodnie zPN-EN ISO 6887-4 – Mikro żywności i pasz.
Przygotowanie próbek, zawiesiny wyjściowej i rozcieńczeń dziesięciokrotnych do badań mikrobiologicznych.

Pasze sypkie, twarde 20 g próbki + 180 ml roztworu fizjologicznego soli z peptonem,

Wymieszać, odstawić w temp. pokojowej na 30 min (jeśli zawiesina jest zbyt gęsta dodać roztwór soli z peptonem,aż do
uzyskania rozcieńczenia 1 : 20), następnie homogenizacja przez 1 min
2. Oznaczanie ogólnej liczby drobnoustrojów żywych oraz pałeczek jelitowych

*zgodnie z PN-EN ISO 4833 – Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczby
drobnoustrojów. Metoda płytkowa w temp. 30

0

C

*PN-ISO 21528-2 - Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby
Enterobacteriaceae. Metoda płytkowa.
Schemat oznaczania ogólnej liczby drobnoustrojów żywych oraz pałeczek jelitowych
Wyliczanie liczby drobnoustrojów w 1 g paszy: a = [Σc /(n1 + 0,1 n2)] x d → Σc - suma liczonych kolonii; n1 – liczba
płytek z niższego rozcieńczenia; n2 - liczba płytek z wyższego rozcieńczenia; d – wskaźnik rozcieńczenia (stosujemy z
mniejszego).

3. Oznaczanie ogólnej liczby drożdży i pleśni

*zgodnie z PN-ISO 21527-1 – Horyzontalna metoda oznaczania liczby drożdży i pleśni.
Część 1: Metoda liczenia kolonii w produktach o aktywności wodnej wyższej niż 0,95. PN-ISO 21527-2 –
Horyzontalna metoda oznaczania liczby drożdży i pleśni.

Część 2: Metoda liczenia kolonii w produktach o aktywności wodnej niższej niż 0,95.

Jeśli a

w

≥ 0,95 płyn do rozcieńczeń – 0,1% roztwór wody peptonowej

podłoże DRBC: agar z dichloranem,różem bengalskim i chloramfenikolem- inkubacja 5 dni, 25

0

C

Jeśli a

w

< 0,95płyn do rozcieńczeń – 0,1% roztwór wody peptonowej z dodatkiem 20 - 35% glukozy lub

glicerolu(minimalizacja szoku osmofilnego dla pleśni kserofilnych i drożdży osmofilnych)
podłoże DG18: agar z dichloranem,18% dodatkiem glicerolui chloramfenikolem- inkubacja 5-7 dni, 25

0

C

4. Oznaczanie pałeczek Salmonella

*zgodnie z PN-EN ISO 6579 - Horyzontalna metoda wykrywania Salmonella spp.

Oznaczanie obecności Salmonella sp. w próbkach żywności obejmuje kilka etapów:

^I.Przednamnżanie na wodzie peptonowej (próbka żywnosci 25g/ml +woda peptonowa225ml → inkubacja
37C/18+=3godz.
^II. Namnażanie selektywne na płynnych pożywkach selektywnych a)0,1 ml → pożywka RVS-10ml-
>inkubacja;41,5C/24h b) 1ml->pożywka KKTTn/10ml/-37C/24h
^ III. Różnicowanie na podłożach agarowych a) podłorze XLD (inkubacja 27/24h) b)podłoze Hektonere c)podłozeBGA
(ink.48C/24h) → podłorze agar 9ink. 37C/48h
^ IV. Identyfikacja w oparciu o testy biochemiczne i serologiczne
5. Oznaczanie gronkowców koagulazo-dodatnich
*PN-A-82055-9:1994 Mięso i przetwory mięsne. Badania mikrobiologiczne. Wykrywanie obecności liczby
Staphylococcus aureus.
*PN-EN ISO 6888-1:2001/A1:2004 Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczby
gronkowców koagulazo-dodatnich (S. aureus i innych gatunków). Część 1: Metoda z zastosowaniem pożywki
agarowej Baird-Parkera.
*PN-EN ISO 6888-2:2001/A1:2004 Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczby
gronkowców koagulazo-dodatnich (S. aureus i innych gatunków). Część 2: Metoda z zastosowaniem pożywki
agarowej z plazmą króliczą i fibrynogenem.
*PN-EN ISO 6888-3:2004/AC:2005 Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczby
gronkowców koagulazo-dodatnich (S. aureus i innych gatunków). Część 3: Wykrywanie obecności i oznaczanie
małych liczb metodą NPL
Schemat badania (PN-A-820055-9:1994):
1. 20 g próbki + 180 ml wody peptonowej, mieszamy i rozdrabniamy w stomacherze,
(uzyskujemy rozcieńczenie badanego materiału 1:10)
2. Wykonujemy kolejne dziesiętne rozcieńczenia
3. Przesiewamy po 1ml próbki z danego rozcieńczenia do podłoża płynnego namnażającego Giolitti i Cantoni.
4. Posiewamy na podłoże stałe selektywne Baird-Parkera
5. Przesiew podejrzanych kolonii na podłoże płynne BHI (Brain Heart Infusion)
lub agar z krwią (w celu uzyskania czystego szczepu do dalszych badań)
6. Wykonujemy próbę na: a. zdolność wytwarzania koagulazy b. Clumping factor (CF) (tzw. czynnik zlepiający) -
przy wykorzystaniu plazmy krwi króliczej
6. Oznaczanie liczby Clostridium perfringens
*zgodnie zPN-EN ISO 7937 – Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczby Clostridium
perfringens. Metoda liczenia koloni.
Wykonanie:
1. 20 g próbki + 180 ml wody peptonowej, mieszamy i rozdrabniamy w stomacherze, (uzyskujemy rozcieńczenie
badanego materiału 1:10)
Wykonujemy kolejne dziesiętne rozcieńczenia 3. Przesiewamy (posiew zalewowy) po 1ml próbki z danego
rozcieńczenia do płytek Petriego i zalewamy dwukrotnie pożywką agarową z siarczanem (IV) i cykloseryną (SC)
ink. 37

0

C przez 20-22 h, w warunkach beztlenowych.

4. liczymy podejrzane kolonie.-> Bakterie C. perfringens otoczone są czarną strefą precypitatu, spowodowanego
redukcją siarczanów (IV) do siarczków, co powoduje także zaczernienie kolonii.
5. Potwierdzenie obecności podejrzanych kolonii jako C. perfringens
przy zastosowaniu pożywki: laktozowo-siarczanowej(IV) lub laktozowo-żelatynowej lub poprzez badanie
zdolności ruchu i redukcji azotanów
Potwierdzenie obecności C. perfringens - pożywka laktozowo-siarczanowa(IV)
Schemat badania:1. podejrzane kolonie przesiewamy do płynnej pożywki z tioglikolanem - ink. 24 h, 37

0

C, warunki

beztlenowe, 2. po inkubacji przenosimy 5 kropli hodowli do płynnej pożywki laktozowo-siarczanowej – ink. w łaźni
wodnej w temp. 46

0

C, 24 h,

Interpretacja: wynik dodatni: wypełnienie gazem probówek Durhama w więcej niż ¼ i obecność czarnego precypitatu.
7. Oznaczanie Bacillus sp. zgodnie z PN-EN ISO 7932 -
Horyzontalna metoda oznaczania liczby przypuszczalnych Bacillus cereus.
Metoda liczenia kolonii w temperaturze 30

0

C.

Schemat badania:1. 20 g próbki + 180 ml wody peptonowej, mieszamy i rozdrabniamy w stomacherze, (uzyskujemy
rozcieńczenie badanego materiału 1:10) 2. Wykonujemy kolejne dziesiętne rozcieńczenia 3. Przesiewamy po 0,1 ml
(posiew powierzchniowy) próbki z danego rozcieńczenia do płytek Petriego z pożywką MYP (ekstrakt mięsny,
mannitol, żółtko jaja, polimyksyna B - Mannitol, Yolk, Polymyxin ink. 30

0

C przez 24-48 h, w warunkach tlenowych.

4. Liczymy podejrzane (przypuszczalne) kolonie B. cereus Kolonie B. cereus są: - duże, - różowe - co wskazuje na
fermentację mannitolu, - otoczone strefą zmętnienia – co wskazuje na wytworzenie lecytynazy,
Potwierdzenie obecności B. cereus: - test na hemolizę na pożywce agarowej z krwią - podejrzane kolonie przesiewamy
na podłoże agarowe z krwią baranią, ink. 30

0

C przez 24h. Szczepy B. cereus powodują hemolizę.

dr hab. Jarosław Bystroń

Substancje niepożądane (ksenobiotyki) w paszach:*Dioksyny oraz PCB *Melamina *Pestycydy *Kokcydiostatyki
jonoforowe *Histomonostatyki *Metale ciężkie *Antybiotykowe stymulatory wzrostu *Mykotoksyny *Produkty
lecznicze skreślone z rejestru środków farmaceutycznych *Substancje aktywne w paszach leczniczych (np. tiamulina,
doksycyklina, linkomycyna) *Toksyny roślinne *Nasiona chwastów *Sub radioaktywne - cez-134 i cez-137 Dioksyny –
dzielimy na:1. PCDD (polichlorowane dibenzodioksyny) 2. PCDF (polichlorowane dibenzofurany) 3. dl-PCB
(dioksynopodobne polichlorowane bifenyle)
TCDD (tetrachlorodibenzodioksyna) – najbardziej toksyczna dioksyna
*TEF - Toxic Equivalency Factor Przyjęty w celu oceny ryzyka zdrowia ludzkiego w trakcie posiedzenia Światowej
Organizacji Zdrowia (WHO), które odbyło się w Sztokholmie w dniach 15–18 czerwca 1997 r.
toksyczność- wywołują efekt toksyczny poprzez aktywację wewnątrzkomórkowego receptora węglowodorów
aromatycznych (Ah),co prowadzi do modyfikacji ekspresji genów w komórce. - dioksyny należą do tzw. destruktorów
endokrynowych, która objawia się głównie toksycznością reprodukcyjną (bezpłodność, poronienia) TDI (na dzień) dla
człowieka-4 pq TEQ /kg m.c .TWI (Tol tyg pobranie)–14 pq TEQ /kg m.c.
Obecnie dzienne spożycie dioksyn w krajach UE wynosi: 1,2 – 3 pq TEQ /kg m.c.
TEQ – Toxic Equivalent (ekwiwalent toksyczny)- ogólna zawartość dioksyn i związków pokrewnych (dioksynopodobne
PCB) w postaci ekwiwalentu toksycznego
Główne źródła dioksyn:- spalarnie komunalne i przemysłowe- produkcja tworzyw sztucznych na bazie PCV- produkcja
pestycydów chlorowanych- produkcja papieru (proces wybielania masy celulozowej chlorem) - spalanie benzyny-
dodawanie chloru do ścieków- pożary lasów → Dioksyny kumulowane są w roślinach oleistych → jako pasze trafiają do
zwierząt gospodarskich (odkładane są głównie w tkance tłuszczowej i wątrobie) → żywność dla ludzi.
Żywność pochodzenia zwierzęcego predysponowana do kumulacji dioksyn: mleko i produkty mleczne, tłuszcz
zwierzęcy, wątroba, tłuste ryby z łowisk śródlądowych i przybrzeżnych,
Produkty żywnościowe stanowią źr 90% dziennej pobranej dawki dioksyn przez ludzi.
Melamina (2,4,6-triamino-1,3,5-triazyna): związek powszechnie stosowany w przemyśle chemicznym do produkcji
plastików, niekiedy celowo dodawany do paszy i/lub żywności w celu zafałszowania wskaźnika zawartości białka.
Toksyczność dla zw: dobrze się wchłania z p. pok., wydalana w 90% z moczem, u zw monogastrycznych praktycznie
nie jest metabolizowana, toksyczność ostra jest niska, LD

50

= 3300 mg/kg m.c. wielokrotne podawanie melaminy (tox

przewlekła) wywołuje pojawienie się kamieni w kanalikach proksymalnych oraz w pęcherzu moczowym. Efekty te
zaobserwowano u psów po 90 dniach podawania melaminy w ilości 1200 mg/kg m.c./dzień
Melamina – dopuszczalna zawartość w paszach - 2,5 mg/kg za wyjątkiem dodatków paszowych: mocznika biuretu -
niedopuszczalne kwasu guanidynooctowego
Metale ciężkie i substancje organiczne *Arsen *Kadm *Fluor *Ołów *Rtęć*Azotany
Arsen Materiały paszowe - 2 mg/kg z wyjątkiem:mączki sporządzonej z trawy, z suszonej lucerny i z suszonej
koniczyny oraz suszonych wysłodków buraczanych i suszonych wysłodków buraczanych melasowanych -4
mg/kg*makuchu z rdzenia palmy-4 mg/kg*fosforanów oraz morskich alg wapiennych-10 mg/kg*węglanu wapnia-15
mg/kg*tlenku magnezu i węglanu magnezu-20 mg/kg*ryb, innych zwierząt wodnych i produktów z nich otrzymanych-
25 mg/kg *mączek z wodorostów morskich oraz materiałów paszowych uzyskanych z wodorostów morskich- 40 mg/kg
Kadm Mat paszowe pochodzenia roślinnego1 mg/kg*Mat paszowe pochodzenia zwierzęcego 2 mg/kg*Mat paszowe
pochodzenia mineralnego 2 mg/kg *Premiksy 15 mg/kg
Fluor Mat paszowe-150 mg/kg z wyjątkiem: — materiałów paszowych pochodzenia zwierzęcego, - 500 mg/kg - z
wyjątkiem skorupiaków morskich, takich jak kryl morski - skorupiaków morskich, takich jak kryl morski - 3 000
mg/kg )Mieszanki paszowe pełnoporcjowe- 150 mg/kg
Ołów Materiały paszowe- 10 mg/kg z wyjątkiem(: — zielonki - 30 mg/kg — fosforanów oraz morskich alg wapiennych-
15 mg/kg )Premiksy- 200 mg/kg
Rtęć Materiały paszowe - 0,1 mg/kg z wyjątkiem: (— ryb, innych zwierząt wodnych i produktów z nich otrzymanych
- 0,5 mg/kg )Mieszanki paszowe - 0,1 mg/kg
Azotany Materiały paszowe -15 mg/kg (z wyjątkiem: — mączki rybnej - 30 mg/kg) Mieszanki paszowe pełnoporcjowe
- 15 mg/kg
Kokcydiostatyki jonoforowe → monenzyna, salinomycyna, narazyna, lasalocyd, maduramycyna, diklazuril,
dekokwinat, nikarbazyna stosowane u drobiu i królików.
**Zagrożenia wynikające ze stosowania kokcydiostatyków w paszach; * niewielka różnica między dawką leczniczą a
toksyczną * przenoszenie kokcydiostatyków,(tzw. nieuniknione zanieczyszczenie krzyżowe)
* W celu umożliwienia producentowi pasz kontroli nad nieuniknionym zanieczyszczeniem krzyżowym – w przypadku
pasz dla mniej wrażliwych gatunków zwierząt – uznaje się za możliwą do przyjęcia zawartość kokcydiostatyków w
paszy, dla której substancje te nie są przeznaczone, na poziomie około 3 % max dopuszczalnej zawartości.
* W przypadku pasz dla wrażliwych gatunków zwierząt oraz pasz stosowanych w okresie poprzedzającym ubój
należy uznać za możliwą do przyjęcia zawartość zanieczyszczeń w paszy, dla której substancje te nie są przeznaczone,
na poziomie około 1 % maksymalnej dopuszczalnej zawartości. Kokcydiostatyki – dopuszczalne limity w paszach, w
których, wskutek nieuniknionego zanieczyszczenia krzyżowego obecność kokcydiostatyków jest
dopuszczonamg/kg*Lasalocid-1,25*Diklazuril-0,01*Dekokwinat -0,4 *Monenzyna-1,25 *Narazyna0,7
Pestycydy (z grupy węglowodorów chlorowanych)
Dopuszczalne limity pozostałości wybranych pestycydów w paszachmg/kg* Aldryna-0,01 *Dieldryna-0,1*Kamfechlor-
0,02*Chlordan-0,02 *DDT-0,5*Endosulfan-0,1*Endryna-0,01*Heptachlor- 0,01*Heksachlorobenzen-
0,01*Heksachlorocykloheksan-0,02
Antybiotykowe stymulatory wzrostu ->Do 31 grudnia 2005 r. w krajach UE można było dodawać do pasz
antybiotykowe stymulatory wzrostu. Od 1 stycznia 2006 obowiązuje całkowity zakaz ich stosowania.
Produkty lecznicze skreślone z rejestru środków farmaceutycznych Amprolium Nitrofurany Chloramfenikol
Toksyny roślinne Kwas cyjanowodorowy Teobromina Winylotiooksazolidon Lotny olejek gorczyczny
Nasiona chwastów(oraz niezmielone i nierozdrobnione owoce zawierające alkaloidy, glukozydy lub inne substancje
toksyczne), Daturia sp. Crotalaria sp. Ricinus communis Croton tiglium niełuskane orzechy bukowe Gorczyca (Brassica
sp.)Ambrosia sp.

Uwarunkowania prawne stosowania w Polsce pasz zawierających GM
- „genetycznie zmodyfikowana pasza” oznacza paszę zawierającą, składającą się lub wyprodukowaną z GMO.
- „genetycznie zmodyfikowany organizm do użytku paszowego” oznacza GMO, który może być użyty, jako pasza
lub materiał źródłowy do produkcji paszy.
**Zgodnie z Ustawą o Paszach z dnia 22 lipca 2006 roku, art. 15.:
Zabrania się wytwarzania, wprowadzania do obrotu i stosowania w żywieniu zwierząt:
pasz genetycznie zmodyfikowanych oraz organizmów genetycznie zmodyfikowanych przeznaczonych do użytku
paszowego.-> Jednakże na podstawie nowelizacji ustawy o paszach -
Ustawa z dnia 26 czerwca 2008 r. o zmianie ustawy o paszach z 2006 r. -
zezwala się na stosowanie pasz zawierających organizmy GMO do 31 grudnia 2012 roku
Za zagadnienia związane z wykorzystaniem organizmów genetycznie zmodyfikowanych w Polsce, odpowiada Minister
Środowiska (Ustawa z dnia 22 czerwca 2001 roku o organizmach genetycznie zmodyfikowanych)
Do głównych obowiązków Ministra Środowiska należą m.in.: *wydawanie zezwoleń na prowadzenie zakładów
inżynierii genetycznej, *przyjmowanie zgłoszeń zamkniętego użycia, *wydawanie decyzji w sprawach zamierzonego
uwolnienia GMO do środowiska w celach doświadczalnych, *wydawanie decyzji w sprawach wprowadzenia do obrotu
GMO jako produkt lub w produktach, *koordynacja kontroli i monitorowania działalności w zakresie GMO, → W UE
do zastosowania w żywieniu zwierząt możliwe są tylko i wyłącznie odmiany GMO zatwierdzone przez Komisję
Europejską. → Komisja ustanawia i prowadzi wspólnotowy rejestr genetycznie zmodyfikowanej żywności i paszy, który
udostępnia się publicznie.
Pasze GMO nie mogą: *wywierać szkodliwych skutków dla zdrowia ludzi, *zwierząt lub środowiska naturalnego,
*wprowadzać użytkownika w błąd,*szkodzić ani wprowadzać konsumenta w błąd z powodu pogorszenia szczególnych
cech produktów zwierzęcych, *nie mogą odbiegać jakością od pasz naturalnych.
>>> Zgodnie z rozporządzeniem 1830/2003 istnieje obowiązek etykietowania pasz zawierających GMO. Jednakże
obowiązek ten nie dotyczy paszy zawierającej materiał, który składa się lub jest wyprodukowany z GMO w części nie
większej niż 0,9% paszy.
Każdy zmodyfikowany materiał paszowy oraz mieszanka zawierająca lub składająca się z GMO powinny, obok nazwy
paszy, zawierać określenie „genetycznie zmodyfikowany (nazwa organizmu)”. lub„wyprodukowano z genetycznie
zmodyfikowanego (nazwa organizmu)
Na etykiecie powinny być także zawarte informacje o właściwościach paszy, jeśli odbiegają od właściwości pasz
tradycyjnych.
Zgodnie z rozporządzeniem 1830/2003 istnieje również obowiązek śledzenia (identyfikacji) pasz wyprodukowanych z
GMO.Przy wprowadzaniu do obrotu pasz GMO, podmioty gospodarcze powinny przekazać kolejnym odbiorcom
produktu:- informacje, że produkt zawiera GMO,- niepowtarzalny identyfikator nadany GMO,- określenie składnika/
składników wyprodukowanych z GMO.Podmioty gospodarcze powinny przechowywać informację (identyfikację
produktu GMO) przez okres 5 lat po każdej transakcji kupna – sprzedaży.
-----------------------------------------------------------------
Oznaczanie zawartości włókna oraz azotynów i azotanów w paszach
Azotyny i azotany- Zagadnienie istotne gdyż… 1. potencjalne zagrożenie dla zdrowia i życia ludzi oraz zwierząt 2.
zagrożenie dla środowiska 3. wpływ na produkcję zwierzęcą- straty ekonomiczne
Obieg azotu w przyrodzie  atmosfera ziemska- 78% N2 , główne źródło tego pierwiastka dla biosfery  rola azotu i
jego związków  przyswajanie N2 z atmosfery >> bakterie azotowe przekształcające formę gazową w związki
chemiczne, e. nitrogenaza >>NH4+ , glutamina  amoniak>>bakterie nitryfikacyjne>> NO3- i NO2- i zw. organiczne
potrzebne dla funkcjonowania organizmów żywych  rośliny pobierają azot poprzez systemy korzeniowe w
formiejonów azotanowych, azotynowych i amonowych
Źródła azotynów i azotanów nawozy sztuczne nawozy naturalne: obornik, gnojowica nieprzestrzeganie Zasad







Dobrej Praktyki Rolniczej w nawożeniu nieszczelne szamba zanieczyszczenie środowiska zw. przemysłem





azotowym, wytwarzaniem szkła, materiałów wybuchowych
W produkcji żywności, jako substancje dodatkowe stosowane są: azotyn sodu E250 azotyn potasu E249 azotan







sodu E251 azotan potasu E252





najszersze zastosowanie w przemyśle mięsnym,



ponadto sery dojrzewające, śledzie, szprotki marynowane w occie,  zahamowanie rozwoju drobnoustrojów... 

barwa, aromat  ADI azotany 0-3,7 mg/kg ; azotyny 0-0,07 mg/kg

Źródła azotynów i azotanów
w medycynie ludzkiej i weterynaryjnej pochodne tych związków stosowane są jako:
1. środki rozszerzające oskrzela i naczynia krwionośne 2. w weterynarii: azotyn sodu używany miejscowo jako
antyseptyk (prewencja mastitis etc.)

Główne źródła narażenia zwierząt gospodarskich:
*azotany i azotyny obecne ‘naturalnie’ w roślinach przeznaczanych na paszę ,*niesprzyjające warunki atmosferyczne-
jakie? *nieodpowiednie przygotowywanie i przechowywanie *aktywność mikroorganizmów obecnych w paszy, pasza
nadgniła, spleśniała *pasze z obszarów intensywnie nawożonych substancje konserwujące dodawane do niektórych
materiałów paszowych (kiszonka, pokarm dla zw. domowych, dawniej FM) pośrednio woda
>>>zróżnicowana zawartość azotanów w roślinach przeznaczanych na paszę zależy od: 1. gatunku: istnieją gatunki
roślin (ponad 80!) znane ze swej zdolności do kumulacji znacznych ilości azotanów 2. ‘okresu dojrzałości’ rośliny 3.
intensywności nawożenia 4. warunków wzrostu (herbicydy, niskie temperatury lub przymrozki, zacienienie, susza) 5.
części rośliny: łodygi, trzony, dolne liście/ nasiona

„substancja niepożądana” oznacza jakąkolwiek substancję lub produkt, z wyjątkiem czynników patogennych, która jest
obecna na zewnątrz lub wewnątrz produktu przeznaczonego do żywienia zwierząt oraz która stanowi potencjalne
niebezpieczeostwo dla zdrowia zwierząt lub ludzi bądź dla środowiska lub może niekorzystnie wpływad na produkcję
zwierzęcą
Azotyny i azotany- niekorzystny wpływ na zwierzęta
1. spadek mc 2. pomniejszenie śledziony, nerek, mięśnia sercowego 3. obniżenie parametrów nasienia 4. procesy
nowotworzenia w obrębie pp 5. hematopoeza pozaszpikowa 6. działanie mutagenne- in vitro Salmonella Typhimurium
szczep TA 100, ale brak reklasyfikacji jako subs. genotoksyczna (JECFA)
- niekorzystny wpływ na zw. gospodarskie
zróżnicowany, zależny od: 1. wieku 2. gatunku 3. stanu zdrowia, kondycji 4. zatrucia najczęściej notowane u Ru 5. gleba-
zagrożenie dla zwierząt wypasanych
Azoyny i azotany- niekorzystny wpływ na zw. Gospodarskie / gat szczególnie podatne na zatrucie: Bo(Ru), Su …
szybki metabolizm i wydzielanie tych zawiązków- niskie prawdopodobieostwo kumulacji w tkankach zwierzęcych!
/produkty pochodzenia zwierzęcego- niewiele danych ilościowych nt. pozostałości!
najwięcej zatrud u bydła: 1. skarmianie znacznych ilości zielonek 2. uwarunkowania fizjologiczne (żwacz pH>5, gęsta
populacja bakteryjna, ‘metabolic overload’)
ostre obj zatrucia: wymioty, niestabilny chód, tachykardia, sinica, duszność, drżenia mięśniowe, osłabienie...
toksycznośd przewlekła: spadek spożycia paszy, ronienia, obniżone wskaźniki płodności (niedobór wit., zaburzona
steroidogeneza), działanie goitrogenne u drobiu, spadek mleczności krów mlecznych
Methemoglobina, methemoglobinemia toksyczna >zasadnicze toksyczne oddziaływanie azotynów
w warunkach prawidłowych żelazo w cząsteczce Hb występuje w postaci zredukowanej w RBC osób zdrowych- stały
proces tworzenia i redukcji niewielkich ilości MtHb; układ reduktazy NADH- methemoglobiny
działanie związków methemoglobinotwórczych- nadmiar MtHb przekraczający możliwości procesów redukcyjnych gdy
MtHb przekracza 20%... co sprzyja methemoglobinemii? Methemoglobina, methemoglobinemia toksyczna /
mechanizmy ochronne- methemoglobinemia
Azotyny i azotany w produktach pochodzenia zwierzęcego człowiek- narażenie na azotyny 20% stanowią źródła zw. z
codzienną dietą: 11-41% owoce i warzywa 35-39% produkty pochodzenia zwierzęcego 5-7% woda inne pokarmy: 15%-
47% pozostałe 80% narażenia wynika z endogennych przemian azotanów (ślina!!!)



NITROZOAMINY Oznaczanie azotynów i azotanów w paszy Oficjalna metody analityczna do określania zawartości

azotynów i azotanów w paszy to metoda kolorymetryczna

**Oznaczanie zawartości azotynów i azotanów w paszach po enzymatycznej redukcji azotanów do azotynów (PN-EN
ISO 12014-3:2006)

Zasada metody → Azotyny w wodnym ekstrakcie badanej próbki reagują z sulfanilamidem i dichlorowodorkiem
N-(1-naftylo)-etylenodiaminy. Powstały, zabarwiony na czerwono związek, mierzony jest spektrofotometrycznie przy
długości fali 540 nm.
**Oznaczanie zawartości azotynów i azotanów w paszach po enzymatycznej redukcji azotanów do azotynów (PN-EN
ISO 12014-3:2006)
Zasada metody → Oznaczenie zawartości azotanów wymaga ich zredukowania do azotynów. Zawartośd azotanów
obliczana jest z różnicy między pomiarami spektrofotometrycznymi.
Włókno surowe
włókno- najtrudniej strawna część węglowodanów, najtrudniej ‘rozkładalna’ frakcja spośród wszystkich składników
organicznych paszy odpowiednia zawartość istotna w żywieniu loch...
niezbędne w dawce pokarmowej, zwłaszcza Ru (niedobór: zahamowanie perystaltyki przedżołądków, obniżenie
mleczności oraz zawartości tłuszczu w mleku, biegunki, zaburzenia mikroflory żwacza), ale... między zawartością
włókna w paszy, a jej strawnością istnieje korelacja ujemna (Kellner, 1905)
im wyższa zawartość włókna- tym niższa wartość paszy
Włókno surowe → podział na 4 grupy związków: celulozę- 50-80% hemicelulozę- 20% ligninę-10-40%
pektyny w przypadku zwierząt monogastrycznych częściej stosuje się pojęcie włókna pokarmowego, szersze,
obejmujące polisacharydy nieskrobiowe (NSP) i ligninę
Włókno surowe
Fizyczna obróbka komponentów paszowych (suszenie, śrutowanie, granulacja, obróbka hydrotermiczna) oraz
oddziaływanie różnymi zw. chemicznymi, włączając kiszenie pasz, dodawanie kwasów, zasad lub zw. organicznych
wpływa na wł. fizyczne i chemiczne włókna, zwiększając jego wykorzystanie przez zwierzęta, zwłaszcza monogastryczne
zawartość włókna surowego(PN-EN ISO 6865)- ubytek masy po spopieleniu suchych pozostałości, otrzymanych w
wyniku trawienia próbki kwasem oraz zasadą zgodnie z procedurą zamieszczoną w w/w normie, podzielony przez masę
próbki analitycznej zawartość włókna surowego wyraża się gramach na kilogram; można również wyrażać jako udział
masowy w procentach.
*Oznaczanie zawartości włókna surowego w paszach metodą z pośrednią filtracją (PN-EN ISO 6865)
Zasada metody → Metoda polega na potraktowaniu próbki wrzącym rozcieńczonym H2SO4oraz wrzącym r-rem KOH.
Pozostałość odsącza się, przemywa, suszy i spopiela. Ubytek masy po spopieleniu odpowiada masie włókna w próbce
analitycznej.
*Oznaczanie zawartości włókna surowego w paszach metodą z pośrednią filtracją (PN-EN ISO 6865)
Wykrywanie azotynów i azotanów w paszach z zastosowaniem odczynnika dwufenyloaminowego pasze, treśd
przewodu pokarmowego metoda kolorymetryczna (C6H5)2NH czy w roztworze azotyny czy azotany: próba z
odczynnikiem Griess- Ilosvaya

Mikroskopowa metoda oznaczania białka obcogatunkowego w paszach
Przetworzone białko zwierzęce w środkach żywienia zwierząt mikroskopowa metoda wykrywania
TSE TSE (Transmissible Spongiform Encephalopathies; pasażowalne, gąbczaste encefalopatie)

grupa chorób centralnego układu nerwowego, wywoływana przez białko prionowe PrPsc / PrPres ( 1981r. Prusiner,



Nagroda Nobla w 1997r.) brak r. zapalnej i immunologicznej długi, kilkuletni okres inkubacji chroniczny,







kilkumiesięczny przebieg, kooczący się zawsze zejściem śmiertelnym prowadzą docelowo do degeneracji komórek



nerwowych CUN

TSE/BSE → BSE (Bovine Spongiform Encephalopathy)

jedna z chorób zaliczanych do TSE. W obrazie histopatologicznym zmiany powstałe w wyniku choroby w obrębie CUN



mają wygląd gąbki Bo: objawy ze strony układu nerwowego: porażenia, parestezje, osowiałośd lub nasilona



agresywnośd; anorexia, spadek mleczności, odstawanie od stada wszystkie rasy bydła podatne w równym stopniu





szczyt zachorowao u Bo w wieku 4-5 lat

BSE, vCJD
BSE pierwsze przypadki u Bo w Wielkiej Brytanii w 1986r. wprowadzony program eradykacyjny wiązał się z





eliminacją blisko 4,5mln sztuk pogłowia Bo w UK straty liczone w mln €



(n)vCJD- (new) variant Creutzfeldt-Jakob disease ponad 200 przypadków do 2010r., w większości z nich



potwierdzone zostało spożycie wołowiny pochodzącej z zakażonego Bo długoletni okres inkubacji, nawet kilkanaście



lat obecnie notuje się poniżej 5 przypadków/rok można zaliczyd do FBD





TSE/BSE- prawdopodobna przyczyna epizoocji… skarmianie bydła, zaliczanego do zw. roślinożernych mączkami



mięsno-kostnymi pozyskiwanymi z tkanek przeżuwaczy, co spowodowało rozprzestrzenienie się czynnika zakaźnego

mączki mięsno- kostne mogły pochodzid od owiec padłych na ‘scrapie’ do rozwoju epizoocji mogło się też





przyczynid obniżenie temperatury stosowanej podczas przetwarzania ubocznych produktów pochodzenia zwierzęcego
przeznaczanych później na paszę (UK) 133°C, 3bary, 20min



MBM- meat and bone meal → MBM/MMK- mączki mięsno-kostne

uzyskiwane z ubocznych produktów pochodzenia zwierzęcego, a także ze zwłok zw. chorych- do 1987r powszechnie



używane w Europie jako dodatek wzbogacający paszę Bo w białko
Dlaczego tak chętnie stosowane?


cenny dodatek do mieszanek treściwych  zawartośd białka od 40-60%  niskie koszty wytwarzania,

alternatywa dla maczki sojowej  wysoka strawnośd, nie zawierają włókna  bogate w aa egzogenne 
gwarantują otrzymywanie wysokich przyrostów masy ciała  ubogie w bezazotowe związki wyciągowe

PAP- processed animal proteins, przetworzone białko zwierzęce
to pojęcie znacznie szersze niż MBM, obejmuje także: mączkę mięsną, rybną, mączkę z krwi, suszone osocze i inne
produkty krwiopochodne, hydrolizowane białka, mączkę z racic, mączkę z rogów, mączkę z piór, mączkę z podrobów

drobiowych, suszone skwarki, fosforan dwuwapniowy, żelatynę, a także wszelkie inne produkty włączając w to
mieszanki, pasze, dodatki paszowe oraz premiksy, zawierające takie produkty
PAP- wysokowartościowy dodatek do pasz
przetworzone białko pochodzenia zwierzęcego stosowane w żywieniu zwierząt może pochodzid jedynie z materiału
kategorii trzeciej! …
TSE/BSE → Środki zwalczania gąbczastych pasażowalnych encefalopatii:
1. zakaz paszowy- feed ban 2. nakaz eliminacji materiału szczególnego ryzyka 3. Obecnie UE jest bliska
wyeliminowania BSE ze swej populacji bydła, niezbędne jest jednak zachowanie czujności i stały monitoring sytuacji… na
wypadek pojawienia się nowych ognisk BSE lub nowego czynnika wywołującego TSE w populacji bydła

ROZPORZĄDZENIE 1069/ 2009 z dnia 21 października 2009 r. określające przepisy sanitarne dotyczące produktów
ubocznych pochodzenia zwierzęcego, nieprzeznaczonych do spożycia przez ludzi Materiał kategorii I (w tym SRM)
Materiał kategorii II Materiał kategorii III . Do produkcji przetworzonych białek zwierzęcych i innych składników
paszowych można wykorzystywać wyłącznie materiał kategorii III !
materiał kategorii III obejmuje m.in. :


tusze i części tusz zwierząt poddanych ubojowi lub, w przypadku zwierząt łownych, całe zabite zwierzęta lub ich

części, które nadają się do spożycia przez ludzi zgodnie z przepisami wspólnotowymi, lecz nie są przeznaczone do
spożycia przez ludzi ze względów handlowych


produkty uboczne pochodzenia zwierzęcego, powstałe podczas wytwarzania produktów przeznaczonych do

spożycia przez ludzi, w tym odtłuszczone kości i skwarki



produkty pochodzenia zwierzęcego lub środki spożywcze zaw. produkty pochodzenia zwierzęcego, które nie nadają

się do spożycia przez ludzi z powodów handlowych lub w wyniku problemów powst. podczas w produkcji lub wad w
pakowaniu lub innych wad, które nie stanowią żadnego zagrożenia dla zdrowia ludzi i zwierząt



tusze i części pochodzące od zwierząt, które zostały poddane ubojowi w rzeźni i zostały uznane za nadające się do

uboju w celu spożycia przez ludzi w następstwie kontroli przedubojowej, takie jak: łby drobiu, szczecina świoska, pióra



krew, łożysko, wełna, rogi, ścinki z kopyt i surowe mleko pochodzące od żywych zwierząt, które nie wykazywały

żadnych oznak choroby przenoszonych przez ten produkt na ludzi lub zwierzęta



jaja, produkty uboczne z wylęgarni, jajeczne produkty uboczne poch. od zwierząt, które nie wykazywały żadnych

objawów choroby przenoszonej przez ten materiał na ludzi lub zwierzęta

SRM- Specified Risk Material
SRM- materiał szczególnego ryzyka; zaklasyfikowany do materiału kategorii I
Są to tkanki pozyskane od bydła, owiec i kóz, mogące zawierad w sobie czynnik będący przyczyną zachorowao na
pasażowalne gąbczaste encepfalopatie
Zakaz paszowy- feed ban obowiązujące przepisy
Lipiec 1994- zakaz karmienia bydła, owiec i kóz mączką mięsno-kostną ze ssaków .Początkowo częściowy zakaz
rozszerzony na całą UE (zarządzanie ryzykiem zanieczyszczenia krzyżowego pasz dla Ru)
A z dniem 1.01.2001 całkowite, bezterminowe wstrzymanie stosowania przetworzonego białka zwierzęcego w paszach
przeznaczonych dla wszystkich zwierząt hodowanych do produkcji żywności-tzw. food animals
Zasada ‚zero tolerance’- co oznacza? Zakaz paszowy- feed ban obowiązujące przepisy zwierzęta futerkowe a tzw. food



animals zakaz paszowy – co można stosowad ?



W żywieniu zwierząt gospodarskich innych niż przeżuwacze stosuje się następujące materiały paszowe pochodzące z
tkanek zwierzęcych: Mączka rybna Fosforan dwuwapniowy i fosforan trójwapniowy Produkty z krwi







pochodzące od zwierząt innych niż przeżuwacze Mleko, produkty na bazie mleka i siara Jaja i produkty jajeczne







Żelatyna od zwierząt innych niż przeżuwacze Hydrolizaty białkowe pochodzące od zwierząt innych niż przeżuwacze i



otrzymanych ze skór i skórek przeżuwaczy
Zakaz paszowy- co można stosowad u Ru?

Mleko, produkty na bazie mleka i siara Jaja i produkty jajeczne Żelatyna od zwierząt innych niż przeżuwacze









Hydrolizaty białkowe pochodzące od zwierząt innych niż przeżuwacze i otrzymanych ze skór i skórek przeżuwaczy

Zakaz paszowy o Priorytet: bezpieczeostwo żywności i ochrona konsumenta! o Zakaz powtórnego przetwarzania
wewnątrzgatunkowego (zakaz kanibalizmu) o Możliwośd uchylenia zakazu paszowego o Obecnie UE bliska
wyeliminowania BSE ze swej populacji bydła o Pozytywna sytuacja epidemiologiczna w Europie pod względem BSE
utrzymuje się od 2005 roku o Rozważane uchylenie zakazu w odniesieniu do stosowania w paszach przeznaczonych dla
zw. innych niż przeżuwacze przetworzonego białka zwierzęcego pochodzącego od zwierząt innych przeżuwacze bez
uchylania zakazu powtórnego przetwarzania wewnątrzgatunkowego
Możliwość uchylenia zakazu paszowego Ale aby zakaz został uchylony…
Konieczne wiarygodne testy umożliwiające gatunkową identyfikację śladowej zawartości mączki mięsno-kostnej!
Zakaz paszowy Obecnie PAP objęte zakazem stosowania w paszach wykorzystuje się do produkcji nawozów, kompostu
lub paliw dla cementowni
MIKROSKOPOWA METODA WYKRYWANIA PAP W ŚRODKACH ŻYWIENIA ZWIERZĄT
o Wdrożona do rutynowej diagnostyki laboratoryjnej w 2002r o Wymaga doświadczenia, zaangażowania, żmudnej
pracy  met. analityczna o długiej tradycji w jakościowym i ilościowym oznaczaniu surowców roślinnych oraz
identyfikacji tkanek roślinnych i zwierzęcych w paszach

met. referencyjna- stosowana do badań rutynowych

pozwala wykrywać białka poddane obróbce termicznej, jakiej poddawane są pasze w czasie procesu produkcji





podstawowa zaleta: możliwość wykrywania bardzo małych ilości składników pochodzenia zwierzęcego- nawet < 0,1%

MIKROSKOPOWA METODA WYKRYWANIA PAP W ŚRODKACH ŻYWIENIA ZWIERZĄT
Metoda polega na wykrywaniu PAP na podstawie charakterystycznych cech tkanek pochodzenia zwierzęcego: 1)
włókien mięśniowych 2) kości, tkanki chrzęstnej, ości ryb 3) włosów, szczeciny, piór, łusek, rogów 4) skorup jaj 5) krwi
MIKROSKOPOWA METODA WYKRYWANIA PAP W ŚRODKACH ŻYWIENIA ZWIERZĄT
Wady metody mikroskopowej: 1) pracochłonność, czasochłonność- zbadanie jednej próbki środka żywienia zwierząt
zajmuje ok. 2h 2) kosztowna 3 subiektywna

MIKROSKOPOWA METODA WYKRYWANIA PAP W ŚRODKACH ŻYWIENIA ZWIERZĄT
Wytyczne do metody : Rozporządzenie WE nr 152/2009 z dn. 27 stycznia 2009
do badania min. 50g paszy/ próbki ; materiał granulowany rozdrobnić w moździerzu lub młynku
tak przygotowany materiał przygotować dwie części o masie 5g każda- frakcję do analizy sitowej oraz do badania
zagęszczonego osadu
Schemat badania środków żywienia zwierząt metodą mikroskopową
***frakcję sitową >0,5mm należy równomiernie rozsypać na płytce Petriego, systematycznie przeglądać pod
mikroskopem stereoskopowym
frakcję sitową< 0,5mm mikroskop biologiczny, różne powiększenia, poszukiwanie el. poch. zwierzęcego  po
zagęszczaniu z tetracholoetylenem  osad + flotat  osad- obligatoryjnie badany pod mikroskopem stereoskopowym
i biologicznym  flotat- badanie nie jest obligatoryjne
***co w osadzie?  składniki kostne  ości  składniki mineralne  piasek  zdrewniałe elementy roślin
co we flotacie?  włókna mięśniowe  chrząstki  włosy  pióra
Tetrachloroetylen pozwala na oddzielenie el. kostnych od paszy oraz odtłuszczenie badanego materiału -> wyraźniejszy
obraz pojedynczych cząstek pod mikroskopem!
*** odłamki kostne ssaków- białe/ kremowe/szare  twarda konsystencja, zaokrąglone krawędzie  kości
drobiowe- ciemniejsze, miękka konsystencja, kształt wydłużony, ostre krawędzie  kości „lądowych” są
nieprzezroczyste, matowe  ości- przezroczyste i przejrzyste
***

Identyfikacja gatunkowa składników kostnych na podstawie jamek kostnych (lacunae) i kanalików kostnych

(caniculi) (200-400X)



Jamki kostne z dobrze widocznymi kanalikami kostnymi. Zdjęcie ości ryby z mikroskopu biologicznego (200x). 

Jamki i kanaliki kostne  ssaki: jamki kostne eliptyczne, prawie okrągłe, z mało widocznymi kanalikami  drób:
okrągłe i gęściej ułożone jamki kostne, kanaliki praktycznie niewidoczne, silne zagęszczenie jamek kostnych  el.
kostne porowate, ostrokrawędziowe; nierówne krawędzie kruszenia ze względu na obecnośd jamek powietrznych 
ryby- jamki kostne wydłużone, z bardzo dobrze widocznymi kanalikami

***tk. mięśniowa- gładka i poprzecznie prążkowana wchodzi w skład MBM


wygląd włókien mięśniowych jest mało charakterystyczny gatunkowo, niemożliwe jest odróżnienie czy pochodzą

one od ryb czy też „lądowych”  można dobarwiad solutio iodi aquosa  we fotacie

***włosy lub pióra- odczynnik cystynowy
krwinki- widoczna kulista struktura pod stereomikroskopem
rogi- charakterystyczne elementy podobne do bursztynu
***Podsumowanie:
wykrycie składników pochodzenia zwierzęcego na bardzo niskich poziomach (<0,1%) o możliwe różnicowanie kości zw.
lądowych i el. kostnych pochodzących od ryb o rozróżnienie kości pochodzących od ssaków i drobiu

NIE jest możliwe określenie pochodzenia gat. tk. mięśniowej
***MIKROSKOPOWA METODA WYKRYWANIA PAP W ŚRODKACH ŻYWIENIA ZWIERZĄT


laboratoria urzędowe  badania przesiewowe- met. mikroskopowa  badania odwoławcze- również met.

mikroskopowa + inne metody oraz testy pomocnicze  wynik ujemny w analizie przesiewowej jest ostateczny i nie
wymaga potwierdzenia żadnym innym badaniem  wynik dodatni lub wątpliwy w badaniu przesiewowym wymaga
potwierdzenia met. odwoławczą

MIKROSKOPOWA METODA WYKRYWANIA PAP W ŚRODKACH ŻYWIENIA ZWIERZĄT


co w sprawozdaniu z badania:  potwierdzenie/ wykluczenie obecności pap w badanej próbce  metoda

pobierania próbek  użyta metoda badania  zastosowane próby i odczynniki  wszelkie informacje z zakresu
postepowania badawczego  wszelkie informacje niezbędne do pełnej identyfikacji próby

ALTERNATYWNE METODY WYKRYWANIA I IDENTYFIKACJI GATUNKOWEJ PAP W PASZACH


Testy ELISA  PCR BADANIA BIEGŁOŚCI LABORATORIÓW URZĘDOWYCH W ZAKRESIE WYKRYWA PAP METODĄ

MIKROSKOPOWĄ

Kokcydiostatyki w paszach Metoda jakościowa wykrywania kokcydiostatyków jonoforowych
Kokcydioza u drobiu → Gromada: Apicomplexa Rodzaj : Eimeria Kokcydioza (



Coccidiosis)- znana od ponad stu lat

(Schneider 1875r., Fantham 1910r.), zaliczana do najistotniejszych parazytoz drobiu przełomu XX i XXI wieku Prócz



drobiu podatne na zarażenie są także: bydło, owce, trzoda chlewna, króliki i in. Kokcydioza największy problem



stanowi jednak w przypadku... Gatunki patogenne dla kur:



E.acervulina, E. tenella, E. maxima,



E. necatrix,

E.praecox, E. brunetti, E. mitis, W przewadze inwazje mieszane Cykl rozwojowy Wysoka odpornośd oocyst Z









czego wynika patogenne oddziaływanie kokcydiów?
Wszystkie gatunki atakujące drób grzebiący lokalizują się w przewodzie pokarmowym (duża specyficznośd względem
żywiciela...) Pasożyty wewnatrzkomórkowe!
Objawy kliniczne: od przebiegu subklinicznego po ostrą postad kliniczną!
Kokcydioza u drobiu → Co sprzyja jej wystąpieniu?  niewłaściwe warunki utrzymania ptaków (>obsada, >NH3,
zawilgocenie ściółki, niedowentylowane kurniki)  żywienie (mikotoksyny, niedobory)  czynniki stresowe, w tym
zakażenia wirusowe (MDV, IBDV, CAV, adeno- i reowirusy)
Przebieg uzależniony od...  gatunku Eimeria  patogenności pasożyta...  dawki inwazyjnych oocyst 
wieku ptaków i ich kondycji  oporności Eimeria spp. na kokcydiostatyki (…)
***

Zwalczanie i kontrola kokcydiozy  bioasekuracja...  chemioprofilaktyka  immunoprofilaktyka 

postępowanie z wyboru: stosowanie kokcydiostatyków  chemioprofilaktyka polega na stałym(!) podawaniu ptakom
preparatów kokcydiostatycznych w skarmianych mieszankach paszowych

Kokcydiostatyki
ROZPORZĄDZENIE (WE) NR 1831/2003 PARLAMENTU EUROPEJSKIEGO I RADY z dnia 22 sierpnia 2003 r. w sprawie
dodatków stosowanych w żywieniu zwierząt
dodatki paszowe: to substancje, drobnoustroje lub preparaty, inne niż materiał paszowy i premiksy, które są celowo
dodawane do paszy lub wody w celu pełnienia, w szczególności, jednej lub więcej funkcji wymienionych w art. 5 ust.3...
m.in.: korzystnie wpływają na cechy paszy, korzystnie wpływają na cechy produktów pochodzenia zwierzęcego
,zaspokajają potrzeby żywienia zwierząt ,mają działanie kokcydiostatyczne lub histomonostatyczne
ROZPORZĄDZENIE (WE) NR 1831/2003 PARLAMENTU EUROPEJSKIEGO I RADY z dnia 22 sierpnia 2003 r. w sprawie
dodatków stosowanych w żywieniu zwierząt
Obecnie do stosowania na terenie EU, na mocy powyższego rozporządzenia, dopuszczonych do stosowania jest 11
kokcydiostatyków, jako substancje dodatkowe stosowane w żywieniu zwierząt
Dodatki te można stosować tylko u zwierząt, które wymienione są w poszczególnych aktach autoryzacyjnych! (gatunki i
kategorie docelowe, tzw. ‘target-animals’)

Kokcydiostatyki → dopuszczone kokcydiostatyki chemiczne: nikarbazyna diklazuril dekokwinat halofuginon
chlorowodorek robenidyny

→ dopuszczone kokcydiostatyki jonoforowe: narazyna sól sodowa monenzyny sól sodowa salinomycyny sól sodowa
maduramycyny sól sodowa semduramycyny sól sodowa lazalocydu
Kokcydiostatyki- stosowanie Typ paszy: Starter- tak Grower- tak Finiszer- zakazane, przestrzeganie okresu karencji
przed ubojem drobiu rzeźnego
Programy stosowania: wymienny (DKA-Starter/DKA-Grower) rotacyjny (‘shuttle program’)
Kokcydiostatyki jonoforowe


Tzw. ‘jonofory’, zawierają ugrupowanie polieterowe  ‘70  Wytwarzane na drodze fermentacji z udziałem

kilku szczepów Streptomyces spp. i Actinomadura spp.  Mechanizm działania...

Oporność na jonofory pojawia się wolniej niż na kokcydiostatyki chemiczne (charakter rekombinacji genetycznej,
mutacje/ charakter adaptacyjny, zmiana biochemizmu komórkowego, przepuszczalności błony komórkowej)
Groźne interakcje z innymi lekami weterynaryjnymi- np. tiamuliną
Toksycznośd dla niektórych gatunków ‘non-target’ animals
Kokcydiostatyki w paszach
*Kokcydiostatyki dopuszczone do stosowania w paszach zwierzęcych nie są wykorzystywane do celów leczenia ludzi
*Przygotowanie niosek do nieśności *Drób rzeźny- karencja przed ubojem (Finiszer!)
Ocena ewentualnej szkodliwości kokcydiostatyków – badania EFSA
Ocena bezpieczeństwa zwraca uwagę na ryzyko rozwoju oporności pierwotniaków oraz oporności krzyżowej w
przypadku mikroorganizmów; teoretycznie możliwy rozwój oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe stosowane w
leczeniu ludzi i zwierząt (vide awoparcyna!!!)
Kokcydiostatyki Obecnie stosowane na olbrzymią skalę! W UE dodatki te stosuje się w: 97% pasz starter/grower dla
indyków 86% pasz dla kurcząt broilerów 45% pasz dla królików
DYREKTYWA 2002/32/WE PARLAMENTU EUROPEJSKIEGO I RADY z dnia 7 maja 2002 r. w sprawie niepożądanych
substancji w paszach zwierzęcych
ZAŁĄCZNIK I SEKCJA VII: DODATKI PASZOWE, KTÓRYCH OBECNOŚD WSKUTEK NIEUNIKNIONEGO ZANIECZYSZCZENIA
KRZYŻOWEGO JEST DOZWOLONA W PASZY, DLA KTÓREJ NIE SĄ ONE PRZEZNACZONE
WYZNACZONE MAKSYMALE POZIOMY DLA 11 DOPUSZCZONYCH DO STOSOWANIA NA TERENIE UE KOKCYDIOSTATYKÓW
(Maksymalna zawartośd w mg/kg (ppm) odpowiadająca paszy o zawartości wilg.12 %)
ZMIANY W PRAWIE  od 1. 01. 2013 r. UE zakazuje profilaktycznego stosowania kokcydiostatyków w paszy  zakaz
stosowania antybiotyków w paszach jako promotorów wzrostu od...

Nowe regulacje prawne w zakresie kokcydiostatyków- wyzwanie dla producentów pasz


Prognozowany znaczny wzrost przypadków klinicznej kokcydiozy począwszy 2013r. Alternatywa dla

kokcydiostatyków- szczepienia Czynny sposób zabezpieczania przed chorobą Stosowanie szczepionek na skalę
przemysłową ‘92/2000

Wiele klas szczepionek: *żywe w pełni zjadliwe *żywe atenuowane (Livacox-Q,Paracox-8,Livacox-T, Paracox-5) *żywe
oporne na kokcydiostatyki jonoforowe * szczepionki rekombinowane
W najbliższym czasie znaczenie szczepionek w profilaktyce kokcydiozy będzie wzrastać- dlaczego?
W stadach hodowlanych i u kur niosek jest to już główna metoda zapobiegania kokcydiozie


Alternatywa dla kokcydiostatyków-szczepienia

Tylko ptaki zdrowe, racjonalnie żywione, utrzymywane w dobrych warunkach
Przez cały okres odchowu NIE dla kokcydiostatyków
Gruba kropla, jeszcze w zakładzie wylęgowym, rozpylana nad pisklętami Z paszą, rozpylana nad karmidłami
Z wodą (1-2h - H2O)
Alternatywa dla kokcydiostatyków
XXI wiek- nacisk na ekologiczny chów i hodowlę zwierząt
Środki chemiczne? ‘naturalne dodatki paszowe’- wśród nich prym wiodą dodatki roślinne, ekstrakty substancji czynnych
w formie standaryzowanej i stabilizowanej
***W ekstraktach ziołowych liczne substancje prozdrowotne i stymulujące: FITOSTEROLE, FLAWONOIDY,
KW.ORGANICZNE, OLEJKI ETERYCZNE, GARBNIKI
Działanie: przeciwbakteryjne i przeciwpasożytnicze, immunostymulujące, immunomodulujące, antyoksydacyjne
stymulują sekrecję kw. żółciowych i aktywność enzymatyczną pp
poprawa wykorzystania paszy
ZALETY EKSTRAKTÓW ROŚLINNYCH
Alternatywa dla kokcydiostatyków- cd. ,‘Bariery’ utrudniające inwazję pp: zakwaszacze ,enzymy ,zawiesiny
prebiotyków ,zawiesiny mikroorganizmów probiotycznych ,selekcja genetyczna zwierząt wzgl. oporności na oocysty
Niestety.... Sprawozdanie Komisji dla Rady i Parlamentu Europejskiego ws. stosowania kokcydiostatyków jako dodatków
paszowych: obecnie nie ma alternatywy dla ich stosowania, zapewniającej porównywalny stopień ochrony przed
kokcydiozą! *COM (2008)2003+
Pilna potrzeba opracowania szybkich testów umożliwiających wykrywanie kokcydiostatyków w:
Paszach (tzw. ‘non- target feed’)
Produktach pochodzenia zwierzęcego (ML’s, rozporządzenie 124/2009)

Zwłaszcza w perspektywie zmian wchodzących w życie z dn. 1.01.2013...
Oznaczanie kokcydiostatyków w paszach- dlaczego tak istotne?
Mniejszy nadzór instytucji państwowych nad produkcją dodatków paszowych niż produktów leczniczych, więc stos.
kokcydiostatyków może spowodować częstsze występowanie pozostałości tych związków w żywności pochodzenia
zwierzęcego
Badania kontrolne w wielu krajach EU pokazały stosunkowo wysoki odsetek próbek tkanek drobiu i jaj, które zawierały
kokcydiostatyki (SANCO/3269/2008)
Oznaczanie kokcydiostatyków w paszach- dlaczego tak istotne/ kiedy badamy?
Powszechność stosowania kokcydiostatyków w paszach dla kurcząt broilerów, indyków i królików
Zagrożenie dla zdrowia ludzi i zwierząt
Zatrucia ‘non-target’ animals
Kurczęta u których zastosowano szczepienia ochronne p.kokcydiozie
Kurczęta brojlery- pasza skarmiana przed ubojem (Finiszer)- zapobieżenie stratom hodowcy
Gdy kokcydioza wystąpi w stadzie, mimo stosowania paszy z zadeklarowanym dodatkiem kokcydiostatyku
Interakcje z niektórymi antybiotykami (upadki kur, indyków, świo, reakcje niepożądane możliwe także u kóz i bydła)
Oznaczanie kokcydiostatyków w paszach- dlaczego tak istotne/ zanieczyszczenie krzyżowe
‘cross-contamination’ Pewien stopień zanieczyszczenia pasz przeznaczonych dla zwierząt innych niż docelowe jest
niemożliwy do uniknięcia ze względów technologicznych i ekonomicznych
W wytwórniach pasz na tych samych liniach produkcyjnych wytwarzane są pasze dla różnych gatunków i kategorii
zwierząt obniżenie stopnia zanieczyszczenia i ilości zanieczyszczonej paszy poprzez...
zanieczyszczenie możliwe na wielu etapach produkcji, ale też podczas transportu!

Oznaczanie kokcydiostatyków w paszach- dlaczego tak istotne?
Zawartość kokcydiostatyków w paszach przeznaczonych dla zwierząt innych niż docelowe nie powinna przekraczać 1-3%
max stężenia w paszy przeznaczonej dla zwierząt docelowych
1% przyjęto dla pasz typu finiszer, pasz dla zwierząt dostarczających żywności w sposób ciągły oraz pasz gatunków
szczególnie wrażliwych na ich działanie toksyczne (Eq-jonofory) Pasze pozostałe do 3%
Zatrucia kokcydiostatykami u zwierząt W przypadku jonoforów efekt toksyczny- zw. ze zmianą przepuszczalności błon
biologicznych dla jonów Oddziaływanie na układ krążenia, mięśnie szkieletowe i system nerwowy Wrażliwe na
zatrucie:  Eq > psy > małe przeżuwacze > kaczki  Wzrost ciśnienia krwi, dodatni efekt inotropowy, nekroza
włókien mięśniowych poprzecznie prążkowanych , neuropatia obwodowa  Anoreksja, biegunka, osowiałośd, słabośd
nóg, dusznośd, ataksja  Zatrucia kokcydiostatykami u zwierząt

Eq :wyraźny efekt kardiotoksyczny ,poliuria, postępująca ataksja ,obfite pocenie się, kolki, zaleganie, zejścia
śmiertelne ,sekcyjnie wyraźne wybroczyny w mięśniu sercowym, obrzęk płuc, hydrothorax,,ascites, reakcje zapalne w
obrębie żołądka i jelit
Pozostałości kokcydiostatyków w produktach pochodzenia zwierzęcego
Badania kontrolne w wielu krajach EU pokazały stosunkowo wysoki odsetek próbek tkanek drobiu i jaj, które zawierały
kokcydiostatyki (SANCO/3269/2008)
Korelacja między stężeniem kokcydiostatyków w paszy a poziomem ich pozostałości w żywności
Ustalono maksymalne limity (ML)zawartości kokcydiostatyków w żywności pochodzenia zwierzęcego
ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (WE) NR 124/2009 z dnia 10 lutego 2009 r.
ustalające maksymalne zawartości w żywności kokcydiostatyków i histomonostatyków
pochodzących z nieuniknionego zanieczyszczenia krzyżowego tymi substancjami pasz, dla
których nie są one przeznaczone
Pozostałości kokcydiostatyków w produktach pochodzenia zwierzęcego
Wynik zanieczyszczenia krzyżowego lub też skarmiania paszy nieprzeznaczonej dla danej kategorii zwierząt (pomyłki?
działanie celowe?) Próby dodatnie zarejestrowano podczas badao przesiewowych- jaja, baranina, mięso kaczek i kurcząt
brojlerów, wątroba kurza
Pozostałości kokcydiostatyków w produktach pochodzenia zwierzęcego
zagrożenie dla konsumenta???
Prawdopodobnie ‘ekspozycja’ wynikająca z konsumpcji żywności zawierającej pozostałości kokcydiostatyków,
wynikające ze skarmiania paszy zanieczyszczonej krzyżowo- znacznie poniżej ADI
Potrzeba dalszych badao
-------------------------------------------------------------
Mikotoksyny – metody identyfikacji oraz aspekty prawne dotyczące ich obecności w paszach
Mikotoksyny produkowane są przez saprofityczne grzyby pleśniowe należące do rodzajów: Aspergillus, Penicillum,
Fusarium Alternaria, Claviceps.
Do tej pory poznano ok. 300 mikotoksyn, z których ponad 20 stwierdza się w łańcuchu pokarmowym ludzi i zwierząt.
Za znaczące, z punktu widzenia toksykologicznego, uważa się: - aflatoksyny B1, B2, G1, G2 - ochratoksyna A, -
zearalenon - trichoteceny (deoksyniwalenol, toksyna T-2 toksyna HT-2) - fumonizyny B1 i B2

Mikotoksyny w różnym stopniu wykazują właściwości kancerogenne,teratogenne, estrogenne czy immunosupresyjne.
Ich spożycie, w zależności od dawki i czasu podania, prowadzi do ostrej lub przewlekłej mikotoksykozy
Mikotoksyny oznaczane w paszach: aflatoksyna B1 zearalenon deoksyniwalenol ochratoksyna A fumonizyny B1, B2
Jedynie oznaczanie aflatoksyny B1 ma podstawę prawną
- Rozporządzenie Komisji (UE) nr 574/2011 z dnia 16 czerwca 2011 r. zmieniające załącznik I do dyr. 2002/32/WE PE i
Rady w odniesieniu do maksymalnych zawartości azotanu(III), melaminy, Ambrosia spp. oraz kokcydiostatyków i
histomonostatyków pochodzących
z zanieczyszczenia krzyżowego oraz konsolidujące załączniki I i II do tej dyrektywy.
W przypadku pozostałych mikotoksyn stosuje się Zalecenia Komisji UE z dnia 17 sierpnia 2006 r. w sprawie obecności
deoksyniwalenolu, zearalenonu, ochratoksyny A oraz fumonizyn w produktach przeznaczonych do żywienia zwierząt,
jednakże ich oznaczanie nie ma podstawy prawnej.

Aflatoksyna B1 - dopuszczalne limity
Materiały paszowe-0,02 mg/kg ;Mieszanki paszowe uzupełniające i pełnoporcjowe- 0,01 mg/kg
z wyjątkiem: — mieszanek paszowych pełnoporcjowych dla bydła mlecznego i cieląt, owiec mlecznych i jagniąt, kóz
mlecznych i koźląt, prosiąt i młodego drobiu-0,005 mg/kg
- mieszanek paszowych pełnoporcjowych dla bydła (z wyjątkiem bydła mlecznego i cieląt), owiec (z wyjątkiem owiec
mlecznych i jagniąt), kóz (z wyjątkiem kóz mlecznych i koźląt), świń (z wyjątkiem prosiąt) i drobiu (z wyjątkiem
młodego drobiu)-0,02 mg/kg
Dopuszczalne, orientacyjne limity mikotoksyn wg Zalecenia Komisji UE z dnia 17 sierpnia 2006 r.
Deoksyniwalenol- 900 -1200 μg/kg *Zearalenon- 100 -3000 μg/kg *Ochratoksyna A- 50 – 250 μg/kg *Fumonizyna B1
+ B2- 5000 – 60000 μg/kg
Analiza mikotoksyn w paszach Składa się z następujących etapów: 1. Pobieranie i przygotowanie reprezentatywnej
próbki 2. Ekstrakcja 3. Oczyszczanie 4. Analiza ilościowa/jakościowa za pomocą wybranej techniki 5. Potwierdzenie
otrzymanego rezultatu za pomocą innej techniki badawczej
Metody analizy ilościowej/jakościowej mikotoksyn
Metody chromatograficzne Metody immunoenzymatyczne (np. testy ELISA)
Metody chromatograficzne stosowane do identyfikacji mikotoksyn
Chromatografia cienkowarstwowa TLC - Thin Layer Chromatography HPTLC – High Pressure Thin Layer
Chromatography
Chromatografia cieczowa (LC – Liquid Chromatography) - do detekcji mikotoksyn stosuje się detektory
fluoroscencyjne (FLD) lub mas (MS)
Chromatografia gazowa (GC – Gas Chromatography połączona ze spektrometrią mas (GC/MS)

Budowa DNA
Nukleotydy składają się z dezoksyrybozy, zasady organicznej (A, T, G, C) oraz reszty kwasu fosforowego
Połączone nukleotydy tworzą podwójną helisę Nici podwójnej helisy są polarne – mają koniec 3` i 5` i w podwójnej
helisie przebiegają antyrównolegle Sekwencja nukleotydów w DNA jest ściśle zdefiniowana
Komplementarność zasad w DNA. Adenozyna zawsze tworzy parę z tymidyną, a guanozyna z cytydyną.
Odcinki DNA dodane do roztworu jednoniciowego DNA „odszukują” sekwencje komplementarne i łączą się z nimi ;
Cząsteczki DNA ulegają denaturacji, polegającej na rozwinięciu dwuniciowej helisy i rozdzieleniu łańcuchów
polinukleotydowych w wyniku rozerwania wiązań pomiędzy sąsiednimi zasadami azotowymi; Denaturację można
uzyskać poprzez podwyższenie temperatury, zmianę pH, dodanie mocznika; Usunięcie czynnika denaturującego
powoduje renaturację, czyli odtworzenie dwuniciowej struktury DNA w sposób bardzo precyzyjny (hybrydyzacja);
Replikacja DNA – podwajanie cząsteczki DNA.; Substratami dla replikacji są matrycowa nić DNA i trifosforany
nukleotydów.

Semikonserwatywność replikacji - w czasie replikacji do każdej nici macierzystej zostaje dobudowana nić potomna;
Podstawowy enzym to polimeraza DNA.; Polimeraza DNA działa wyłącznie w kierunku 5`

→

3`.

Nie może rozpocząć replikacji od samego końca cząsteczki, wymaga startera (primera)
W komórkach bakteryjnych istnieje system restrykcji – modyfikacji, jako obrona przed atakiem wirusów, można go
porównać do systemu zgodności tkankowej ssaków
Bakteria należąca do określonego szczepu w swoisty sposób metyluje swój DNA.
Obcy DNA jest niszczony przez restryktazy
Enzymy restrykcyjne rozpoznają ściśle określone sekwencje DNA i przecinają cząsteczki DNA w obrębie tych
sekwencji
Rozpoznawane sekwencje są zazwyczaj cztero lub sześcionukleotydowe i są palindromami – obydwie nici odczytane
zgodnie z polarnością DNA mają te same sekwencje. Mają wiec oś symetrii
Nazewnictwo: Hin d III
trzeci z enzymów wyizolowanych z Haemophilus influenzae, serotypu d

Odkrycie restryktaz w późnych latach sześćdziesiątych kilka lat później doprowadziło do

gwałtownego rozwoju technik inżynierii genetycznej
PCR (Polymarase Chain Reaction) - reakcja łańcuchowa polimerazy
1983 – PCR1993 – Nagroda Nobla w dziedzinie chemii
PCR służy do powielania określonych sekwencji DNA odzwierciedlając naturalny proces replikacji.
Metodą tą można uzyskać miliony kopii określonego rejonu DNA, pod warunkiem, że znane są sekwencje oskrzydlające
(flankujące) ten fragment (odcinki starterowe – primery).
Mieszanina reakcyjna zawiera
parę starterów (primerów) (20 – 30 nukleotydów), komplementarnych do amplifikowanej sekwencji, ograniczających
długość syntetyzowanego fragmentu. Oba primery są komplementarne do sekwencji biegnących od końca 5` do końca 3`
nici DNA, więc każdy z nich wiąże się tylko do jednej z nici
trójfosforany wszystkich czterech deoksyrybonukleotydów (dNTP), stanowiących substraty reakcji i dostarczających
energii do jej przebiegu
bufor o odpowiednim pH z jonami Mg+2
termostabilną polimerazę DNA
amplifikowany fragment DNA (matryca)
Cykl PCR obejmuje trzy etapy
1. denaturacja dwuniciowej matrycy, w temperaturze 95

°

C, przez 15 s

2. hybrydyzacja (annealing) starterów do jednoniciowej matrycy w temperaturze ok. 54

°

C. Startery są dodawane w

takim nadmiarze, w stosunku do matrycy, że szansa ich przyłączenia do niej jest znacznie większa, niż szansa renaturacji
matrycy.
3. synteza nici komplementarnej (elongacja) w temperaturze 72

°

C, optymalnej dla działania polimerazy Taq. Enzym

dodaje kolejne nukleotydy do końca 3` startera związanego z nicią DNA.
Polimeraza Taq jest enzymem izolowanym z termofilnych bakterii – Thermus aquaticus , żyjących w gorących źródłach
w temperaturze 70-80

°

C. Enzym znosi temperatury powyżej 90

°

C.

Etapy PCR powtarza się 20 - 40 razy. Wszystkie nowopowstałe cząsteczki DNA służą jako matryce w kolejnych cyklach
PCR, co prowadzi do logarytmicznego wzrostu ilości produktu PCR.
Cechy PCR
nie musi być znana sekwencja powielanego odcinka DNA, jedynie sekwencje flankujące
powielany odcinek DNA może być znacznie dłuższy, niż startery. Możliwe jest powielanie odcinków 10 kz i
dłuższych
PCR jest metodą bardzo specyficzną ze względu na dużą dokładność hybrydyzacji
PCR jest metodą niezwykle czułą, pozwalającą wykryć nawet pojedynczą cząsteczkę DNA
Metody analizy produktów PCR
elektroforeza (jeśli stosuje się startery specyficzne)
ZASTOSOWANIE PCR
wykrywanie zafałszowań w żywności (białka obcogatunkowego w paszach)
identyfikacja chorobotwórczych mikroorganizmów
diagnostyka chorób genetycznych
identyfikacja osobnicza (kryminalistyka, ustalanie ojcostwa)
sekwencjonowanie
RFLP (Restiction Fragment Length Polimorphism).
PCR-RFLP
Metoda pozwala na identyfikację gatunkową przetworzonego białka zwierzęcego w paszach
Amplifikacji poddaje się konserwatywny region mitochondrialnego DNA (16S rRNA, mt ATP synthase) – startery
specyficzne dla danego gatunku (przeżuwacze)
trawienie produktu PCR odpowiednim enzymem restrykcyjnym (BlnI)
Za wrażliwość odpowiedzialna jest punktowa mutacja w genie mięśniowego receptora kontrolującego transport Ca++ z
retikulum do sarkoplazmy
Mutacja c na t w genie RYR w pozycji 1843 powoduje zastąpienie argininy przez cysteinę. Efektem jest nadwrażliwość
kanału wapniowego na bodźce powodujące jego otwarcie.
Zwiększone stężenie Ca+2 w cytoplazmie powoduje skurcze mięśni, przegrzanie organizmu oraz hipermetabolizm
prowadzący do nagromadzenia mleczanu
Wykrywanie chorobotwórczych mikroorganizmów
W porównaniu z np. ELISA, PCR jest 10-krotnie czulszy
Możliwość szybkiego typowania trudnych w hodowli bakterii
Mycobacterium tuberculosis; Campylobacter sp.
wymagających specyficznych warunków wzrostu ich identyfikacja metodami konwencjonalnymi zajmuje wiele dni;
Odróżnianie szczepów chorobotwórczych od nie chorobotwórczych przez wykorzystanie jako celu PCR genów
kodujących toksyny
Badania epidemiologiczne
Amplifikacji poddaje się powtarzające się i silnie zmienne elementy genomu bakterii lub fragmenty DNA
rybosomalnego charakteryzujące się wysoką zmiennością
Zakres identyfikacji genetycznej obejmuje 15 nie kodujących układów genomu ludzkiego (STR).
Technika PCR, jaką posługujemy się w procesach badawczych, pozwala na identyfikację osoby (osób) na podstawie
materiału biologicznego
Biologicznym materiałem badawczym dla celów identyfikacji genetycznej są:
plamy krwi, spermy oraz zabrudzenia usuwane (poprzez np: zmywanie, zapieranie, zeskrobywanie) materiał biologiczny
z zasady niewidoczny (np.: ślina na gumie do żucia),
wydzieliny ciała ludzkiego naniesione na inne podłoże w wyniku jego dotykania lub użytkowania (np.: butelki, używane
szklanki, kierownice i lewarki kradzionych samochodów, niedopałki papierosów, chusteczki higieniczne, odzież,
grzebienie, szczoteczki do zębów i inne)
Ekspertyzy ojcostwa
Wykonywane w laboratorium Instytutu Badań DNA prowadzone są w oparciu o zestaw typu multiplex PCR -
"AmpFLSTR Identifiler", obejmujący aż 16 układów STR (wraz z markerem płci)
Uzyskiwane każdorazowo wyniki prawdopodobieństwa potwierdzenia ojcostwa są wyższe niż 99,999%
Ćw2./Metody izolacji DNA z paszy/komercyjne zestawy do izolacji/metoda Tartaglia- z buforem tiocyjanianu
guanidyny, zawiesiny SiO

2

i kazeiny/metoda Wanga – z usieciowanym polistyrenem Chelex-100/metoda z użyciem

mieszaniny fenol:chloroform:alkohol izoamylowy
Metoda z użyciem mieszaniny fenol:chloroform:izoamyl Próbka paszy 0.5-1g+/ Bufor TSM 1ml (0.2M Tris pH 8.0,
0.1M EDTA, 1% SDS) proteinaza K (20mg/ml)/ Inkubacja w 55

°

C przez noc

szereg fenolowo – chloroformowy + wytrącanie DNA etanolem absolutnym z dodatkiem 7M octanu amonu
Próbka po lizie proteinazą K1.Wirować 5min RT/max speed2. Ekstrakcja DNA mieszaniną fenolu, chloroformu i
alkoholu izoamylowego (przenieść do nowej probówki fazę wodną i dodać 300 µl mieszaniny)3. Wirować 5min RT/max
speed4. Powtórzyć kroki 2-35.Wytrącanie alkoholem absolutnym z dodatkiem octanu amonu (do oczyszczonej fazy
wodnej dodać 1ml alkoholu absolutnego i 30 µl 7M octanu amonu i schłodzić 10min/-20

°

C 6. Wirować 5min/RT/max

speed7. Osuszyć i zawiesić w 50 µl wody
PCR Ruminant 16S rRNAPork 12S rRNAFish 12S rRNAPoultry 12S rRNA
Startery: Bos sens + antysens Sus sens + antysens Fish sens + antysens Gallus sens + antysens
Mieszanina fosforanów: dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Bufor: 10mM Tris-HCl pH 8.8, 50mM KCl, 0.08% NP40, 1.5mM MgCl

2

Polimeraza DNA 30 CYKLI PCR: 94

°

C - 15

s 50

°

C - 30 s 72

°

C - 30 s Czas: ~ 1.5 h Polimeraza Taq z Thermus aquaticus Błędy 1 na 9,000 nukleotydów Szybkość

2 000 pz / min.Polimeraza Pfu z Pyrrococcus furiosus Błędy 1 na 1.3 milionów nukleotydów Szybkość 500 pz / min.
Polimerazy otrzymane na drodze inżynierii genetycznej:
Szybkość 6 000 pz / min. /Ograniczenia PCR/obróbka termiczna próbek/występowanie w paszach czynników
hamujących, które mogą wiązać cząstki krzemioniki (m. Tartaglia)/DNA pochodzące z dozwolonych składników
dodawanych do pasz (mleko)
Elektroforeza
Metoda pozwalająca na ocenę wielkości fragmentów DNA w mieszaninie.
Ujemnie naładowane cząsteczki DNA w polu elektrycznym wędrują do elektrody dodatniej (anody).
Usieciowanie żeli wywołuje różnice w prędkościach wędrówki cząsteczek, tak że najszybciej wędrują cząsteczki
najmniejsze
Żele poliakrylamidowe stosuje się do rozdzielania fragmentów DNA do 500 bp. Żele agarozowe do fragmentów
większych
Wraz z fragmentami DNA o nieznanych masach w żelach rozdziela się jednocześnie standardy masy – mieszaninę
fragmentów DNA o znanych, ściśle określonych masach cząsteczkowych
Wizualizacja rozdzielonych fragmentów DNA
bromkiem etydyny w przypadku elektroforezy w agarozie, srebrem w przypadku elektroforezy w poliakrylamidzie
GMO – ORGANIZM MODYFIKOWANY GENETYCZNIE
to organizm inny niż organizm człowieka, w którym materiał genetyczny został zmieniony w sposób nie zachodzący w
warunkach naturalnych wskutek krzyżowania lub naturalnej rekombinacji, w szczególności przy zastosowaniu:
- technik rekombinacji DNA z użyciem wektorów, w tym tworzenia materiału genetycznego poprzez włączenie do
wirusa, plazmidu lub każdego innego wektora cząsteczek DNA wytworzonych poza organizmem i włączenie ich do
organizmu biorcy, w którym w warunkach naturalnych nie występują, ale w którym są zdolne do ciągłego powielania,
- technik stosujących bezpośrednie włączenie materiału dziedzicznego przygotowanego poza organizmem, a w
szczególności: mikroiniekcji, makroiniekcji i mikrokapsułkowania,
- metod nie występujących w przyrodzie dla połączenia materiału genetycznego co najmniej dwóch różnych komórek,
gdzie w wyniku zastosowanej procedury powstaje nowa komórka zdolna do przekazywania swego materiału
genetycznego odmiennego od materiału wyjściowego komórkom potomnym.
Otrzymywanie roślin genetycznie zmodyfikowanych
Wprowadzanie genów do roślin
Elektroporacja - działanie polem elektrycznym na protoplasty celem zwiększenia przepuszczalności błon
komórkowych.
- Metoda chemiczna – dezorganizacja błon komórkowych i zwiększenie ich przepuszczalności za pomocą glikolu
polietylenowego (PEG).
Rośliny modyfikowane genetycznie – cele modyfikacji
odporność na herbicydy - chemiczne środki ochrony roślin,
odporność na szkodniki - modyfikacja Bt,
odporność na choroby wirusowe, grzybowe, bakteryjne,
odporność na niekorzystne warunki środowiska (zasolenie gleby, mróz, susza, metale ciężkie),
poprawa lub nadanie nowych cech jakościowych.
Odporność na Herbicydy - Najpowszechniejsza modyfikacja (gł. soja i rzepak), pozwala na stosowanie herbicydu
(środka chwastobójczego) bez obawy o zniszczenie uprawianych roślin.
Do rośliny wprowadzany jest gen, który odpowiada za produkcję enzymu rozkładającego dany herbicyd (glifosat,
glufosynat).
Odporność na szkodniki – modyfikacja Bt - Wprowadza się geny z bakterii glebowej

Bacillus thuringensis

,

odpowiedzialne za produkcję toksycznego dla owadów-szkodników białka (Cry) . Białko Cry jest toksyczne tylko dla
określonych gatunków owadów. Związane jest to z występowaniem specyficznych receptorów dla białka Cry w
przewodzie
pokarmowym owadów. Tak modyfikowana jest głównie kukurydza (kukurydza MON 810), bawełna oraz ziemniaki
przeciw stonce ziemniaczanej.
odporność na choroby wirusowe (Wprowadzenie genów kodujących białka otoczki wirusowej), grzybowe, bakteryjne
(Wprowadzenie genów kodujących enzymy, które rozkładają ściany komórkowe - chitynazy, glukanazy).
Odporność na niekorzystne warunki środowiska - Odporność na niekorzystne warunki środowiska pozwala uprawiać
rośliny na terenach gdzie wcześniej uprawa nie była możliwa. Dzięki modyfikacjom są one bardziej odporne na
zasolenie gleby, suszę, mróz, czy zanieczyszczenie metalami ciężkimi. Tworząc rośliny akumulujące metale ciężkie
próbuje się oczyszczać glebę z zanieczyszczeń (fitoremediacja).
poprawa lub nadanie nowych cech jakościowych - - kawa ze zmniejszoną o 70% ilością kofeiny. Uzyskano ten efekt
poprzez zmniejszenie aktywności syntazy kofeiny,
- zwiększenie zawartości kwasu oleinowego w soi i rzepaku,
- uzyskanie tytoniu (Vector 21-40) o 20 razy mniejszej dawce nikotyny – ilość ta jest mniejsza od progu uzależnienia i
15 razy mniejszej zawartości substancji rakotwórczych,
- goździki o intensywnej niebiesko-fioletowej barwie, uzyskano poprzez nadprodukcję karotenoidów, roślinę
wyposażono dodatkowo w odporność na szkodniki typu Bt,
- trawa, która została specjalne stworzona do celu sportowych i rekreacyjnych. Wymaga znacznie mniej wody,
herbicydów, fungicydów i mniejszego nakładu energii.
GMO w Polsce - W Polsce istnieje zakaz handlu ziarnami GMO z przeznaczeniem na wysiew. Natomiast sam wysiew
nie jest zabroniony.
Genetycznie modyfikowana Żywność (Pasze) -Żywność genetycznie zmodyfikowana jest to żywność zawierająca GMO,
składająca się z GMO lub wyprodukowana z GMO.
Za żywność genetycznie zmodyfikowaną nie uznaje się produktów zawierających GMO w ilości mniejszej niż 0,9% w
odniesieniu do składnika.
Produkty zawierające w swoim składzie powyżej 0,9 % masy składników modyfikowanych genetyczne muszą zawierać
stosowną informację na opakowaniu.
Genetycznie modyfikowana Żywność
Obawy towarzyszące roślinom genetycznie modyfikowanym Powstanie super chwastów i super

patogenów/Negatywny wpływ GM na organizmy niedocelowe/Niekontrolowane rozprzestrzenianie GMO/Uodparnianie
mikroorganizmów na antybiotyki/Zagrożenia ekonomiczne. Uzależnienie produkcji rolnej od kilku koncernów.
Rozpoznanie i identyfikacja roślin GMO/Metody oparte na analizie DNA za pomocą PCR, Real Time PCR. / Metody
oparte na detekcji białek bazujące na reakcjach immunologicznych pomiędzy przeciwciałem a specyficznym
antygenem, np. test ELISA./ Metody alternatywne: HPLC, MS, NIR
PCR w czasie rzeczywistym,Real-time PCR
Monitorowanie zmian stężenia produktu następuje poprzez pomiar fluorescencji proporcjonalnej do ilości
produktu w mieszaninie
FLUORESCENCJA,10 – 1000 razy czulsza od pomiaru absorpcji,SYBR Green I,Sondy
oligonukleotydowe,TaqMan,Molecular beacons,Real-time PCR ultra czułość -limit detekcji to ok. 5 kopii DNA
DETEKCJA GMO/ Wybór genu referencyjnego housekeeping gene (kontrola wewnętrzna) – gen lektyny, inwertazy,
zeiny /Wybór elementu rozpoznania organizmu transgenicznego (promotor, sekwencja kodująca, terminator, marker
selekcyjny)
Najczęściej stosowane elementy rozpoznania organizmu transgenicznego
Promotory- P35S - promotor genu 35S wirusa choroby mozaikowej kalafiorów (CaMV35S) P-nos – promotor syntazy
nopaliny Agrobacterium tumefaciens
Terminatory- T-nos - terminator syntazy nopaliny Agrobacterium tumefaciens- T-35S - terminator genu 35S wirusa
choroby mozaikowej kalafiorów
Sekwencje kodujące, gen cp4 epsps – oporność na glifosat, gen pat – oporność na pestycydy zawierające glufosynat
amonowy, gen cry – odporność na niektóre szkodniki z rzędu Coleoptera
Wyznaczenie zawartości soi GM w próbce, Normalizacja soi GM względem całkowitej zawartości soi (∆C

T

),

Sporządzenie krzywej standardowej,Wyznaczenie zawartości soi GM w próbce na podstawie krzywej standardowej