Wybrane metody

biochemiczne

i serologiczne identyfikacji
bakterii chorobotwórczych

Podział drobnoustrojów ze względu na rodzaj ich interakcji

z organizmem ludzkim:

 drobnoustroje komensalne

-

kolonizują powierzchnię ciała nie wyrządzając szkody;

prawidłowa flora organizmu, np. E. coli

 drobnoustroje patogenne

-

działają szkodliwie na organizm gospodarza

> bezpośrednia inwazja i uszkodzenie tkanek, np. Shigella sp.
> produkty toksyczne, np. Clostridium

 drobnoustroje oportunistyczne

-

występują w środowisku i są składnikami flory organizmu

-

nieszkodliwe dla osób zdrowych

-

ciężkie schorzenia u chorych z obniżoną odpornością (zabiegi)



drobnoustroje wywołujące choroby odzwierzęce

-

choroby u kręgowców innych niż ludzie, ale można się nimi

zakazić na skutek kontaktu z zakażonymi zwierzętami lub
produktami pochodzenia zwierzęcego

Postulaty Kocha
stanowią do dziś
kryterium uznania
danej bakterii
za czynnik
etiologiczny
(przyczynę)
określonej choroby.

Serotyp - odmiana

mikroorganizmu

, którą można

określić za pomocą reakcji

serologicznych

, czyli

reakcji z użyciem

przeciwciał

lub

dopełniacza

.

Różnice pomiędzy serotypami zależą od

antygenów

znajdujących się na powierzchni

komórek

drobnoustroju. Często są to

białka

o kluczowym znaczeniu dla

patogenezy

lub też

substancje odpowiedzialne za mniejszą lub
większą wrażliwość mikroorganizmu na czynniki

odpornościowe

. Dlatego określenie serotypu jest

często ważne w przypadku badań laboratoryjnych
służących wykryciu i identyfikacji

patogenu

.

Metody identyfikacji

mikroorganizmów

Podział metod identyfikacji mikroorganizmów:

a) biochemiczne

b) biofizyczne

c) biologii molekularnej

d) immunochemiczne

Metody biochemiczne

Polegają na określeniu zdolności mikroorganizmów

do asymilacji, fermentacji lub

rozkładu określonych

związków chemicznych

 cechy biochemiczne

określa

się na

podstawie

reakcji

chemicznych

zachodzących w odpowiednio skomponowanych

pożywkach wzrostowych

 wyniki

testów biochemicznych odczytuje się makroskopowo

- wzrost lub jego brak

- zmiana zabarwienia

pożywki

- reakcja barwna po wprowadzeniu odczynnika

reagującego

.......

z wytwarzanym metabolitem

- wytworzenie gazu

Test API 20 NE

• Przeznaczony jest do oznaczania jednego szczepu bakterii
• Składa się z 20 mikroprobówek zawierających bezwodne

podłoże

• Służą one do wykonania 8 testów konwencjonalnych i 12

asymilacyjmych

• Testami konwencjonalnymi oznacza się zdolność do:

- wytwarzania oksydazy cytochromowej
- fermentacji glukozy
-

rozkładu cukrów złożonych na podstawie stwierdzenia

zdolności

do zdolności do wytwarzania enzymu beta-galaktozydazy i
beta-glukozydazy

-

rozkładu białek i aminokwasów na podstawie oznaczania

wytwarzanego indolu oraz enzymów: hydrolazy argininy,
proteazy i ureazy

-

redukcja azotanów do azotynów oraz do azotu

cząsteczkowego

(denitryfikacja)

• Testami asymilacyjnymi oznaczana jest zdolność bakterii do

wykorzystywania jako źródła węgla: arabinozy, glukozy,

Interpretacja

wyników badań

właściwości

biochemicznych

bakterii za

pomocą testu API

20 NE

Test API STAPH

• Przeznaczony jest do identyfikacji jednego szczepu bakterii
• Składa się z 20 mikroprobówek zawierających bezwodne podłoża
• Służą do wykonania 19 testów biochemicznych, za pomocą których

określana jest zdolność do:

-

wykorzystania węglowodanów (cukrów prostych,

wielocukrów) i alkoholi

-

redukcji azotanów do azotynów

- wytwarzania fosfatazy alkalicznej

- wytwarzania acetylometylokarbinolu (acetoina) z glukozy

- hydrolizy argininy i mocznika

Interpretacja

wyników

badań

właściwości

biochemicznyc

h bakterii za

pomocą testu

API STAPH

Testy biochemiczne

INKUBACJA

(18

– 48 h)

Zawieszenie

Naniesienie

Interpretacja wyników w teście API (bioMerieux)

Test Colilert

• Do wykrywania bakterii z grupy coli w wodzie słodkiej i morskiej

(przy analizie sanitarnej wody)

• Oparty jest na technologii wskaźnikowych substratów odżywczych

(DST)

• E. coli wykorzystują produkowany przez siebie enzym

Beta-

glukuronidazę do przemian 4-metyl-umbeliferyl-beta-D-

glukuronidu, który jest wskaźnikowym substratem odżywczym testu

• Badana próbka wykazuje fluorescencję, gdy obecne są bakterie E.

coli

, w przypadku obecności innych bakterii z grupy coli utrzymuje

się barwa żółta, ale brak fluorescencji.

• Dwa rodzaje testu: jakościowy (obecne/nieobecne) i ilościowy
• Test jakościowy przeprowadza się w pojemnikach zawierających

100 ml badanej próbki wody, a test ilościowy na specjalnych

płytkach.

Testy serologiczne

• Polegają na łączeniu przeciwciał z antygenem

i wytrąceniu osadu lub blokowaniu aktywności
antygenu

• Główne rodzaje odczynów serologicznych:

– precypitacji (antygeny rozpuszczalne)
– aglutynacji (wykrywanie przeciwciał i antygenów)
– wiązania dopełniacza (blokowanie antygenów lub

liza komórek z udziałem dopełniacza)

– neutralizacja (zobojętnianie określonych właściwości

antygenu)

Odczyn precypitacji:

• reakcja przeciwciało/antygen - pod wpływem swoistego

przeciwciała łączącego się z cząsteczką antygenu powstają
kompleksy

antygen-przeciwciało,

które

łącząc

się

w większe agregaty wytrącają się z roztworu w postaci
precypitatu.

• Reakcja ta jest wysoce swoista, ale czułość jest mniejsza

niż np. reakcji aglutynacji.

• Najprostszą metodą precypitacji jest zmieszanie surowicy

i

antygenu

w

probówce. W obecności swoistych

przeciwciał

na

dnie

probówki

obserwuje

się

charakterystyczny osad.

Odczyn aglutynacji:

• reakcja przeciwciało/zawiesina antygenów - powstające

kompleksy antygen-przeciwciało łącząc się (zlepiając)
w większe agregaty powodują mętnienie pierwotnie
jednorodnej zawiesiny.

• Uzyskany wynik wyraża się w postaci miana, tzn.

największego rozcieńczenia przeciwciał powodującego

aglutynację.

• Ma zastosowanie w diagnostyce m.in. salmonellozy,

listeriozy i mononukleozy oraz wykrywania rotawirusów
oraz czynnika reumatoidalnego.

Odczyn wiązania dopełniacza:

• Stosuje się najczęściej do wykrywania swoistych

przeciwciał.

• Dopełniacz ma zdolność wiązania immunokompleksów.

Wolny dopełniacz powoduje lizę krwinek czerwonych,

które jako antygen związały na swojej powierzchni

przeciwciała. Jeśli dopełniacz zostanie związany przez
immunokompleksy nie wystąpi hemoliza.

• Stosowany jest w diagnostyce toksoplazmozy, cytomegalii,

odry, różyczki, brucelozy, zakażeń wirusem typu herpes,
duru brzusznego, durów rzekomych oraz zakażeń o
etiologii Mycoplasma.

Metody serologiczne

• Odczyn immunofluorescencji – przeciwciała znakowane

barwnikiem fluoryzującym, metoda pośrednia lub bezpośrednia –
wysoka czułość

• Metody radioimmunologiczne – przeciwciała znakowane izotopami
• ELISA – znakowanie przeciwciał enzymami, które następnie

reagują z substancją chemiczną wytwarzając barwnik, liczne
odmiany metody

• Immunobloting – elektroforeza białek i przeniesienie ich na błonę,

inkubacja w roztworze przeciwciał połączonych z peroksydazą,
która rozkłada barwnik – identyfikacja antygenów białkowych
i przeciwciał

TESTY LATEKSOWE

• Zasada działania testów oparta jest o reakcję aglutynacji

zachodzącej w układzie antygen-przeciwciało. Antygen
znajduje się w badanym materiale klinicznym, zaś drugim
elementem tego układu są monoklonalne przeciwciała
przeciwko

określonemu

antygenowi

(np.

otoczce)

opłaszczone na nośniku (cząsteczki lateksu).

• Dostępne na rynku testy lateksowe pozwalają nie tylko na

stwierdzenie obecności drobnoustrojów, ale także na ich

identyfikację.

• Mimo iż testy lateksowe przyśpieszają i ukierunkowują

badanie mikrobiologiczne, nie zwalniają z wykonania
klasycznej diagnostyki metodą hodowli.

TEST ELISA

• pozwala na jakościowe i ilościowe oznaczanie przeciwciał

(we

wszystkich

klasach)

i antygenów w

materiale

biologicznym

• oparty jest na zasadzie chromatografii powinowactwa

-

znany czynnik (antygen lub immunoglobulinę) absorbuje

się na stałym podłożu. Do powstałej w ten sposób fazy

stałej przyłącza się swoisty antygen lub przeciwciała (jeśli

są obecne w badanej próbce). Nie związany materiał
usuwa się przez płukanie. Po wypłukaniu zbędnego

materiału i dodaniu odpowiedniego dla enzymu substratu
oznacza się spektrofotometrycznie intensywność reakcji
barwnej, która jest odzwierciedleniem rozkładu substratu
przez enzym. Na tej podstawie wnioskuje się o zawartości
poszukiwanych

czynników

w

badanym

materiale

(antygenów lub przeciwciał).

Olbrzymia rola, wysoka czułość i swoistość testów

ELISA doprowadziła do wykonania testów

fabrycznych, wysoko zautomatyzowanych, a nawet

skomputeryzowanych.

Testy ELISA wykorzystuje się w diagnostyce np.

toksoplazmozy, cytomegalii, różyczki, żółtaczki

zakaźnej, Chlamydia, wirusów RSV, Rotawirusów

i Helicobacter pylori.

IMMUNOBLOTTING

• może być zastosowany do analizy antygenów białkowych,

a także do charakteryzowania przeciwciał

• wykorzystywany

często

do

wykrywania

swoistych

przeciwciał w surowicy chorych

• jest rozszerzeniem badań serologicznych, które wykazują

obecność swoistych antygenów różnych patogenów,
a

także

swoiste

przeciwciała

reagujące

z

charakterystycznymi

antygenami

białkowymi tych

patogenów

• z dużym powodzeniem jest stosowany w diagnostyce

zakażeń

wirusowych,

bakteryjnych

i

zakażeń

pierwotniakami (np. wirusem cytomegalii, Helicobacter
pylori, Campylobacter, Clostridium, Escherichia coli,
Staphylococcus oraz Toxoplasma gondii)