Aby manipulować genami niezbędne są odpowiednie
narzędzia molekularne, które pozwalają uzyskać tzw.
zrekombinowane DNA (umożliwiają rekombinację
materiału genetycznego in vitro czyli w próbówce)
Najważniejsze z nich to:
" enzymy restrykcyjne
" wektory DNA
" inne enzymy np. ligazy, fosfatazy, polimerazy, kinazy,
nukleazy
" Ligazy
Katalizują tworzenie wiązań fosfodiestrowych między sąsiednimi grupami
3 OH i 5 PO4 w kwasach nukleinowych  DNA lub RNA.
W reakcji tworzą się wysokoenergetyczne pośredniki z udziałem NAD+ lub
ATP w zależności od typu ligazy.
Funkcja in vivo: udział w replikacji opóz
nionego pasma DNA,
rekombinacja genetyczna, naprawa DNA
Zastosowanie ligazy w inżynierii
genetycznej:
Rekombinacja DNA in vitro  łączenie
cząsteczek kwasów nukleinowych
lepkich lub tępych końców oraz szereg
innych bardzo specyficznych
zastosowań.
Własności ligaz używanych w rekombinacji in vitro
Ligazy Substraty kofaktory temperatura
lepkie tępe końce DNA-RNA RNA-RNA
_______________________________________________________________________________________
E.coli tak tak* nie nie NAD+ Mg2+ (1-3 mM) 10-15 C
T4 faga tak tak* tak* tak* ATP Mg2+ (10 mM) 4 C
15-25 C
Bakterii
termofilnych tak nie nie nie NAD+ Mg2+ (10 mM) 24-37 C
Ligacja tępych końców jest znacznie mniej efektywna
Fosfataza alkaliczna
Usuwa 5 -fosforan z ssDNA, dsDNA i RNA, rNTP i dNTP. Metaloenzym (Zn II)
Bakteryjna fosfataza alkaliczna (BAP) najbardziej efektywna, ale jest oporna na
ogrzewanie i detergenty. Z tego powodu trudno zakończyć reakcję
defosforylacji. Peryplazmatyczny enzym, działa w buforze Tris pH 8.0-9.0 w
obecności niskich stężeń Zn+2 (poniżej 1 mM).
Alkaliczna fosfataza cielęca (CIAP  calf intestinal alkaline phosphatase) 
mniejsza aktywność niż BAP, ale łatwiejsza do usunięcia (ogrzewanie 65 C  30
min lub 75 C  10 min) w obecności 10 mM EDTA.
Alkaliczna fosfataza z arktycznych krewetek (SAP  shrimp alkaline
phosphatase)  aktywność podobna do CIAP, ale inaktywacja 65 C  15 min
(zalecane 70 C  20 min).
Zastosowanie fosfatazy alkalicznej w inżynierii genetycznej:
" defosforylacja tj. usuwanie 5 fosforanów z wektorów trawionych
enzymami restrykcyjnymi
" jeżeli DNA wektora zostało strawione jednym enzymem restrykcyjnym
defosforylacja zapobiega jego zamykaniu się (autoligacji) wektora bez
wstawki
" traktowanie DNA fosfatazą zmniejsza niestety wydajność klonowania
Polimerazy DNA
Polimerazy są enzymami, których główną funkcją jest
kataliza tworzenia polimerów kwasów nukleinowych RNA i
DNA na matrycy istniejących jednoniciowych DNA lub
RNA. Proces ten to polimeryzacja.
Polimeraza I  polimeraza Kornberga
(m.cz. 109 kD)
Odkryta w 1958 r. Kodowana przez gen polA.
Funkcja in vivo: enzym naprawczy
Struktura krystaliczna Taq
DNA polimerazy
Średnia szybkość polimeryzacji 20 nukleotydów/sec,
niska procesywność  20-50 nukleotydów, 400 cząstek
na komórkę.
1. Aktywność: 5 3 polimeryzacja DNA
Substrat: jednoniciowe DNA i starter z wolną grupą 3 OH.
Reakcja: DNAOH DNA- (pdN)n +PP
Wymagania: Mg+2 dATP, dTTP, dGTP, dCTP
2. Aktywność: 3 5 egzonukleolityczna-sprawdzająca
Substrat: dsDNA lub ssDNA z wolnym 3 OH końcem. Degraduje DNA od 3 OH.
Ta aktywność na dsDNA jest blokowana przez aktywność polimeryzacyjną 5 
3 .
Reakcja: dsDNA lub ssDNA 5 pdNOH
Wymagania: Mg+2
3. Aktywność: 5 3 egzonukleolityczna
Substrat: dsDNA lub RNA-DNA hybrydy. Degraduje dsDNA od 5 końca;
degraduje RNA w hybrydzie z DNA - aktywność RNAzy H
Wymagania: Mg+2
 Zasosowanie polimerazy I (holoenzymu)
1. Znakowanie DNA przez przesunięcie przerwy (nick-translation).
Tylko ta polimeraza może przeprowadzać tę reakcję ze względu na
aktywność egzonukleazy 5  3
Fragment Klenowa DNA polimerazy I
polimeraza I pozbawiona N-końcowej domeny stanowi tzw. fragment Klenowa.
Polimeraza 3  5 egzo- 5  3 egzo
(46 kD) nukleaza (22 KD) nukleaza
C N
Fragment Klenowa (605 aa)
Zastosowanie polimerazy Klenowa:
1. Synteza dsDNA na matrycy ssDNA:
Warunki reakcji: matryca ssDNA, startery - oligonukleotydy 6-20 n
komplementarne do określonego fragmentu DNA z wolną grupą OH,
bufor, dNTPs,
Reakcja może z powodzeniem służyć do znakowania sond molekularnych, jeśli
do buforu reakcyjnego doda się nukleotydów radioaktywnych lub
znakowanych innymi markerami.
2. Wypełnianie cofniętych 3 - końców we fragmentach DNA (fill-in reaction):
Stosuje się w celu tworzenia  tępych końców we fragmentach powstałych po
trawieniu enzymami restrykcyjnymi tworzącymi 5 -wystające końce.
3
Reakcja może z powodzeniem służyć do znakowania sond molekularnych, jeśli
do buforu reakcyjnego doda się nukleotydów radioaktywnych lub
znakowanych innymi markerami.
3. Wytrawianie wystających 3  końców:
Stosuje się również w celu tworzenia  tępych końców we fragmentach
powstałych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi tworzącymi 3 -wystające
końce.
Aktywność egzonukleazowa 3 5 polimerazy Klenowa wytrawia wystające
nadmierności.
DNA polimeraza bakteriofaga T7
" zawiera dwie podjednostki, o aktywnościach takich samych jak
polimeraza Klenowa.
" Szczególnie użyteczna ponieważ charakteryzuje się znacznie większą
procesywnością i wysoką wiernością (~1000 x większą niż polimeraza
Klenowa).
" Używana jest do sekwencjonowania DNA metodą Sangera, także pod nazwą
Sequenase lub Sequenase 2.0 (bez aktywności 3 5 egzonukleolitycznej w
wyniku delecji 28 aa w N-końcu enzymu)
Termostabilne DNA polimerazy
DNA-zależna polimeraza DNA
- mają podobne aktywności jak polimeraza I, ale maksymalną aktywność
katalityczną wykazują w 75  80 C (Taq polimeraza ma tylko 10% maks.
aktywności w 37 C).
-szybkość reakcji w optymalnej temp. 150 dNTP/sec/cząsteczkę enzymu.
____________________________________________________________________________
Polimeraza 3  5 egzo- Żródło i własności
nukleaza
____________________________________________________________________________
Taq nie Termus aquaticus. Okres półtrwania 95 C - 1.6 h;
wierność 1x10 -4 - 2x10  5; procesywność: 42 n
Pfu tak Pyrococcus furiosus. Największa wierność: 1.5x10-6
Vent tak Thermococcus litoralis. Okres półtrwania 95 C - 7 h;
wierność pośrednia
_____________________________________________________________________________
Zastosowanie termostabilnych polimeraz:
A
ańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) w różnych odmianach.
Odwrotna transkryptaza 
RNA-zależna polimeraza DNA
Obecna w retrowirusach, gdzie kopiuje wirusowe RNA przed integracją do
genomu.
Ma dwie aktywności:
-RNA zależnej DNA polimerazy  w warunkach laboratoryjnych syntetyzuje
DNA na matrycy ssRNA i ssDNA z jednakową wydajnością. W obu
przypadkach wymaga startera RNA lub DNA.
Nie ma aktywności 3 5 egzonukleazy (1/500 n jest błędny).
- Rnazy H - jest rybonukleazą, która degraduje RNA z RNA-DNA hybrydów.
Funkcjonuje zarówno jako endo- i egzonukleaza.
Najczęściej wykorzystuje się dwa różne enzymy
" z wirusa mysiej białaczki Moloneya
ż�z wirusa ptasiej mieloblastozy.
uzyskiwane albo przez oczyszczanie z wirusa, albo jako białka rekombinowane w
E. coli.
Zastosowanie odwrotnej transkryptazy:
1. Kopiowanie RNA na DNA np. podczas klonowania eukariotycznych genów, w
kiedy używa się mRNA jako matrycy w syntezie cDNA.
Funkcję starterów pełnią wówczas krótkie 12-18 n polimery (oligo dT),
komplementarne z ogonkami poliA mRNA.
starter
odwrotna
transkryptaza
2. Tworzenie kopii DNA z RNA przed amplifikacją PCR, w reakcji zwanej RT-PCR.
Reakcja ta jest stosowana w klonowaniu cDNA czy diagnostyce chorób  głównie
zakaz
nych (wirusowych). W tym wypadku stosuje się albo startery o
przypadkowej sekwencji, albo jeśli sekwencja jest znana, startery o określonej
sekwencji.
Terminalna transferaza
" Katalizuje dodawanie nukleotydów dNTP do 3 OH końca DNA.
" Działa na ssDNA, dsDNA z wystającymi końcami (preferuje wystający koniec 3 ) i mniej
efektywnie z tępymi końcami.
" Terminalna transferaza jest ludzkim enzymem, syntetyzowanym w limfocytach. W
laboratoriach używa się enzymu izolowanego z bakterii E. coli transformowanych
genem wołu
" Jest to jedyna polimeraza, która nie wymaga startera i matrycy.
" W odpowiednich warunkach terminalna transferaza może dodać wiele tysięcy dNTP lub
tylko jeden nukleotyd jeśli jest odpowiednio zmodyfikowany np. ddNTP
Zastosowanie:
1. Znakowanie 3 końców DNA: substratem w tej reakcji są fragmenty uzyskane po
trawieniu enzymami restrykcyjnymi zostawiającymi 3 końce lub oligonukleotydy. Jeśli
taki DNA jest inkubowany w obecności znakowanych nukleotydów i terminalnej
transferazy do jego końca 3 zostanie dodany szereg nukleotydów obecnych w
mieszaninie reakcyjnej a DNA zostanie wyznakowany.
3
3
2. Dodawanie komplementarnych homopolimerowych ogonków do DNA:
Stosowany np. do klonowania cDNA do plazmidów.
Terminalna transferaza pozwala na tworzenie homopolimerowych ogonków
komplementarnych do siebie w liniowych fragmentach DNA.
Kinaza polinukleotydowa (PNK)
" PNK jest enzymem, który katalizuje przeniesienie g�- fosforanu z ATP na 5 koniec DNA lub
RNA.
" Najczęściej stosuje się rekombinowany enzym faga T4 nadprodukowany w E. coli.
Zwykle są stosowane dwa typy reakcji : forward - w której g�- fosforan z ATP jest
przenoszony na 5 koniec defosforylowanego DNA.
W reakcji wymiany  exchange, w obecności nadmiaru ADP, PNK przenosi terminalny
fosforan z ufosforylowanego DNA na ADP i ponownie przenosi radioaktywny g�- fosforan z [g�-
32
P] ATP. Reakcja typu wymiany jest mniej wydajna.
Zastosowanie:
głównie znakowanie np. radioaktywne cząsteczek DNA używanych jako sond w
hybrydyzacji oraz fosforylacja (dodawanie 5 -fosforanów) do wszelkich cząsteczek, które
ich nie posiadają np. linkerów, adapterów, starterów
Nukleazy (inne niż ER)
DNazy i RNazy
Dzielą się na endo- i egzonukleazy.
Ich specyficzność substratowa zależy wyłącznie od stężenia enzymu
im większe stężenie tym niższa specyficzność.
Dnazy
1. DNaza I - endonukleaza, tnie dsDNA i ssDNA preferencyjnie w sąsiedztwie C lub T
tworząc 5 -fosforylowane di-, tri-, i tetranukleotydy. Nie trawi RNA
Zastosowanie:
1. Usuwanie DNA z preparatów RNA;
2. Analiza interakcji DNA-białko (tzw. footprinting);
3. Nadtrawianie DNA w reakcji przesunięcia przerwy
RNazy
1. Rybonukleaza A  endorybonukleaza, trawi ssRNA w 3 końcu reszty pirymidynowej
Degraduje RNA do 3 ufosforylowanych mono- i oligonukleotydów
Zastosowanie rybonukleaz:
1. Usuwanie kontaminacji RNA w preparatach plazmidowego DNA