7. Wybrane metody biochemiczne i serologiczne identyfikacji

bakterii chorobotwórczych

Podział drobnoustrojów ze względu na rodzaj ich interakcji z

organizmem ludzkim:

•

drobnoustroje komensalne
◦

kolonizują powierzchnię ciała nie wyrządzając szkody; prawidłowa flora organizmu, np.
E. coli

•

drobnoustroje patogenne
◦

działają szkodliwie na organizm gospodarza
▪

bezpośrednia inwazja i uszkodzenie tkanek, np. Shigella sp.

▪

produkty toksyczne, np. Clostridium

•

drobnoustroje oportunistyczne
◦

występują w środowisku i są składnikami flory organizmu

◦

nieszkodliwe dla osób zdrowych

◦

ciężkie schorzenia u chorych z obniżoną odpornością (zabiegi)

•

drobnoustroje wywołujące choroby odzwierzęce
◦

choroby u kręgowców innych niż ludzie, ale można się nimi zakazić na skutek kontaktu
z zakażonymi zwierzętami lub produktami pochodzenia zwierzęcego

Postulaty Kocha

Postlaty Kocha stanowią do dziś kryterium uznania danej bakterii za czynnik etiologiczny
(przyczynę) określonej choroby.

Serotyp - odmiana mikroorganizmu, którą można określić za pomocą reakcji serologicznych, czyli
reakcji z użyciem przeciwciał lub dopełniacza. Różnice pomiędzy serotypami zależą od antygenów
znajdujących się na powierzchni komórek drobnoustroju. Często są to białka o kluczowym

znaczeniu dla patogenezy lub też substancje odpowiedzialne za mniejszą lub większą wrażliwość
mikroorganizmu na czynniki odpornościowe. Dlatego określenie serotypu jest często ważne w
przypadku badań laboratoryjnych służących wykryciu i identyfikacji patogenu.

Metody identyfikacji mikroorganizmów

Podział metod identyfikacji mikroorganizmów:

a) biochemiczne
b) biofizyczne
c) biologii molekularnej
d) immunochemiczne

Metody biochemiczne

Polegają na określeniu zdolności mikroorganizmów do asymilacji, fermentacji lub rozkładu
określonych związków chemicznych

•

cechy biochemiczne określa się na podstawie reakcji chemicznych zachodzących w
odpowiednio skomponowanych pożywkach wzrostowych

•

wyniki testów biochemicznych odczytuje się makroskopowo
◦

wzrost lub jego brak

◦

zmiana zabarwienia pożywki

◦

reakcja barwna po wprowadzeniu odczynnika reagującego z wytwarzanym metabolitem

◦

wytworzenie gazu

Rodzaje testów (na przykładzie pasków API BIOMERIEUX)

API 20 E. Rapid 20E - bakterie z rodziny Enterobacteriaceae
Api 20NE - Gram-ujemne bakterie niefermentujące glukozy
Api Staph - Gronkowce i innych bakterii z rodziny Microccocaceae
Api STREP - Paciorkowce
Api Listeria - Pałeczki Listeria
Api Campy - Campylobacter
Api Coryne - Corynebacterium
Api 20A - Beztlenowce
Api Candida. Api 20C AUX - Drożdżaki
Api soCHL - Lactobacillus
API soCHB - Bacillus

Test API 20 NE

•

Przeznaczony jest do oznaczania jednego szczepu bakterii

•

Składa się z 20 mikroprobówek zawierających bezwodne podłoże

•

Służą one do wykonania 8 testów konwencjonalnych i 12 asymilacyjmych

•

Testami konwencjonalnymi oznacza się zdolność do:
◦

wytwarzania oksydazy cytochromowej

◦

fermentacji glukozy

◦

rozkładu cukrów złożonych na podstawie stwierdzenia zdolności do zdolności do
wytwarzania enzymu beta-galaktozydazy i beta-glukozydazy

◦

rozkładu białek i aminokwasów na podstawie oznaczania wytwarzanego indolu oraz
enzymów: hydrolazy argininy, proteazy i ureazy

◦

redukcja azotanów do azotynów oraz do azotu cząsteczkowego (denitryfikacja)

•

Testami asymilacyjnymi oznaczana jest zdolność bakterii do wykorzystywania jako źródła
węgla …

Interpretacja wyników
badań właściwości
biochemicznych bakterii
za pomocą testu API 20
NE

Test API STAPH

•

Przeznaczony jest do identyfikacji jednego szczepu bakterii

•

Składa się z 20 mikroprobówek zawierających bezwodne podłoża

•

Służą do wykonania 19 testów biochemicznych, za pomocą których określana jest zdolność
do:
◦

wykorzystania węglowodanów (cukrów prostych, wielocukrów) i alkoholi

◦

redukcji azotanów do azotynów

◦

wytwarzania fosfatazy alkalicznej

◦

wytwarzania acetylometylokarbinolu (acetoina) z glukozy

◦

hydrolizy argininy i mocznika

Interpretacja wyników
badań właściwości
biochemicznyc h
bakterii za pomocą testu
API STAPH

Procedura testu na przykładzie API 20E

1) obecność β-galaktozydazy
2) rozkład aminokwasów
3) wykorzystanie cytrynianu
4) wytwarzanie H

2

S

5) rozkład mocznika (obecność

ureazy)

6) przemiany tryptofanu
7) próba VP
8) rozkład żelatyny
9) fermentacja/utlenianie cukrów

Testy biochemiczne

Procedura testu na przykładzie API 20E

Procedura testu na przykładzie API 20E

sumowanie pól oznaczonych „+” → identyfikacja w Książce Kodów bądź programie
komputerowym dostarczonym przez producenta

Dokładność

Przykładowe reakcje:

Test na oksydazę

Pozwala wykazać obecność oksydazy cytochromowej u bakterii bezwzględnie tlenowych przy
użyciu sztucznego akceptora elektronów.

OX+ → Pseudomonadaceae
OX- → Enterobacteriaceae

ONPG

ADH, ODC

Wytwarzanie H

2

S

Świadczy o obecności enzymów proteolitycznych odszczepiających grupy sulfhydrylowe od
aminokwasów takich jak metionina czy cysteina.

Próba Voges – Proskauer'a

GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY, ARA -

fermentacja/utlenianie

Procesy takie jak fermentacja i utlenianie cukrów prowadzą do wytworzenia kwasu, który pozwala
nam na dokonanie oceny dzięki wykorzystaniu wskaźnika pH, jakim jest tutaj błękit
bromotymolowy

Test Colilert

•

Do wykrywania bakterii z grupy coli w wodzie słodkiej i morskiej (przy analizie sanitarnej
wody)

•

Oparty jest na technologii wskaźnikowych substratów odżywczych (DST)

•

E. coli wykorzystują produkowany przez siebie enzym Beta-glukuronidazę do przemian 4-
metyl-umbeliferyl-beta-D- glukuronidu, który jest wskaźnikowym substratem odżywczym
testu

•

Badana próbka wykazuje fluorescencję, gdy obecne są bakterie E. coli, w przypadku
obecności innych bakterii z grupy coli utrzymuje się barwa żółta, ale brak fluorescencji.

•

Dwa rodzaje testu: jakościowy (obecne/nieobecne) i ilościowy

•

Test jakościowy przeprowadza się w pojemnikach zawierających 100 ml badanej próbki
wody, a test ilościowy na specjalnych płytkach.

Testy serologiczne

•

Polegają na łączeniu przeciwciał z antygenem i wytrąceniu osadu lub blokowaniu
aktywności antygenu

•

Główne rodzaje odczynów serologicznych:
◦

precypitacji (antygeny rozpuszczalne)

◦

aglutynacji (wykrywanie przeciwciał i antygenów)

◦

wiązania dopełniacza (blokowanie antygenów lub liza komórek z udziałem dopełniacza)

◦

neutralizacja (zobojętnianie określonych właściwości antygenu)

Odczyn precypitacji

•

Reakcja przeciwciało/antygen - pod wpływem swoistego przeciwciała łączącego się z
cząsteczką antygenu powstają kompleksy antygen-przeciwciało, które łącząc się w większe
agregaty wytrącają się z roztworu w postaci precypitatu.

•

Reakcja ta jest wysoce swoista, ale czułość jest mniejsza niż np. reakcji aglutynacji.

•

Najprostszą metodą precypitacji jest zmieszanie surowicy i antygenu w probówce. W
obecności swoistych przeciwciał na dnie probówki obserwuje się charakterystyczny osad.

Odczyn aglutynacji

•

Reakcja przeciwciało/zawiesina antygenów - powstające kompleksy antygen-przeciwciało
łącząc się (zlepiając) w większe agregaty powodują mętnienie pierwotnie jednorodnej
zawiesiny.

•

Uzyskany wynik wyraża się w postaci miana, tzn. największego rozcieńczenia przeciwciał
powodującego aglutynację.

•

Ma zastosowanie w diagnostyce m.in. salmonellozy, listeriozy i mononukleozy oraz
wykrywania rotawirusów oraz czynnika reumatoidalnego.

Odczyn wiązania dopełniacza

•

Stosuje się najczęściej do wykrywania swoistych przeciwciał.

•

Dopełniacz ma zdolność wiązania immunokompleksów. Wolny dopełniacz powoduje lizę
krwinek czerwonych, które jako antygen związały na swojej powierzchni przeciwciała. Jeśli
dopełniacz zostanie związany przez immunokompleksy nie wystąpi hemoliza.

•

Stosowany jest w diagnostyce toksoplazmozy, cytomegalii, odry, różyczki, brucelozy,
zakażeń wirusem typu herpes, duru brzusznego, durów rzekomych oraz zakażeń o etiologii
Mycoplasma.

Metody serologiczne

•

Odczyn immunofluorescencji - przeciwciała znakowane barwnikiem fluoryzującym, metoda
pośrednia lub bezpośrednia - wysoka czułość

•

Metody radioimmunologiczne - przeciwciała znakowane izotopami

•

ELISA - znakowanie przeciwciał enzymami, które następnie reagują z substancją chemiczną
wytwarzając barwnik, liczne odmiany metody

•

Immunobloting - elektroforeza białek i przeniesienie ich na błonę, inkubacja w roztworze
przeciwciał połączonych z peroksydazą, która rozkłada barwnik - identyfikacja antygenów
białkowych i przeciwciał

TESTY LATEKSOWE

•

Zasada działania testów oparta jest o reakcję aglutynacji zachodzącej w układzie antygen-
przeciwciało. Antygen znajduje się w badanym materiale klinicznym, zaś drugim elementem
tego układu są monoklonalne przeciwciała przeciwko określonemu antygenowi (np.
otoczce) opłaszczone na nośniku (cząsteczki lateksu).

•

Dostępne na rynku testy lateksowe pozwalają nie tylko na stwierdzenie obecności
drobnoustrojów, ale także na ich identyfikację.

•

Mimo iż testy lateksowe przyśpieszają i ukierunkowują badanie mikrobiologiczne , nie
zwalniają z wykonania klasycznej diagnostyki metodą hodowli.

TEST ELISA

•

pozwala na jakościowe i ilościowe oznaczanie przeciwciał (we wszystkich klasach) i
antygenów w materiale biologicznym

•

oparty jest na zasadzie chromatografii powinowactwa - znany czynnik (antygen lub
immunoglobulinę) absorbuje się na stałym podłożu. Do powstałej w ten sposób fazy stałej
przyłącza się swoisty antygen lub przeciwciała (jeśli są obecne w badanej próbce). Nie
związany materiał usuwa się przez płukanie. Po wypłukaniu zbędnego materiału i dodaniu
odpowiedniego dla enzymu substratu oznacza się spektrofotometrycznie intensywność
reakcji barwnej, która jest odzwierciedleniem rozkładu substratu przez enzym. Na tej
podstawie wnioskuje się o zawartości poszukiwanych czynników w badanym materiale
(antygenów lub przeciwciał).

Olbrzymia rola, wysoka czułość i swoistość testów ELISA doprowadziła do wykonania testów

fabrycznych, wysoko zautomatyzowanych, a nawet
skomputeryzowanych.

Testy ELISA wykorzystuje się w diagnostyce np. toksoplazmozy, cytomegalii, różyczki, żółtaczki
zakaźnej, Chlamydia, wirusów RSV, Rotawirusów i Helicobacter pylori.

IMMUNOBLOTTING

•

Może być zastosowany do analizy antygenów białkowych, a także do charakteryzowania
przeciwciał

•

Wykorzystywany często do wykrywania swoistych przeciwciał w surowicy chorych

•

Jest rozszerzeniem badań serologicznych, które wykazują obecność swoistych antygenów
różnych patogenów, a także swoiste przeciwciała reagujące z charakterystycznymi
antygenami białkowymi tych patogenów

•

Z dużym powodzeniem jest stosowany w diagnostyce zakażeń wirusowych, bakteryjnych i
zakażeń pierwotniakami (np. wirusem cytomegalii, Helicobacter pylori, Campylobacter,
Clostridium, Escherichia coli, Staphylococcus oraz Toxoplasma gondii)