ĆWICZENIE 1 – 09.10

Tytuł: Izolacja DNA z użyciem CTAB

Cel: Izolacja oraz ocena ilościowa i jakościowa DNA z liścieni 2

Wyniki:

ilość wyizolowanego DNA = 2902.8 ng/µL

stosunek absorbancji λ 260/280 = 2.17

stosunek absorbancji λ 260/230 = 2.17

Po rozcieńczeniu próbki 50 µL wody:

ilość wyizolowanego DNA = 1448.4 ng/µL

stosunek absorbancji λ 260/280 = 2.17

stosunek absorbancji λ 260/230 = 2.27

Wnioski:

Uzyskane stężenie (2902.8ng/ µL) świadczy o dużej zawartości DNA w badanej próbie liścieni 2. Ilość ta przewyższała optymalny zakres dla reakcji PCR, dlatego też konieczne było rozcieńczenie próby. Po tym zabiegu stężenie DNA zostało oznaczone na poziomie 1448.4 ng/ µL, które jest również zadowalającym wynikiem.

Stosunek absorbancji 260/280 był identyczny zarówno przed jak i po rozcieńczeniu i wynosił 2.17. Na zanieczyszczenie białkami wskazuje wartość poniżej 1.8. na tej podstawie można, wiec stwierdzić, że badana próba liścieni 2 charakteryzuje się wysoką czystością, ze względu na brak w niej białek. Wynik ten mieścił się również poniżej górnej granicy, którą stanowi wartość 2.0.

Dodatkowo czystość, pod względem zanieczyszczenia polisacharydami, solami chaotropowymi i polifenolami, wyizolowanego DNA określa stosunek absorbancji 260/230. Wartość  tego współczynnika między 1.8-2.2 oznacza, że wyizolowane preparaty są wystarczająco oczyszczone. W przypadku badanej próby liścieni 2 przed rozcieńczeniem wynosił on 2.17, natomiast po był równy 2.27, nieznacznie wykraczając poza standard. Można zatem stwierdzić, że całkowite RNA wyizolowane z badanej próbki liścieni 2 charakteryzowało się wysoka czystością i brakiem zanieczyszczeń polisacharydami, polifenolami i solmi chaotropowymi. Preparat taki nie wymaga dodatkowego oczyszczenia.

ĆWICZENIE 2 – 16.10

Tytuł: Izolacja całkowitego RNA z użyciem odczynnika TRI-Reagent (Sigma). Oznaczanie czystości i jakości

Cel: Izolacja oraz ocena ilościowa i jakościowa RNA całkowitego z liścieni 2

Wyniki:

całkowita ilość wyizolowanego RNA = 2693.9 ng/µL

stosunek absorbancji λ 260/280 = 2.04

stosunek absorbancji λ 260/230 = 2.22

Po rozcieńczeniu próbki 10 µL DEPC:

ilość wyizolowanego DNA = 2121.0 ng/µL

stosunek absorbancji λ 260/280 = 2.07

stosunek absorbancji λ 260/230 = 2.27

Wnioski:

Całkowita ilość RNA, jaka została wyizolowana z liścieni 2 została oznaczona na poziomie 2693.9 ng/ µL. Jest to bardzo wysokie stężenie kwasu nukleinowego, dlatego koniecznym środkiem, który należy wykonać przed dalszymi badaniami, stało się rozcieńczenie tej próby. Całkowita zawartość RNA po rozcieńczeniu wynosiła 2121.0 ng/ µL.

Oznaczony na poziomie 2.22 (przed rozcieńczeniem) i 2.27 (po rozcieńczeniu) stosunek absorbancji 260/230 bardzo delikatnie wykracza poza przyjęty optymalny zakres 1.8-2.2. Wskazuje to na względnie czystą próbkę, pozbawioną zanieczyszczeń polifenolami, solami chaotropowymi czy polisacharydami.

Ponadto czystość wyizolowanego RNA i stopień jego zanieczyszczenia białkami określa stosunek absorbancji 260/280. W przypadku badanej próby liścieni 2 ustalił się on na poziomie 2.07. Przyjmuje się, że czyste DNA charakteryzuje się wartością 260/280 pomiędzy 1.8 a 2.0, dlatego badaną próbkę, która nieznacznie przewyższała przyjęty standard można uznać za czystą i pozbawioną zanieczyszczeń białkami.

ĆWICZENIE 3 – 23.10

1. Tytuł: Synteza cDNA na matrycy mRNA (odwrotna transkrypcja)

Cel: Synteza cDNA na matrycy mRNA otrzymanego z wyizolowanego z liścieni 2 całkowitego RNA, z wykorzystaniem starterów oligo(dT) oraz odwrotnej transkryptazy

Wyniki:

Otrzymane cDNA zostało wykorzystane do przeprowadzenia ćwiczenia nr. 4: amplifikacji genu MTP7 na matrycy cDNA

2. Tytuł: Elektroforeza DNA i RNA w żelu agarozowym

Cel: Wizualizacja i ocena jakościowa kwasów nukleinowych: DNA i RNA (wyizolowanych z liścieni 2 podczas zajęć nr 1 i nr 2) w żelu agarozowym

Wyniki:

Elektroforetyczny rozdział RNA uwidocznił W zdjęciu rozdziału kwasu

2 wyraźne (choć mogłyby być wyraźniejsze) deoksyrybonukleinowego pokazuje jeden

produkty w postaci w postaci poprzecznych prążków. niezbyt wyraźny, lecz gruby produkt

na samej górze (przy kieszonce).

Wnioski:

Możliwy do zaobserwowania na zdjęciu elektroforetycznego rozdziału DNA prążek wskazuje na obecność wysokocząsteczkowe DNA (wielkości powyżej 50kb). Jednakże smugi DNA znajdujące się na całej długości rozdziału, poniżej prążka wskazują na mechaniczną lub/i chemiczną degradację kwasu nukleinowego, spowodowanego zbyt długim, bądź nieprawidłowym przechowywaniem prób lub błędami podczas procedury izolacji.

Uwidocznione na załączonym zdjęciu dwa wyraźne prążki, są podjednostkami rybosomów: bliższa kieszonki to podjednostka o stałej sedymentacji 28S, natomiast ta znajdująca się poniżej niej to podjednostka 18S. Biorąc pod uwagę skład izolatu, w którym zawiera się całe RNA, tj.: mRNA, rRNA oraz tRNA nie jest możliwe zaobserwowanie pozostałych produktów, w postaci konkretnych prążków, poza wymienionymi wcześniej podjednostkami 28S i 18S. Uzyskana analiza RNA za pomocą rozdziału elektroforetycznego w żelu agarozowym pozwala na określenie jakości badanej próby liścieni 2 za bardzo dobrą.

3. Tytuł: Amplifikacja genu MTP12 na matrycy DNA

Cel: Powielenie genu MTP12 za pomocą reakcji PCR na, uzyskanej z liścieni 2 podczas ćw. nr 1, matrycy DNA, z wykorzystaniem polimerazy Marathon

Wyniki:

Uzyskany produkt został wykorzystany do przeprowadzenia ćw nr. 4.1: elektroforezy produktów PCR otrzymanych na matrycy DNA w żelu agarozowym.

Wyniki zostały przedstawione podczas opisu w/w ćwiczenia

4. Tytuł: Amplifikacja genu MTP7 na matrycy cDNA

Cel: Powielenie genu MTP7 za pomocą reakcji PCR na matrycy cDNA (otrzymanym z liścieni 2 w reakcji odwrotnej transkrypcji), z wykorzystaniem polimerazy Phusion. Sprawdzenie czy gen MTP7 ulega ekspresji w różnych częściach rośliny

Wyniki:

Uzyskany produkt został wykorzystany do przeprowadzenia ćw nr. 4.1: elektroforezy produktów PCR otrzymanych na matrycy cDNA w żelu agarozowym.

Wyniki zostały przedstawione podczas opisu w/w ćwiczenia

ĆWICZENIE 4 – 06.11

1. Tytuł: Elektroforeza produktów PCR otrzymanych na matrycach DNA i cDNA w żelu agarozowym

Cel: Elektroforeza zamplifikowanego genu MTP12 na matrycy DNA oraz zamplifikowanego genu MTP7 na matrycy cDNA (wyizolowanych z liścieni 2) w żelu agarozowym

Wyniki:

Elektroforetyczny rozdział genu MTP7 zamplifikowanego na matrycy cDNA pokazał całkowity brak tego produktu we wszystkich badanych częściach rośliny.

W przypadku produktu PCR jakim był gen MTp12 na matrycy DNA (otrzymanego z liścieni 2) jest bardzo dobrze uwidoczniony jeden gruby produkt w postaci prążka pośrodku drogi rozdziału.

Wnioski:

Gen MTP7, który wg celu i założenia powinien zostać zamplifikowany na matrycy, wyizolowanego z liścieni 2, cDNA i uwidoczniony jako produkt reakcji PCR podczas rozdziału elektroforetycznego nie został otrzymany z powodu jednej (lub więcej) z poniższych przyczyn:

1. Popełniony został błąd przy przeprowadzaniu reakcji syntezy cDNA na matrycy mRNA (odwrotnej transkrypcji):

- próbka została zanieczyszczona RNAzami na tyle znacząco, że zdegradowała substrat, np. przez nieuwagę podczas nastawiania reakcji dowrotnej transkryptazy

- RNA zostało utracone podczas przepisywania, w związku z czym nie mogło dojść do powstania cDNA

- odwrotna transkryptaza lub polimeraza mogła być nieaktywna (niewłaściwe warunki itp.)

1. Popełniony został błąd przy przeprowadzaniu reakcji PCR

- zostały źle dobrane warunki reakcji

- powstał błąd podczas sporządzania mieszaniny reakcyjnej PCR

- mRNA mogło przybrać struktury drugorzędowe, a denaturacja trwała zbyt krótko, aby możliwe było usunięcie wiązań wodorowych oraz oddziaływań elektrostatycznych pomiędzy zasadami i rozplecenie nici do struktury pierwszorzędowej

1. Gen MTP7 nie ulega ekspresji na tak wczesnym etapie rozwoju rośliny

Elektroforetyczny rozdział genu MTP12 zamplifikowanego na matrycy DNA pokazał jeden bardzo wyraźny produkt. Świadczy to o poprawnym przeprowadzeniu wszystkich poprzedzających elektroforezę etapów, które doprowadziły do uzyskania dobrej jakości czystej matrycy DNA, a także właściwego przeprowadzenia reakcji PCR. Uzyskana analiza elektroforetyczna pokazuje, ze gen MTP12 ulega ekspresji na tym etapie rozwoju rośliny.

2. Tytuł: Tranformacja bakterii kompetentnych

Cel: Tranformacja bakterii kompetentnych (E.coli) TOP10 konstruktem wektorowym pUG36GFP-MTP5 metoda elektroporacji

Wyniki:

Na podłożu LB z ampicyliną wyrosła bardzo duża, trudna do obliczenia, ilość kolonii bakterii.

Wnioski:

Wzrost bakterii na podłożu selekcyjnym z ampicyliną świadczy o efektywnym zajściu procesu transformacji, wskutek którego do genomu bakterii został wbudowany gen oporności na ampicylinę, pobrany ze środowiska zewnętrznego. Ilość kolonii, które były zdolne do rozwoju na tym podłożu wskazuje na bardzo wysoką skuteczność metody elektroporacji, która została zastosowana w tym przypadku.

3. Tytuł: Tranformacja drożdży kompetentnych

Cel: Tranformacja drożdży kompetentnych konstruktem wektorowym pUG36GFP-MTP5 metoda heat-shock

Wyniki:

Na pożywce bez uracylu wyrosła jedna duża kolonia drożdży

Wnioski:

Wzrost kolonii na podłożu niezawierającego uracylu oznacza prawidłowo przeprowadzoną reakcję transformacji. Podczas tego procesu komórki drożdży pobrały ze środowiska gen szlaku biosyntezy uracylu, w związku z czym po transformacji były zdolne do wzrostu na podłożu niezawierającego tej zasady. Ze względu na wzrost tylko jednej kolonii drożdży możemy wysunąć wniosek o mniejszej niż elektroporacja efektywności metody heat-shock.