Katedra Genetyki Molekularnej U

Ł

PCR

Łańcuchowa reakcja

polimerazy

polimerazy

PCR

(ang. polymerase chain reaction)

łańcuchowa reakcja polimerazy

Technika badawcza i diagnostyczna

Wykorzystuje zdolność DNA do replikacji

Katalizowana przez polimerazy DNA

Metoda PCR umożliwia amplifikację in vitro wybranych
odcinków DNA (oraz RNA przepisanego na cDNA)

Ważne daty

1987 - grupa naukowców
z Cetus Corporation w USA
opracowała metodę PCR

opracowała metodę PCR

1993 – Kary Mullis otrzymał Nagrodę
Nobla w dziedzinie chemii

O ogromnym znaczeniu tej metody

decydują:

Możliwość analizy DNA w przypadku jego bardzo małej
ilości

Duża czułość metody pozwalająca na zwielokrotnienie

Duża czułość metody pozwalająca na zwielokrotnienie

ściśle określonej sekwencji mimo obecności innych
sekwencji

Można dysponować DNA wyizolowanym z jednej komórki

Reakcja PCR składa się

z powtarzających się cykli a każdy z nich

przebiega w trzech etapach

1.

Denaturacja dwuniciowego
DNA (dsDNA)

92-96

0

C przez 30-60 sek.

2.

Przyłączanie starterów

50-65

0

C przez 30-60 sek

3.

Wydłużanie starterów
(amplifikacja)

68 -72

0

C przez 60-120 sek

(ok. 1000 bp przez 1 min)

Schemat reakcji PCR

W każdym cyklu dochodzi do zwiększenia liczby
amplifikowanych fragmentów w postępie logarytmicznym

np. po 30 cyklach jest już 2

30

czyli 1 073 741 824

Termocykler

Standardowe komponenty reakcji

PCR

1.

matryca - DNA lub RNA

2.

woda wolna od nukleaz

3.

Startery (dolny i górny)

4.

dNTP

5.

termostabilna polimeraza DNA

6.

MgCl

2

7.

bufor reakcyjny

Matryca

Do reakcji PCR można
wykorzystać DNA lub RNA
izolowany z materiału
świeżego lub archiwalnego

Najczęściej w 20 µl reakcji
stosuje się 10-100 ng
matrycy

Trifosforany

deoksyrybonukleozydów (dNTP)

Substraty reakcji PCR

Uczestniczą w wydłużaniu sekwencji starterów
zgodnie z regułą komplementarności względem
amplifikowanej nici DNA

Dostarczają energii do przebiegu reakcji

Stężenie wyjściowe wynosi 5-10 mM, natomiast
stężenie dNTP w reakcji powinno wynosić 20-200 µM

Wskazane jest stosowanie jednakowych stężeń
wszystkich nukleotydów

Rozkład dNTP jest bardzo często przyczyną braku
produktu PCR

Startery

Komplemantarne do amplifikowanej sekwencji
jednoniciowe oligonukleotydy o długości 18-28
nukleotydów

Zawartość GC powinna stanowić 50-60 % całej

Zawartość GC powinna stanowić 50-60 % całej
sekwencji

Optymalne stężenie starterów 0,1-0,5 µM

Denaturacja dsDNA

92-96

0

C przez 30-60 sek.

5’

3’

5’

3’

3’

3’

5’

5’

5’

3’ OH

Starter dolny

Starter górny

OH

3’

Ni

ć

koduj

ą

ca

Ni

ć

komplementarna

Przył

ą

czanie starterów

50-65

0

C przez 30-60 sek

3’

5’

3’

5’

górny

3’

5’

3’

5’

5’

3’

dolny

Amplifikacja

68 -72

0

C przez 60-120 sek

3’

3’

Bardzo ważne w wyborze

starterów są:

Specyficzno

ść

Pełna komplementarno

ść

ko

ń

ców 3‘

starterów z matryc

ą

starterów z matryc

ą

Brak komplementarno

ś

ci mi

ę

dzy sob

ą

Brak powtórze

ń

nukleotydowych

Brak struktur 2 rz

ę

dowych (np. szpilki do

włosów „hairpin”)

Obecno

ść

na ko

ń

cu 3’ nukleotydu G albo C

Polimeraza

Enzym katalizyujący reakcję syntezy DNA

Taq

polimeraza – wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus

Pfu polimeraza – z bakterii Pyrococcus furiosis

Pfu polimeraza – z bakterii Pyrococcus furiosis

Stężenie wyjściowe polimeraz wynosi 0,5-5 U / µl

1 U / reakcję

Optymalny zakres działania wynosi 68-

72

0

C

Bufor reakcyjny

Zapewnia odpowiednie warunki dla działania
polimerazy, stabilizuje ją oraz modyfikuje
oddziaływania pomiędzy matrycą i starterami

Zawiera głównie:



MgCl

2

(1,5- 2mM)



KCl (50 mM)



Tris HCl (10-50 mM) (kwasowa sól

tris (hydroxymetyl)

aminometanu )



(NH

4

)

2

SO

4

(20 mM)

MgCl

2

Jony Mg

2+

wiązane są zarówno przez polimerazę,

startery, matrycę jak i dNTP

Dokładność reakcji PCR jest proporcjonalna do stężenia

Dokładność reakcji PCR jest proporcjonalna do stężenia
wolnych jonów magnezu

Z reguły stosuje się stężenie magnezu przewyższające

stężenie dNTP co zwiększa dokładność polimerazy

Zastosowanie metody PCR

Wykrywanie zmian (mutacji) w genomowym DNA w
chorobach genetycznych

Badanie predyspozycji do chorób nowotworowych

Monitorowanie i wykrywanie nowotworów

Wykrywanie polimorficznych sekwencji DNA na potrzeby
identyfikacji indywidualnej (badanie ojcostwa,

identyfikacji indywidualnej (badanie ojcostwa,
kryminalistyka, transplantacje)

Wykrywanie patogenów infekcyjnych (bakterie, wirusy,
pasożyty)

Produkcja żywności

Choroby zwierząt

Biotechnologia

Zastosowanie metody PCR

Badanie sekwencji mini- i mikrosatelitarnych cechująch
się wysokim polimorfizmem



Diagnostyka pośrednia chorób genetycznych



Medycyna sądowa

Medycyna sądowa

Zwiększenie ilości wybranych odcinków DNA do
późniejszego sekwencjonowania lub tworzenia biblioteki
genów

Modyfikacje metody PCR

PCR-RFLP

RT-PCR

ASO-PCR

PCR-RFLP

(ang. restriction fragment lenght polymorphisms)

Amplifikowany za pomocą łańcuchowej reakcji PCR fragment
badanego genu zawierający miejsce polimorficzne poddany
zostaje działaniu określonego enzymu restrykcyjnego, który
rozpoznaje specyficzną dla niego sekwencję nukleotydową i

rozpoznaje specyficzną dla niego sekwencję nukleotydową i
przecina DNA w określonym miejscu

Następnie pocięty DNA jest rozdzielany elektroforetycznie –
obraz elektroforetycznego rozdziału uzyskanych fragmentów
umożliwia identyfikację poszczególnych alleli danego genu

Zastosowanie: badanie polimorfizmu genów

PCR-RFLP

Enzym restrykcyjny HaeIII z Haemophilus

aegypticus. Enzym ten rozpoznaje i przecina
poniższą sekwencję, w wyniku, czego
powstają "tępe końce".

5' GGCC 3‘

5' GG ... CC 3'

5' GGCC 3‘

5' GG ... CC 3'

3' CCGG 5‘

3' CC ... GG 5'

Uwidocznienie produktów PCR

Produkt PCR powinien być
uwidoczniony na żelu
(agarozowym albo
poliakrylamidowym) jako ostry
prążek o określonej wielkości

prążek o określonej wielkości
i porównany ze znanym
markerem wielkości.

Barwienie

:

Bromek etydyny

Autoradiografia

Srebrzenie

Fluorografia

Produkt reakcji PCR

Trawienie enzymem restrykcyjnym