Metody biologii molekularnej

w diagnostyce medycznej

Mgr inż. Kamila Gala
Klinika Immunologii, Transplantologii
i Chorób Wewnętrznych

Biologia
m

olekularna

Definicja

Nauka, która stara się wyjaśnić zależności między

Nauka, która stara się wyjaśnić zależności między
strukturą i funkcją biologicznych cząsteczek oraz
sposobów wpływu tych zależności na przebieg
i regulację procesów biochemicznych

Przedmiot zainteresowania

Makrocząsteczki: DNA, RNA i białka

Procesy: replikacja, transkrypcja, translacja

DNA-

kwas deoksyrybonukleinowy

Jest nośnikiem informacji genetycznej

Liczba kopii genu w genomowym DNA jest stała

Sekwencja DNA to kolejność występowania zasad azotowych: A, G, C i T

w cząsteczce DNA

Wyróżniamy sekwencje kodujące –eksony i nie kodujące-introny

W sekwencjach zawarta jest informacja genetyczna

Rys.1.

Elementy DNA wchodzące w skład genu

Dwuniciowa helisa DNA

4 rodzaje zasad azotowych: adenina-A,

guanina-G, tymina-T i cytozyna-C

Nukleozyd

: zasada azotowa + cukier

(deoksyryboza)

Nukleotyd

: zasada azotowa + cukier +

fosforan

W 1953 r. Watson i Crick opracowali

trójwymiarowy model struktury DNA tzw.

trójwymiarowy model struktury DNA tzw.

helisy:

Zasady są skierowane do wnętrza

Rdzeń cukrowo-fosforanowy jest na zewnątrz

Nici utrzymywane są przez wiązania

wodorowe, A:T, G:C

Łączenie się zasad w pary to tworzenie

komplementarnych par zasad

Dwie nici DNA są owinięte wokół siebie

Rys.2. Model helisy DNA

RNA

kwas rybonukleinowy

Jest polimerem złożonym z

rybonukleotydów połączonych

wiązaniami fosfodiestrowymi

4 rodzaje zasad azotowych:

adenina-A,

uracyl-U

, guanina-G

adenina-A,

uracyl-U

, guanina-G

i cytozyna-C

Cukier to

ryboza

Cząsteczki RNA są jednoniciowe,

Tylko na pewnych odcinkach

tworzone są wewnątrzcząsteczkowe

regiony dwuniciowe

Rys. 3. Struktura RNA

RNA

Cząsteczki mRNA reprezentują geny, które

są aktywne w komórce

Poszczególne tkanki i komórki różnią się

jakościowym i ilościowym składem puli

cząsteczek mRNA

cząsteczek mRNA

Liczba kopii genu przepisanego na mRNA

zależy od aktywności tego genu w komórce

Dojrzałe cząsteczki mRNA zawierają ciągłą

sekwencję kodującą

Cząsteczki mRNA są nietrwałe

Co to jest ekspresja genu?

Wszystkie geny w komórce zapisane są
w postaci DNA

Aktywne geny zostają przepisane
z DNA na mRNA (

transkrypcja

)

Informacja zawarta w mRNA zostaje

odkodowana i na tej podstawie zostaje
utworzony łańcuch polipeptydowy >>> białko
(

translacja

)

DNA

transkrypcja

mRNA

translacja

Białko

Źródłem kwasów nukleinowych mogą być

komórki prawie wszystkich tkanek:

Krew obwodowa:

zabieg pobrania jest mało inwazyjny,

z leukocytów uzyskuje się dużo DNA/RNA

Wymaz z jamy ustnej:

do prostych testów genetycznych

Wycinek skóry i założenie hodowli fibroblastów:

dla szczegółowych i długotrwałych badań

Złuszczone komórki płodu pobierane podczas amniocentezy:

Złuszczone komórki płodu pobierane podczas amniocentezy:

do badań prenatalnych

Komórki guza, szpik kostny:

do badań onkologicznych

Płyn ustrojowy, surowica, płyn mózgowo-rdzeniowy, plwocina,

popłuczyny oskrzelowe, bioptaty tkankowe:

do wykrywania czynników zakaźnych

Nasienie:

kryminalistyka, ustalanie ojcostwa

Izolacja DNA

przygotowanie materiału biologicznego

dezintegracja i liza komórek

inaktywacja nukleaz komórkowych, za pomocą

np. proteinazy K

oddzielenie kwasu nukleinowego od pozostałych

komponentów komórkowych

zagęszczenie preparatu DNA

usunięcie zanieczyszczeń małocząsteczkowych

Obecnie stosuje się wiele metod
izolacji, w tym także izolacje
automatyczne

Rys.5. EasyMAG aparat do automatycznej izolacji
kwasów nukleinowych

Rys.4.Schemat izolacji DNA

Metody biologii molekularnej

Reakcja łańcuchowej polimerazy- PCR

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Sekwencjonowanie

Mikromacierze

Łańcuchowa reakcja polimerazy -PCR

Umożliwia uzyskanie dużej

liczby kopii danej sekwencji

DNA

Konieczna jest znajomość

sekwencji krótkich odcinków

DNA po każdej stronie

sekwencji przeznaczonej do

powielenia>>>

startery

powielenia>>>

startery

Etapy cyklu reakcji PCR:

denaturacja, hybrydyzacja i

elongacja

Liczba cykli jest uzależniona

od wymaganej krotności

powielenia wyjściowego DNA

Rys.6. Schemat zasady PCR

RT-PCR

reakcja odwrotnej transkrypcji

RNA nie można bezpośrednio powielać metodą PCR

Cząsteczki RNA przepisywane są na DNA w reakcji
katalizowanej przez enzym-odwrotną transkryptazę

katalizowanej przez enzym-odwrotną transkryptazę

W wyniku reakcji powstają cząsteczki DNA, tzw.
cDNA, które mogą być użyte w reakcji PCR

Wykorzystywanie:

badanie ekspresji genów

Ocena wyników PCR na żelu

agarozowym

W reakcji PCR powielane są krótkie odcinki
DNA

Po jej zakończeniu należy sprawdzić czy
powstał produkt o przewidywanej długości

Do oceny wyników stosuje się elektroforezę
na żelu agarozowym
DNA jest ujemnie naładowane

DNA jest ujemnie naładowane
i wędruje w żelu od ujemnej do dodatniej
elektrody

Szybkość przemieszczania się DNA zależy
od długości powielonych odcinków

Żel agarozowy zawiera substancję, która
wbudowuje się w DNA i fluoryzuje
w świetle UV

Cząsteczki DNA widoczne są jako świecące
prążki

M

Rys.7.Aparat do elektroforezy

Rys.8.Zdjęcie żelu agarozowego po
rozdziale elektroforetycznym

1

2

3

Analiza za pomocą reakcji PCR

1. Izolacja materiału, np. DNA z krwi

2. Sporządzenie mieszaniny reakcyjnej, np.
MasterMix+ startery specyficzne dla
fragmentu szukanego genu +DNA badane

Rys.

9

. Schemat izolacji DNA z krwi

3. Reakcja PCR w termocyklerze z
określoną ilością cykli

4. Rozdział produktu reakcji PCR
na żelu agarozowym i wizualizacja
w świetle UV

Rys.10.Zdjęcie termocyklera

Rys.11. Wynik rozdziału elektroforetycznego
produktu PCR

Metody hybrydyzacji

Wykorzystują zdolność łączenia się

jednoniciowych cząsteczek kwasów

nukleinowych o całkowicie lub

częściowo komplementarnej sekwencji

w struktury dwuniciowe

Jedna z nici reprezentuje badany kwas

nukleinowy, a druga pełni funkcje

znakowanej sondy

znakowanej sondy

Hybrydyzacja Southerna

Wykrywanie swoistego fragmentu DNA

przez sondę DNA znakowaną izotopem

promieniotwórczym lub barwnikiem

fluorescencencyjnym

Hybrydyzację Notherna

Rozdział cząsteczek mRNA i badanie

ekspresji genów

Rys.12. Schemat metody Southern blot

Sekwencjonowanie

Pozwala ustalić dokładną sekwencję

nukleotydów w badanym DNA i wykryć

mutacje punktowe

Na podstawie sekwencji istnieje możliwość

przewidzenia kolejności aminokwasów

przewidzenia kolejności aminokwasów

w białku, które jest kodowane przez dany gen

Dwie metody:

chemiczna
enzymatyczna

Obecnie DNA jest sekwencjonowany

automatycznie

Starter komplementarny do matrycy DNA

3’

5’

5’

3’

GCCTAGGGTTTGCGCTAC

Wydłużanie startera przy użyciu polimerazy DNA

+

CGGATCCCAAACGCGATG

CAGGCATGCAATGACC

Schemat automatycznego sekwencjonowania DNA

dATP
dGTP
dTTP
dCTP

ddCTP

ddTTP

ddATP
ddGTP

Terminatory znakowane
fluorescencyjnie

Rozdział produktów reakcji w automatycznym
sekwenatorze

dd

G

GTdd

C

Gdd

T

GTCCdd

G

GTCdd

C

GTCCGdd

T

GTCCGTdd

A

GTCCGTACdd

G

GTCCGTAdd

C

GTCCGTACGdd

T

GTCCGTACGTdd

T

GTCCGTACGTTdd

A

GTCCGTACGTTAdd

C

GTCCGTACGTTACdd

T

GTCCGTACGTTACTdd

G

GTCCGTACGTTACTGdd

G

Elektroforeza na żelu

Mikromacierze

Niewielkie szklane lub plastikowe płytki

Na płytki nanoszone są sondy

(kilka tysięcy)

Każda sonda jest specyficzna tylko dla

jednego genu

Na płytki nanoszone jest badane cDNA

lub mRNA wyznakowane np.

fluorescencyjnie

Rys.13. Płytki do mikromacierzy

fluorescencyjnie

Następuje wiązanie badanego cDNA lub

mRNA do komplementarnych sond

Analiza wyników za pomocą

odpowiedniego czytnika i komputera

Możliwa jest analiza praktycznie całego

genomu badanego organizmu

Rys.14. Wynik analizy
za pomocą mikromacierzy

Zastosowanie mikromacierzy

w medycynie

:

Poznawanie mechanizmów chorobotwórczych, np.

wykorzystując

mikromacierze wykryto m.in. geny związane ze stwardnieniem rozsianym, ciężką dziecięcą

dystrofią siatkówki

Identyfikacja wskaźników pozwalających na ocenę ryzyka rozwoju chorób

Określenie nowych obiektów, na których powinno koncentrować się

działanie leków

Określenie nowych obiektów, na których powinno koncentrować się

działanie leków

Postawienie dokładniejszej diagnozy i dostosowanie leczenia do

indywidualnego przypadku pacjenta

Diagnostyka chorób zakaźnych, np.

detekcja i identyfikacja rodzaju wirusa,

wykrywanie genów odporności na antybiotyki w szczepach bakteryjnych

Onkologia, np. odróżnienie łagodnej formy raka prostaty od formy

złośliwej

Diagnostyka

mikrobiologiczna

i wirusologiczna

Wykrywanie DNA lub RNA czynników zakaźnych:

drobnoustrojów, które wolno rosną lub nie rozwijają się
w hodowli, np. Mycobacterium tuberculosis

w hodowli, np. Mycobacterium tuberculosis

zakażeń wirusami, np. HBV, HCV, CMV, HIV

zakażeń bakteryjnych, np. Helicobacter pylori

Identyfikacja podtypów drobnoustroju/wirusa

genotypowanie wirusa HCV

Ocena masywności zakażenia

oznaczenie poziomu wiremii przy zakażeniu wirusowym
i monitorowanie efektywności leczenia

Diagnostyka onkologiczna

Wykrywanie swoistych dla danego nowotworu
zmian genetycznych

Typ zaburzeń genetycznych w komórkach nowotworu ważnym
czynnikiem prognostycznym >>> wybór schematu leczenia

PCR pozwala wykryć komórki nowotworowe nie zniszczone w
trakcie leczenia

trakcie leczenia

Ocena właściwości komórek nowotworowych

Badanie ekspresji genów przez komórki nowotworowe,

np. nowotwory w których dochodzi do ekspresji genów MRP mają
zdolność usuwania leków przeciwnowotworowych

Badanie predyspozycji genetycznej do
zachorowania na chorobę genetyczną

Diagnostyka genetyczna

Diagnostyka genetyczna

Wykrywanie wrodzonych mutacji u chorych

podejrzanych o chorobę uwarunkowaną genetycznie

Wywiad chorobowy i rodzinny
Badanie kliniczne
Badania dodatkowe, np. aktywność enzymów lizosomalnych

Ustalenie genu lub genów, które mogą być zmutowane u chorego

Badanie najczęstszych i dobrze scharakteryzowanych mutacji za
pomocą prostych testów diagnostycznych, a jeśli wynik negatywny:

Sekwencjonowanie całego genu w poszukiwaniu rzadszych mutacji

Potwierdzenie chorobotwórcze charakteru wykrytej mutacji

Ustalenie heterozygotyczności

i poradnictwo genetyczne dla zdrowych

członków rodziny

Wykonywanie badań u zdrowych osób, które
są zagrożone rozwojem jakiejś choroby ze względu na
obciążający wywiad rodzinny mają sens tylko wtedy,

obciążający wywiad rodzinny mają sens tylko wtedy,
gdy

otrzymanie dodatniego wyniku pozwala podjąć

skuteczne działania zapobiegające wystąpieniu
choroby

, np.

niewskazane jest wykonywanie badań w rodzinie
chorego na chorobę Huntingtona

Wykrywanie mutacji chorobotwórczych

w okresie przedobjawowym

Stwierdzenie mutacji u zdrowej osoby
z obciążającym wywiadem rodzinnym, np.
w kierunku

raka sutka i raka jajnika

w kierunku

raka sutka i raka jajnika

pozwala zaplanować wcześniejsze
i częstsze badania przesiewowe lub
wdrożyć farmakologiczne lub chirurgiczne
leczenie

Badania prenatalne umożliwiają wczesne wykrycie

chorób płodu uwarunkowanych genetycznie:

MUKOWISCYDOZA

Choroba metaboliczna,

Uszkodzony chromosom 7

FENYLOKETONURIA

Dziedziczna choroba przemiany materii

Rozwój choroby udało się zahamować-noworodki są rutynowo badane

Wczesne wykrycie umożliwia wprowadzenie specjalnej diety, co minimalizuje skutki

choroby

HEMOFILIA

Niedostateczna krzepliwość krwi

Choroba sprzężona z płcią

DYSTROFIA MIĘŚNIOWA DUCHENNE'A

Postępujący zanik mięśni. Zapadają na nią jedynie mężczyźni

Odpowiedzialny za tę chorobę jest gen umieszczony w chromosomie X

Choroba występuje w 1 przypadku na 300 żywych urodzeń

ZESPÓŁ DOWNA

Choroba genetyczna zbadana do tej pory najlepiej zbadana.

Przyczyną jest nadmiar chromosomów, tzw. trisomia chromosomu 21

Częściej występuje u dzieci kobiet, które rodzą po 35 roku życia

Wykrywanie często występujących polimorfizmów

związanych ze zwiększonym ryzykiem zachorowania

na niektóre choroby

Polimorfizmy nie przesądzają o

rozwoju określonej jednostki

chorobowej, ale modyfikują ryzyko jej

wystąpienia

Np. allele E2, E3, E4 genu APOE

Np. allele E2, E3, E4 genu APOE

Allel E4 genu APOE wiąże się ze

zwiększonym ryzykiem przedwczesnej

choroby wieńcowej, ale na ujawnienie

choroby mają wpływ także inne czynniki

genetyczne i środowiskowe

Badania genetyczne pomagają wykryć

osoby podatne i rozpocząć działania

profilaktyczne

Rys.15. Blaszka
miażdżycowa

Podsumowanie

Biologia molekularna jest najprężniej
rozwijającą się dziedziną nauk
biologicznych wywierających wpływ na
inne dziedziny nauki

inne dziedziny nauki

Postępy uzyskiwane w biotechnologii
i biologii molekularnej mogą zatem
posłużyć w celu jak najwcześniejszej
diagnostyki chorób, co jest głównym
wyzwaniem współczesnej medycyny

Dziękuję za uwagę

Dziękuję za uwagę ☺

☺