" Ligazy
Katalizują tworzenie wiązań fosfodiestrowych między sąsiednimi grupami
3 OH i 5 PO4 w kwasach nukleinowych  DNA lub RNA.
W reakcji tworzą się wysokoenergetyczne pośredniki z udziałem NAD+ lub
ATP w zależności od typu ligazy.
Funkcja in vivo: udział w replikacji opóz
nionego pasma DNA,
rekombinacja genetyczna, naprawa DNA
Zastosowanie ligazy w inżynierii
genetycznej:
Rekombinacja DNA in vitro  łączenie
cząsteczek kwasów nukleinowych
lepkich lub tępych końców oraz szereg
innych bardzo specyficznych
zastosowań.
Własności ligaz używanych w rekombinacji in vitro
Ligazy Substraty kofaktory temperatura
lepkie tępe końce DNA-RNA RNA-RNA
_______________________________________________________________________________________
E.coli tak tak* nie nie NAD+ Mg2+ (1-3 mM) 10-15 C
T4 faga tak tak* tak* tak* ATP Mg2+ (10 mM) 4 C
15-25 C
Bakterii
termofilnych tak nie nie nie NAD+ Mg2+ (10 mM) 24-37 C
Ligacja tępych końców jest znacznie mniej efektywna
Bakteryjna ligaza jest zależna od NAD+
Fagowe i eukariotyczne ligazy są zależne od ATP
Fosfataza alkaliczna
Usuwa 5 -fosforan z ssDNA, dsDNA i RNA, rNTP i dNTP. Metaloenzym (Zn II)
Bakteryjna fosfataza alkaliczna (BAP) najbardziej efektywna, ale jest oporna na
ogrzewanie i detergenty. Z tego powodu trudno zakończyć reakcję
defosforylacji. Peryplazmatyczny enzym, działa w buforze Tris pH 8.0-9.0 w
obecności niskich stężeń Zn+2 (poniżej 1 mM).
Alkaliczna fosfataza cielęca (CIAP  calf intestinal alkaline phosphatase) 
mniejsza aktywność niż BAP, ale łatwiejsza do usunięcia (ogrzewanie 65 C  30
min lub 75 C  10 min) w obecności 10 mM EDTA.
Alkaliczna fosfataza z arktycznych krewetek (SAP  shrimp alkaline
phosphatase)  aktywność podobna do CIAP, ale inaktywacja 65 C  15 min
(zalecane 70 C  20 min).
Zastosowanie fosfatazy alkalicznej w inżynierii genetycznej:
" defosforylacja tj. usuwanie 5 fosforanów z wektorów trawionych
enzymami restrykcyjnymi
" jeżeli DNA wektora zostało strawione jednym enzymem restrykcyjnym
defosforylacja zapobiega jego zamykaniu się (autoligacji) wektora bez
wstawki
" traktowanie DNA fosfatazą zmniejsza niestety wydajność klonowania
Polimerazy DNA
Polimerazy są enzymami, których główną funkcją jest
kataliza tworzenia polimerów kwasów nukleinowych RNA i
DNA na matrycy istniejących jednoniciowych DNA lub
RNA. Proces ten to polimeryzacja.
Polimeraza I  polimeraza Kornberga
(m. cz. 109 kD)
Odkryta w 1958 r. Kodowana przez gen polA.
Funkcja in vivo: enzym naprawczy
Struktura krystaliczna Taq
DNA polimerazy
Średnia szybkość polimeryzacji 20 nukleotydów/sec,
niska procesywność  20-50 nukleotydów, 400 cząstek
na komórkę.
1. Aktywność: 5 3 polimeryzacja DNA
Substrat: jednoniciowe DNA i starter z wolną grupą 3 OH.
Reakcja: DNAOH DNA- (pdN)n +PP
Wymagania: Mg+2 dATP, dTTP, dGTP, dCTP
2. Aktywność: 3 5 egzonukleolityczna-sprawdzająca
Substrat: dsDNA lub ssDNA z wolnym 3 OH końcem. Degraduje DNA od 3 OH.
Ta aktywność na dsDNA jest blokowana przez aktywność polimeryzacyjną 5  3 .
Reakcja: dsDNA lub ssDNA 5 pdNOH
Wymagania: Mg+2
3. Aktywność: 5 3 egzonukleolityczna
Substrat: dsDNA lub RNA-DNA hybrydy. Degraduje dsDNA od 5 końca;
degraduje RNA w hybrydzie z DNA - aktywność RNAzy H
Wymagania: Mg+2
 Zasosowanie polimerazy I (holoenzymu)
1. Znakowanie DNA przez przesunięcie przerwy (nick-translation).
Tylko ta polimeraza może przeprowadzać tę reakcję ze względu na
aktywność egzonukleazy 5  3
Fragment Klenowa DNA polimerazy I
polimeraza I pozbawiona N-końcowej domeny stanowi tzw. fragment Klenowa.
Polimeraza 3  5 egzo- 5  3 egzo
(46 kD) nukleaza (22 KD) nukleaza
C N
Fragment Klenowa (605 aa)
Zastosowanie polimerazy Klenowa:
1. Synteza dsDNA na matrycy ssDNA:
Warunki reakcji: matryca ssDNA, startery - oligonukleotydy 6-20 n
komplementarne do określonego fragmentu DNA z wolną grupą OH,
bufor, dNTPs,
Reakcja może z powodzeniem służyć do znakowania sond molekularnych, jeśli
do buforu reakcyjnego doda się nukleotydów radioaktywnych lub
znakowanych innymi markerami.
2. Wypełnianie cofniętych 3 - końców we fragmentach DNA (fill-in reaction):
Stosuje się w celu tworzenia  tępych końców we fragmentach powstałych po
trawieniu enzymami restrykcyjnymi tworzącymi 5 -wystające końce.
3
Reakcja może z powodzeniem służyć do znakowania sond molekularnych, jeśli
do buforu reakcyjnego doda się nukleotydów radioaktywnych lub
znakowanych innymi markerami.
3. Wytrawianie wystających 3  końców:
Stosuje się również w celu tworzenia  tępych końców we fragmentach
powstałych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi tworzącymi 3 -wystające
końce.
Aktywność egzonukleazowa 3 5 polimerazy Klenowa wytrawia wystające
nadmierności.
Tę reakcję można także przeprowadzać z użyciem T4 DNA polimerazy, która ma
znacznie mocniejszą aktywność egzonukleazową (~200 x większą niż Klenow).
DNA polimeraza bakteriofaga T7
" zawiera dwie podjednostki, o aktywnościach takich samych jak
polimeraza Klenowa.
" Szczególnie użyteczna ponieważ charakteryzuje się znacznie większą
procesywnością i wysoką wiernością (~1000 x większą niż polimeraza
Klenowa).
" Używana jest do sekwencjonowania DNA metodą Sangera, także pod nazwą
Sequenase lub Sequenase 2.0 (bez aktywności 3 5 egzonukleolitycznej)
Termostabilne DNA polimerazy
DNA-zależna polimeraza DNA
- mają podobne aktywności jak polimeraza I, ale maksymalną aktywność
katalityczną wykazują w 75  80 C (Taq polimeraza ma tylko 10% maks.
aktywności w 37 C).
-szybkość reakcji w optymalnej temp. 150 dNTP/sec/cząsteczkę enzymu.
____________________________________________________________________________
Polimeraza 3  5 egzo- Żródło i własności
nukleaza
____________________________________________________________________________
Taq nie Termus aquaticus. Okres półtrwania 95 C - 1.6 h;
wierność 1x10 -4 - 2x10  5; procesywność: 42 n
Pfu tak Pyrococcus furiosus. Największa wierność: 1.5x10-6
Vent tak Thermococcus litoralis. Okres półtrwania 95 C - 7 h;
wierność pośrednia
_____________________________________________________________________________
Zastosowanie polimeraz: A
ańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) w różnych
odmianach.
Odwrotna transkryptaza 
RNA-zależna polimeraza DNA
Obecna w retrowirusach, gdzie kopiuje wirusowe RNA przed integracją do
genomu.
Ma dwie aktywności:
-RNA zależnej DNA polimerazy  w warunkach laboratoryjnych syntetyzuje
DNA na matrycy ssRNA i ssDNA z jednakową wydajnością. W obu
przypadkach wymaga startera RNA lub DNA.
Nie ma aktywności 3 5 egzonukleazy (1/500 n jest błędny).
- Rnazy H - jest rybonukleazą, która degraduje RNA z RNA-DNA hybrydów.
Funkcjonuje zarówno jako endo- i egzonukleaza.
Najczęściej wykorzystuje się dwa różne enzymy
" z wirusa mysiej białaczki Moloneya
ż�z wirusa ptasiej mieloblastozy.
uzyskiwane albo przez oczyszczanie z wirusa, albo jako białka rekombinowane w
E. coli.
Zastosowanie odwrotnej transkryptazy:
1. Kopiowanie RNA na DNA np. podczas klonowania eukariotycznych genów, w
kiedy używa się mRNA jako matrycy w syntezie cDNA.
Funkcję starterów pełnią wówczas krótkie 12-18 n polimery (oligo dT),
komplementarne z ogonkami poliA mRNA.
starter
odwrotna
transkryptaza
2. Tworzenie kopii DNA z RNA przed amplifikacją PCR, w reakcji zwanej RT-PCR.
Reakcja ta jest stosowana w klonowaniu cDNA czy diagnostyce chorób  głównie
zakaz
nych (wirusowych). W tym wypadku stosuje się albo startery o
przypadkowej sekwencji, albo jeśli sekwencja jest znana, startery o określonej
sekwencji.
Bakteriofagowe polimerazy RNA
Są to RNA polimerazy zależne od DNA. Są używane do transkrypcji in vitro w
celu tworzenia określonych RNA komplementarnych do jednego z pasm
DNA znajdującego się bezpośrednio poniżej promotora.
Komercyjnie dostępne są RNA polimerazy:
T7 (fag E. coli) rozpoznaje promotor TAATACGACTCACTATAGGG
T3 (fag E. coli) rozpoznaje promotor AATTAACCCTCACTAAAGGG
SP6 (fag Salmonella typhimurium) rozpoznaje promotor
AATTTAGGTGACACTATAGAA
Wiele wektorów przeznaczonych do klonowania DNA ma wbudowane promotory
dla różnych polimeraz RNA w sąsiedztwie miejsca wielokrotnego klonowania
(MCS). To pozwala na syntezę mRNA w sensownej i antysensownej orientacji ze
sklonowanej wstawki (insertu).
Zastosowanie RNA polimeraz bakteriofagowych:
1. Głównie są używane w transkrypcji in vitro, w której rybonukleotydy są
znakowane radioaktywnie lub innymi markerami dla uzyskania sond RNA
do hybrydyzacji
Znakowane RNA wykorzystywane jest także w badaniach nad strukturą i funkcją
tego typu cząsteczek.
Promotor fagowej
BamHI
polimerazy RNA
Cięcie BamHI
RNA polimeraza i
NTP
2. System transkrypcji faga T7 jest używany do ekspresji sklonowanych genów
w bakteriach.
Do bakterii z wbudowanym do chromosomu genem dla T7 polimerazy RNA (pod
indukcyjnym promotorem lac) wprowadza się badany gen (sklonowany na
wektorze plazmidowym) pod promotorem faga T7. Indukcja systemu
następuje po dodaniu IPTG
Terminalna transferaza
" Katalizuje dodawanie nukleotydów dNTP do 3 OH końca DNA.
" Działa na ssDNA, dsDNA z wystającymi końcami (preferuje wystający koniec 3 ) i mniej
efektywnie z tępymi końcami.
" Terminalna transferaza jest ludzkim enzymem, syntetyzowanym w limfocytach. W
laboratoriach używa się enzymu izolowanego z bakterii E. coli transformowanych
genem wołu
" Jest to jedyna polimeraza, która nie wymaga startera i matrycy.
" Niezbędny jest kobalt jako kofaktor w reakcji dodawania pirymidyn lub Mg+2 w
dodawaniu puryn. W odpowiednich warunkach terminalna transferaza może dodać wiele
tysięcy dNTP lub tylko jeden nukleotyd jeśli jest odpowiednio zmodyfikowany np. ddNTP
Zastosowanie:
1. Znakowanie 3 końców DNA: substratem w tej reakcji są fragmenty uzyskane po
trawieniu enzymami restrykcyjnymi zostawiającymi 3 końce lub oligonukleotydy. Jeśli
taki DNA jest inkubowany w obecności znakowanych nukleotydów i terminalnej
transferazy do jego końca 3 zostanie dodany szereg nukleotydów obecnych w
mieszaninie reakcyjnej a DNA zostanie wyznakowany.
3
3
2. Dodawanie homopolimerowych ogonków do DNA:
Stosowany np. do klonowania cDNA do plazmidów.
Terminalna transferaza pozwala na tworzenie homopolimerowych ogonków
komplementarnych do siebie w liniowych fragmentach DNA.
Kinaza polinukleotydowa (PNK)
" PNK jest enzymem, który katalizuje przeniesienie g�- fosforanu z ATP na 5 koniec DNA lub
RNA.
" Najczęściej stosuje się rekombinowany enzym faga T4 nadprodukowany w E. coli.
Zwykle są stosowane dwa typy reakcji : forward - w której g�- fosforan z ATP jest
przenoszony na 5 koniec defosforylowanego DNA.
W reakcji wymiany  exchange, w obecności nadmiaru ADP, PNK przenosi terminalny
fosforan z ufosforylowanego DNA na ADP i ponownie przenosi radioaktywny g�- fosforan z [g�-
32
P] ATP. Reakcja typu wymiany jest mniej wydajna.
Zastosowanie:
głównie znakowanie np. radioaktywne cząsteczek DNA używanych jako sond w
hybrydyzacji oraz fosforylacja (dodawanie 5 -fosforanów) do wszelkich cząsteczek, które
ich nie posiadają np. linkerów, adapterów, starterów
Nukleazy (inne niż ER)
DNazy i RNazy
Dzielą się na endo- i egzonukleazy.
Ich specyficzność substratowa zależy wyłącznie od stężenia enzymu
im większe stężenie tym niższa specyficzność.
Dnazy
1. DNaza I - endonukleaza, tnie dsDNA i ssDNA preferencyjnie w sąsiedztwie C lub T
tworząc 5 -fosforylowane di-, tri-, i tetranukleotydy. Nie trawi RNA
Zastosowanie:
1. Usuwanie DNA z preparatów RNA;
2. Analiza interakcji DNA-białko (tzw. footprinting);
3. Nadtrawianie DNA w reakcji przesunięcia przerwy
2. Egzonukleaza III (E. coli)
- usuwa nukleotydy z 3 końca dsDNA
- najlepiej działa na DNA z tępymi końcami i 5 wystającymi. Nie działa na ssDNA.
- używana w tworzeniu określonych delecji liniowych fragmentów DNA.
3. Nukleaza Mung Bean endonukleaza specyficzna dla ssDNA które trawi do do 5 -
fosforylowanych mono- i oligonukleotydów.
Zastosowanie: usuwanie jednoniciowych końcówek i konwersja na tępe końce
4. Nukleaza BAL 31  egzonukleaza, która trawi 3 -końce ssDNA i dsDNA zarówno
tępych jak i lepkich.
Działa też jak endonukleaza na ssDNA. Kombinacja tych dwóch aktywności umożliwia
progresywne skracanie DNA z obu końców- np. do usuwania zbędnych fragmentów
przed klonowaniem.
Nukleaza S1 (Aspergillus) - W niskich stężeniach trawi ssDNA lub RNA; w wyższych
stężeniach trawi dsDNA i dsRNA oraz DNA:RNA.
RNazy
1. Rybonukleaza A  endorybonukleaza, trawi ssRNA w 3 końcu reszty pirymidynowej
Degraduje RNA do 3 ufosforylowanych mono- i oligonukleotydów
Zastosowanie rybonukleaz:
1. Usuwanie kontaminacji RNA w preparatach plazmidowego DNA
2. Mapowanie mutacji w DNA lub RNA przez cięcie niedopasowanych nukleotydów
(mismatch cleavage).