Pomiar wydajności kwantowej fotosyntezy

metodą pomiaru fluorescencji chlorofilu

Zagadnienia do przygotowania:
Faza świetlna (jasna) fotosyntezy. Fotosyntetyczny transport elektronów.
Wydajność procesu.

Cel ćwiczenia:
wyznaczenie stosunku ilości kwantów wykorzystanych do przeprowadzenia reakcji fazy
ś

wietlnej fotosyntezy do ilości kwantów zaabsorbowanych przez barwniki aparatu

fotosyntetycznego.

Metodyka:

Bezpośrednie określenie ilości kwantów wykorzystywanych do procesu fotosyntezy nie jest możliwe.
Ponieważ chlorofil wykazuje zjawisko fluorescencji, energia zaabsorbowana przez barwniki aparatu
fotosyntetycznego (a) może zostać wykorzystana w trzech procesach: fotosyntezy (p) fluorescencji (f) i
dezaktywacji cieplnej (t).
Oczywiście całkowita ilość energii wykorzystanej (p + t + f) musi być równa energii zaabsorbowanej a:

a = p + t + f

Chcąc więc wyznaczyć wydajność kwantową fotosyntezy, p/a, wystarczy określić ilość energii zaabsorbowanej,
a, i ilość energii traconej przez układ, t + f

p = a - (t + f)

Wydajność kwantowa fotosyntezy Y wynosi zatem

Y = p/a = [a-(t+f)]/a

przy założeniu pomiaru wszystkich wartości przy tej samej intensywności światła padającego I. Wzór można
stosować do wyników otrzymanych przy różnych natężeniach światła padającego (z ograniczeniami - patrz
niżej), jeżeli zamiast wartości p, a, t i f podstawimy wartości normalizowane do natężenia światła padającego I:
P = p/I; F = f/I, T = t/I; A = a/I;

wydajność kwantowa fotosyntezy równa jest wtedy

Y = P/A = [A-(T+F)]/A

Bezpośrednie zmierzenie ilości energii absorbowanej w układzie (a) a zatem i A, jest niemożliwe, można jednak
wyznaczyć A w warunkach gdy fotosynteza nie zachodzi, tj gdy P = 0, gdyż wtedy A = F + T. Przktycznie
wykonuje się pomiar przy bardzo dużym natężeniu światła, wielokrotnie przekraczającym próg wysycenia
fotosyntezy - w tych warunkach P stanowi nieznaczną część A i można ją zaniedbać. Wartość zmierzoną w ten
sposób można oznaczyć jako D

M

.

Pomiar określający P (czyli A - (F+T)) należy natomiast przeprowadzić w warunkach gdy P jest maksymalne, a
zatem optymalnych dla fotosyntetycznego przepływu elektronów. Uzyskaną wartość oznaczymy jako D

0

.

Wyniki tych pomiarów będą więc opisywać maksymalną wydajność fotosyntezy wg równania:

Y = D

M

- D

0

/ D

M

= (T

M

+F

M

) - (T

0

+F

0

) / (T

M

+F

M

)

Jeżeli pomiary D

M

i D

0

wykonamy w bardzo krótkim odstępie czasu, to stosunek F/T pozostanie w obydwu z

nich stały, F

M

/ T

M

= F

0

/ T

0

, z czego wynika że D

0

/ D

M

= F

0

/ F

M

.

Dzięki temu do określenia Y można wykorzystać łatwe do zmierzenia wydajności kwantowe fluorescencji:

Y = (F

M

- F

0

) / F

M

.

(F

M

- F

0

) jest często oznaczane symbolem F

V

i nosi nazwę fluorescencji zmiennej.

W praktyce stosowane są dwie metody pomiarowe.

a). Metoda wzbudzenia impulsowego (PAM = Pulse Amplitude Modulation) wykorzystuje możliwość rejestracji
fluorescencji wzbudzanej modulowanymi impulsami o niskim natężeniu.
Najpierw rejestruje się intensywność fluorescencji indukowanej podczas oświetlania wyłącznie impulsami, co
odpowiada F

0

(niskie natężenie światła, maksymalna wydajność fluorescencji) a następnie próbkę dodatkowo

oświetla się bardzo silnym światłem ciągłym, którego intensywność wielokrotnie przekracza próg wysycenia
fotosyntezy. Fluorescencja indukowana przez to światło nie jest jednak rejestrowana, natomiast intensywność
fluorescencji indukowanej w tych warunkach przez impulsy odpowiada fluorescencji "bez fotosyntezy" a więc
jest to F

M

.

b). Metoda krzywej Kautsky'ego
Krzywa Kautsky'ego przedstawia zmiany intensywności fluorescencji chlorofilu w aparacie fotosyntetycznym
po silnym oświetleniu zaciemnionej przedtem próbki. W pierwszym momencie fluorescencja jest na poziomie
F

0

, gdyż procesy fotochemiczne zachodzą z maksymalną wydajnością. Bardzo szybko jednak poszczególne

przenośniki elektronów fazy świetlnej (jasnej) fotosyntezy wysycają się, co obrazują punkty przegięcia krzywej,
aż do całkowitego wysycenia aparatu fotosyntetycznego i osiągnięcia poziomu odpowiadającego F

M

. Dla

zachowania założenia F

M

/ T

M

= F

0

/ T

0

czas osiągania F

M

musi być krótszy niż 1 s, co wymaga dużej

intensywności światła wzbudzającego (ponad 3000

µ

E m

-2

s

-1

). To z kolei pociąga za sobą bardzo krótki czas w

którym próbka wykazuje F

0

- zwykle 20 - 50

µ

s a to wymaga dużej rozdzielczości czasowej stosowanych

fluorymetrów.

Materiał roślinny
Przygotować liście roślin lub inne próbki fotosyntetycznie aktywne o spodziewanej różnej
wydajności fotosyntezy. UWAGA! Próbki muszą pochodzić z obiektów o ustalonej
przynależności systematycznej!

Przebieg doświadczenia:
Próbki przeznaczone do pomiaru inkubować w ciemności przez min. 15 min. Do aparatów
Hansatech, mierzących met. krzywej Kautsky'ego próbki zaciemnia sie przy użyciu klipsów
(pamiętac o zasunięciu zasuwek!), do aparatu Walz - PAM 210 materiał włożyć do ciemnej
szafkilub szuflady a dalsze operacje wykonywać w stłumionym lub zielonym świetle wg.
wskazówek prowadzącego ćwiczenia.

Sposób opracowania wyników:
Wyniki przedstawić w tabeli:

Gatunek

stan fizjologiczny próbki

F

M

Y = F

V

/F

M

Interpretacja wyników
Ustosunkować się do zależności między F

M

i F

V

/F

M

a stanem fizjologicznym próbki oraz do

zróżnicowania międzygatunkowego zmierzonych parametrów.