Enzymy restrykcyjne
Restryktazy (inaczej enzymy restrykcyjne , endonukleazy restrykcyjne) - to enzymy
izolowane z bakterii , zdolne do rozpoznawania specyficznych sekwencji w DNA
(z reguły są to sekwencje palindromowe) i do przecinania dwuniciowej cząsteczki
DNA w ściśle określonym miejscu , w obrębie lub okolicy sekwencji
rozpoznawanej. Otrzymywane fragmenty DNA nie są losowe a w ka\
dym prą\
ku
na \
elu znajdują się cząsteczki DNA o identycznej sekwencji nukleotydowej. Z
reguły ró\
ne enzymy rozpoznają odmienne sekwencje DNA.
Istnieją jednak wyjątki - tzw. izoschizomery - enzymy izolowane z ró\
nych
organizmów ale rozpoznające te same sekwencje oraz heteroizoschizomery -
enzymy rozpoznające te same sekwencje ale tnące w innym miejscu.
Typy enzymów:
Typ I - wielopodjednostkowe kompleksy enzymatyczne zawierające aktywności
metylazy i restryktazy. Przecinają DNA z dala od rozpoznawanej sekwencji, w bli\
ej
nieokreślonym miejscu. Z tego powodu nie mają większego zastosowania
praktycznego.
Typ II - przecinają DNA w zdefiniowanym miejscu, w obszarze rozpoznawanej
sekwencji lub w jej pobli\
u. Składają się z pojedynczych polipeptydów. Rozpoznają
sekwencje symetryczne.
Typ IIs - zbli\
one do typu II, przecinają z jednej strony rozpoznawanej sekwencji, która
jest asymetryczna.
Typ III - du\
e kompleksy, które wymagają dwóch sekwencji rozpoznawanych w pobli\
u
siebie. Bez znaczenia praktycznego.
Typ IV - zbli\
one do typu II. Zawierają aktywność metylazy i restryktazy w tym samym
polipeptydzie. Przecinają DNA w zdefiniowanym obszarze poza sekwencją
rozpoznawania. Aktywności metylazy i restryktazy nie mogą działać równocześnie.
Enzym "przełącza" się w zale\
ności od substratu.
Enzymy restrykcyjne klas I-III
Charakterystyka Typ I Typ II Typ III
Aktywność Pojedynczy enzym Oddzielne Oddzielne e nzymy ze
restrykcyjna i wielofunkcyjny restryktazy i wspólna podjednos
tką
modyfikacyjna metylazy
Struktura białkowa Trzy ró\
ne Prosta Dwie ró\
ne
endonukleazy podjednostki podjednostki
restrykcyjnej
Wymagania do ATP, Mg2+, Mg2+ ATP, Mg2+,
restrykcji S-adenozylometionina (S-adenozylometionina)
restrykcji S-adenozylometionina (S-adenozylometionina)
Charakterystyka EcoB: TGAN8TGCT Symetria EcoP1: AGACC
rozpoznawanej EcoK:AACN6GTGC rotacyjna EcoP15: CAGCAG
sekwencji (palindromowa)
(nie dotyczy
IIs)
Miejsce trawienia Przypuszczalnie W lub w 24-26 bp po stronie 3
przypadkowe, co pobli\
u miejsca od miejsca
najmniej 1000 bp od rozpoznawanej rozpoznawanej
miejsca rozpoznawanej sekwencji sekwencji
sekwencji
Przemieszczenie Tak Nie Nie
DNA
Podział według rodzaju wytwarzanych końców:
tępe końce - nici rozcięte naprzeciwko siebie - wszystkie nukleotydy są sparowane
z komplementarnymi nukleotydami na przeciwnym łańcuchu
lepkie końce - 3` lub 5` ssDNA (jednoniciowe) ogony na obu końcach utworzone
lepkie końce - 3` lub 5` ssDNA (jednoniciowe) ogony na obu końcach utworzone
przez niesymetryczne cięcie , komplementarne do podobnych tworzonych w
innych cząsteczkach DNA przez te same enzymy restrykcyjne niezale\
nie od
z
ródła DNA , co pozwala na ligowanie DNA nawet bardzo ró\
niących się
gatunków czyli formowanie chimerycznych molekuł.
Podział według sekwencji rozpoznawanej:
czwórkowe - rozpoznają sekwencję DNA zło\
oną z czterech nukleotydów.
Statystycznie w dowolnym DNA takich miejsc jest du\
o - co 256 bp.
Restryktazy takie mogą strawić DNA na bardzo małe kawałki.
szóstkowe - rozpoznają sekwencję DNA zło\
oną z sześciu nukleotydów.
Dowolne miejsce restrykcyjne zło\
one z sześciu nukleotydów występuje
statystycznie co około 4096 bp w DNA , w którym ilości poszczególnych
nukleotydów są równe. Proporcje te zmieniają się w zale\
ności od organizmu ,
dlatego dobór enzymu szóstkowego i warunki nale\
y ustalić
dlatego dobór enzymu szóstkowego i warunki nale\
y ustalić
eksperymentalnie.
ósemkowe - stosowane niezbyt często. Tną DNA bardzo rzadko.
Nomenklatura endonukleaz
Nazewnictwo opiera się na literowych skrótach, w których:
" pierwsza litera pochodzi od rodzaju bakterii ,
" druga i trzecia od gatunku,
" następna litera oznacza szczep lub typ,
" kolejne enzymy z danego szczepu lub typu otrzymują litery rzymskie
Przykłady nomenklatury:
- NgoM IV - czwarty enzym wyizolowany z Neisseria gonorrhoeae szczepu MS11.
- Uba 58 I - enzym wyizolowany z niezidentyfikowanej bakterii (Unidentified bacterium)
RFL58
- BamH I - pierwszy enzym wyizolowany z Bacillus amyloliquefaciens szczepu H.
Restryktazy klasy II
Restryktazy klasy II
Zastosowanie enzymów restrykcyjnych:
Konstrukcja map restrykcyjnych - Analizując na \
elach produkty trawienia danego DNA
ró\
nymi enzymami restrykcyjnymi , stosowanymi pojedynczo , w kombinacjach oraz w
ilościach wystarczających lub niewystarczających do pełnego strawienia preparatu , mo\
na
ustalić wzajemne poło\
enie i odległości pomiędzy sekwencjami rozpoznawanymi przez te
enzymy. Mapa restrykcyjna to obraz cząsteczki DNA , na którym zaznaczone są miejsca
rozpoznawane przez ró\
ne enzymy restrykcyjne z uwzględnieniem odległości między nimi
wyra\
onej w nukleotydach.
Klonowanie i obróbka DNA - DNA pocięty enzymami restrykcyjnymi mo\
na poddawać
ligacji z wektorem. W ten sposób tworzone są zrekombinowane plazmidy czyli plazmidy
zawierające sklonowany DNA , który mo\
na póz
niej poddawać ró\
nym manipulacjom przy
u\
yciu odpowiednich enzymów restrykcyjnych.
Badanie polimorfizmu miejsc restrykcyjnych (RFLP).
RFLP
Ligazy DNA katalizują formowanie
wiązań fosfodiestrowych pomiędzy
końcem hydroksylowym 3` a końcem
fosforowym 5` DNA. Pozwala to na
reperowanie jednoniciowych przerw w
dupleksie DNA , łączenie fragmentów
restrykcyjnych posiadających
homologiczne lepkie czy te\
nawet tępe
końce.