A-PDF Merger DEMO : Purchase from www.A-PDF.com to remove the watermark

A-PDF Merger DEMO : Purchase from www.A-PDF.com to remove the watermark

Metody i techniki

stosowane w

biologii

molekularnej

Katarzyna Bogacz

Ewa Grędowska

Karolina Osińska

Justyna Stolarczuk

Józef Lisowski

PCR

PCR

PCR

PCR

Polimerase

Polimerase

Polimerase

Polimerase Chain

Chain

Chain

Chain

Reaction

Reaction

Reaction

Reaction

Umożliwia powielanie określonego fragmentu DNA

Dzięki tej metodzie otrzymujemy szybko duże ilości
powielonego DNA

Zasady PCR:

Denaturacja

Denaturacja

–

–

rozdzielenia nici DNA (94 st. C)

rozdzielenia nici DNA (94 st. C)

Przy

Przy

łą

łą

czenie starter

czenie starter

ó

ó

w

w

do komplementarnych

do komplementarnych

miejsc na matrycy (~50 st. C)

miejsc na matrycy (~50 st. C)

Wyd

Wyd

ł

ł

u

u

ż

ż

anie

anie

nici potomnych

nici potomnych

od ko

od ko

ń

ń

ca 3

ca 3

’

’

startera

startera

Kolejne cykle powtarzane są wg. tego samego
schematu. Zwykle zachodzi ok. 35 cykli, czyli
ilość otrzymanych cząsteczek wynosi 2

35

Termocyklery

Zastosowanie:

Sekwencjonowanie DNA

Mapowanie genów

Filogenetyka molekularna

Medycyna sądowa

Diagnostyka patogenów

Diagnostyka chorób genetycznych

Enzymy

restrykcyjne

Enzymy uzyskane z bakterii

Rozpoznają i przecinają sekwencje ok. 4 – 8
nukleotydów

Zwykle są to nici palindromowe (obydwie czytane od 5’
do 3’ są takie same)

W laboratoriach wykorzystujemy ok. 300 enzymów

Wykorzystanie enzymów restrykcyjnych jest podstawą
manipulacji cząsteczkami DNA

5‘- - -T

CGA- - -3'

3'- - -AGC

T- - -5'

5‘ TCGA

3‘ AGCT

Thermus
aquaticus

TaqI

5'- - -A

AGCTT- - -3'

3'- - -TTCGA

A- - -5'

5‘ AAGCTT

3‘ TTCGAA

Haemophilus
influenzae

HindIII

5'- - -

GATC- - -3'

3'- - -CTAG

- - -5'

5‘ GATC

3‘ CTAG

Staphylococcus
aureus

Sau3A

5'- - -G

AATTC- - -3'

3'- - -CTTAA

G- - -5'

5‘ GAATTC

3‘ CTTAAG

Escherichia coli

EcoRI

Ci

Ci

ę

ę

cie

cie

Rozpoznawana

Rozpoznawana

sekwencja

sekwencja

Pochodzenie

Pochodzenie

Enzym

Enzym

Przykłady enzymów

Elektroforeza

Elektroforeza

Elektroforeza

Elektroforeza - to te

chnika

umożliwiająca rozdzie

lenie

fragmentów DNA o ró

ż

nej wielkości

przy użyciu pola

elektrycznego.

Podczas elektroforezy stosowane są dwa

rodzaje żeli:

agarozowe

poliakrylamidowe

(stosuje się, gdy rozdzielane

fragmenty różnią się d

ł

ugością kilku lub nawet jednego

nukleotydu)

W czasie elektroforezy cząsteczki DNA przemieszczają

się w żelu pod wp

ł

ywem przy

ł

ożonego napięcia

elektrycznego. Dodatnio na

ł

adowane cząsteczki

wędrują w kierunku elektrody ujemnej. śel jest siecią

porów, przez które przeciskają się badane cząsteczki.

Im cząsteczka krótsza, tym szybciej przemieszcza się,

a w efekcie przebywa najd

ł

uższy odcinek. Cząsteczki

tej samej d

ł

ugości zajmują to samo miejsce w żelu,

tworząc prążek, który możemy uwidocznić pod

wp

ł

ywem promieni UV stosując związek fluoryzujący,

wnikający pomiędzy pary zasad DNA.

Jest to technika analizy cząsteczek Dna. Umożliwia ona

identyfikację określonej sekwencji DNA spośród tysięcy innych

cząsteczek DNA.

Etap pierwszy - poci

ę

cie genomowego DNA przy udziale enzymów

restrykcyjnych.

Etap drugi - rozdzielanie uzyskanych fragmentów (w zale

ż

no

ś

ci od wielko

ś

ci)

w

ż

elu agarozowym.

Etap trzeci – przeprowadzenie denaturacji w

ż

elu poprzez zanurzenie go w

roztworze alkalicznym, w celu uzyskania jednoniciowych fragmentów (zdolnych
do pó

ź

niejszej hybrydyzacji)

Etap czwarty – przeniesienie fragmentów DNA na wi

ążą

cy je filtr

nitrocelulozowy lub nylonowy, a nast

ę

pnie umieszczenie go w biorze

zawieraj

ą

cym wyznakowan

ą

radioaktywnie sond

ę

. Hybrydyzuje ona z

komplementarn

ą

sekwencj

ą

.

Etap pi

ą

ty – usuni

ę

cie nadmiaru sondy, po czym metod

ą

autoradiograficzn

ą

wykrywa si

ę

zwi

ą

zane z sond

ą

cz

ą

steczki NA.

W podobny sposób mo

ż

na bada

ć

cz

ą

steczki RNA. Metoda ta nazywana

jest Northern blot.

RFLP

RFLP

(

ang. Restriction Fragments

Length Polymorphism-

polimorfizm

polimorfizm

d

d

ł

ł

ugo

ugo

ś

ś

ci fragment

ci fragment

ó

ó

w restrykcyjnych

w restrykcyjnych.)

W metodzie tej wykorzystujemy enzymy
restrykcyjne.
Je

ż

eli w obr

ę

bie rozpoznawanej przez enzym

sekwencji wyst

ą

pi mutacja punktowa miejsce

to nie b

ę

dzie rozpoznawane przez enzym i nie

nast

ą

pi przeci

ę

cie.

RFLP jest wykorzystywany w technice, w której
organizmy mog

ą

by

ć

ró

ż

nicowane poprzez analiz

ę

wzorów pochodz

ą

cych z poci

ę

cia ich DNA.

Jest to metoda, która pozwala na wykazanie
powi

ą

za

ń

rodzinnych poprzez porównywanie

charakterystycznych wzorów polimorficznych, które
s

ą

otrzymywane, gdy okre

ś

lone regiony ła

ń

cucha

DNA s

ą

powielane i poci

ę

te przez okre

ś

lone enzymy

restrykcyjne.
Porównanie fragmentów restrykcyjnych matki,
dziecka i domniemanego ojca pozwala tak

ż

e na

potwierdzenie lub wykluczenie ojcostwa.

Przy pomocy tej metody mo

ż

na odró

ż

ni

ć

allel

prawidłowy od zmutowanego, np. w anemii
sierpowatej.
Anemia sierpowata spowodowana jest
mutacj

ą

punktow

ą

polegaj

ą

c

ą

na zmianie

adeniny w tymin

ę

. Zmiana ta zachodzi w

obr

ę

bie sekwencji rozpoznawanej przez

enzym restrykcyjny o nazwie MST II. W
prawidłowej, normalnej sekwencji wyst

ę

puj

ą

trzy miejsca ci

ę

cia, mutacja natomiast

powoduje utrat

ę

jednego miejsca ci

ę

cia.

ASO

ASO

(ang. Allele Specific Oligonucleotide

Hybrydization.)

Metoda ta pozwala na wykrycie nawet niewielkich
ró

ż

nic w badanych sekwencjach. Umo

ż

liwia

wykrycie pojedynczej mutacji.

Sekwencja DNA, w której zamierzamy bada

ć

okre

ś

lon

ą

mutacj

ę

, amplifikowana jest przy

pomocy metody PCR. Nast

ę

pnie wykonuje si

ę

hybrydyzacj

ę

badanego odcinka DNA z krótkimi,

najcz

ęś

ciej sztucznie zsyntetyzowanymi sondami

DNA, które s

ą

komplementarne do sekwencji

prawidłowej i zmutowanej. Zmiana nawet
pojedynczego nukleotydu powoduje brak
hybrydyzacji.

Dzi

ę

ki tej metodzie mo

ż

na okre

ś

li

ć

genotyp

pacjenta.

U heterozygoty hybrydyzacja nast

ą

pi z obiema

sondami.