IMMOBILIZACJA

ENZYMÓW I KOMÓREK

dr inż. Aneta Białkowska

Biokatalizatory unieruchomione

Immobilizacja – przeprowadzenie biokatalizatora ze

stanu rozpuszczalnego w nierozpuszczalny

Immobilizacja – proces umożliwiający wielokrotne

wykorzystanie biokatalizatora

dr inż. Aneta Białkowska

Typy biokatalizatorów unieruchomionych

Preparaty pojedynczych enzymów

Kompleksy dwóch lub większej ilości enzymów

Całe komórki bez zachowania ich funkcji życiowych

śywe komórki z zachowaniem ich aktywności

metabolicznej i zdolności do rozmnażania

Struktury subkomórkowe

dr inż. Aneta Białkowska

Zalety wykorzystywania biokatalizatorów

unieruchomionych

Możliwość

łatwego

oddzielenia

biokatalizatora od mieszaniny reakcyjnej

• możliwość wielokrotnego stosowania
• możliwość

uzyskania

produktu

w

czystej

formie,

pozbawionej biokatalizatora

Możliwość pracy w systemie ciągłym

Zwiększenie stabilności enzymów

Zwiększenie

odporności

na

działanie

chemicznych odczynników denaturujących

Możliwość

stosowania

enzymów

w

środowisku rozpuszczalników organicznych

dr inż. Aneta Białkowska

Ograniczenia w wykorzystywaniu

biokatalizatorów unieruchomionych

Proces immobilizacji podnosi koszty otrzymywania

preparatów enzymatycznych o cenę

nośnika i

innych reagentów oraz koszty samego procesu
immobilizacji,

Immobilizacja

może

powodować

częściową

inaktywację

enzymów

lub

zmianę

ich

specyficzności,

Enzym immobilizowany na nośnikach stałych jest

fizycznie ograniczony od fazy ciekłej, zatem jego
dostęp do substratu może być również ograniczony

dr inż. Aneta Białkowska

Przemysłowe zastosowanie

immobilizowanych enzymów

Produkcja kwasu 6-

aminopenicylanowego

Amidaza penicylinowa

Produkcja L-DOPA

β-tyrozynaza

Produkcja akrylamidu

Nitrylaza

Produkcja cukru

inwertowanego

Inwertaza

Produkcja aspartamu

Termolizyna

Produkcja tłuszczów jadalnych

Lipaza

Przetwórstwo skrobi

Glukoamylaza

Przetwórstwo skrobi

Izomeraza glukozowa

Zastosowanie

Enzym

dr inż. Aneta Białkowska

1. stosując immobilizowane komórki otrzymuje się

biokatalizatory o znacznie niższej aktywności
enzymatycznej. Przykładem może być amidaza
penicylinowa, której aktywność wynosi 400
u/g, gdy jest oczyszczona i bezpośrednio
związana z nośnikiem, natomiast aktywność
immobilizowanych komórek E. coli
zawierających ten enzym wynosi tylko 0,12
u/g,

2. występują ograniczenia przenoszenia masy z

powodu dużej gęstości komórek
unieruchomionych na nośnikach,

3. stosowane do immobilizacji odczynniki mogą

zabijać komórki lub unieczynniać enzymy (np.
katalizatory i inicjatory polimeryzacji,
odczynniki sieciujące)

4. mogą być katalizowane różne reakcje uboczne

poprzez inne enzymy zawarte w komórce. Może
to zmniejszyć wydajność procesu i
zanieczyszczać produkty końcowe,

5. niekontrolowany wzrost komórek

immobilizowanych może być również
problemem. Świeże komórki mogą bowiem
odrywać się od powierzchni nośnika i
zanieczyszczać produkty oraz wykorzystywać
substrat jako źródło do wzrostu

1. eliminacja pracochłonnych i kosztownych
procesów związanych z izolacją oraz oczyszczaniem
enzymów,

2. zachowanie wyższej reaktywności i stabilności
biokatalizatora, gdyż enzymy znajdują się w swoim
naturalnym środowisku (żywe komórki). Wynikiem
tego jest zwiększenie ich stabilności termicznej,
zmniejszenie wrażliwości na termiczne zmiany pH i
wpływ niektórych czynników chemicznych,

3. możliwość prowadzenia procesów bardziej
złożonych, np. wymagających regeneracji kofaktorów
(NAD, ATP),

4. łatwiejsze prowadzenie reakcji
wieloenzymatycznych,

5. immobilizacja zwiększa odporność na ataki obcej
mikroflory i fagów, choć dłuższe stosowanie niesie ze
sobą ryzyko zakażeń

WADY

ZALETY

ZASTOSOWANIE CAŁYCH KOMÓREK JAKO

BIOKATALIZATORÓW

dr inż. Aneta Białkowska

Metody unieruchamiania biokatalizatorów

A – adsorpcja, B – wiązanie kowalencyjne, C, D, E – pułapkowanie,
F – kapsułkowanie, G – zamykanie pomiędzy membranami, H –
sieciowanie, I – naturalna flokulacja biomasy

dr inż. Aneta Białkowska

METODY UNIERUCHAMIANIA ENZYMÓW I KOMÓREK

A – UNIERUCHAMIANIE NA POWIERZCHNI NO

Ś

NIKA

B – UNIERUCHAMIANIE WEWN

Ą

TRZ NO

Ś

NIKA

dr inż. Aneta Białkowska

Wiązanie na powierzchni nośnika:

adsorpcja fizyczna

Jest to metoda najprostsza i najtańsza, ale nie zapewniająca trwałego związania

enzymu z matrycą, gdyż zmiana siły jonowej lub pH środowiska reakcji może
powodować desorpcję białka enzymatycznego.

Stosowane są nośniki organiczne i nieorganiczne.
Do organicznych zaliczamy: pochodne celulozy, polimery, żywice jonowymienne,

chityny, kolagen i inne.

Do nieorganicznych zaliczamy: materiały ceramiczne, szkło porowate, wymieniacze

jonowe, tlenki metali, węgiel, ferromagnetyki.

dr inż. Aneta Białkowska

Podstawowe sposoby unieruchamiania

biokatalizatorów

Wiązanie na powierzchni nośnika

wiązanie kowalencyjne (bezpośrednie przyłączenie biokatalizatora do
nośnika bądź pośrednie przyłączenie za pomocą czynnika
sprzęgającego).

Cząsteczka białka enzymatycznego wiązana jest z nośnikiem poprzez wolne grupy karboksylowe – COO (Asp, Glu,

C-terminalne), fenolową (Tyr), sulfhydrylową (Cys), aminowe (Lys), imidazolową (His), grupy hydroksylowe (Thr,
Ser) oraz reszty glikozydowe w glikoproteinach i inne. Sposób związania enzymu z nośnikiem zależy od typu
przeprowadzonej reakcji chemicznej (najczęściej są to wiązania peptydowe, estrowe, diazoniowe, itp.).

Najczęściej stosowane nośniki to agar, agaroza, chityna, celuloza, kolagen, polimery organiczne (poliuretany,

polistyren, nylon), substancje nieorganiczne (szkło porowate, tlenek glinu, silikażel, magnetyt, tlenek niklu, itp.).

Podstawowe sposoby unieruchamiania

biokatalizatorów

dr inż. Aneta Białkowska

Odczynniki wiążące stosowane w metodach

immobilizacji

Związki dwufunkcyjne wchodzące w skład układu

enzym-nośnik:

• aldehyd glutarowy

• diaminy

• kwasy dikarboksylowe

Związki aktywujące grupy funkcyjne, ale nie

wchodzące w skład układu enzym-nośnik:

• karbodiimid

• epichlorohydryna (1-chloro-2,3-epoksypropan)

• chlorek tosylu (chlorek p-toluenosulfonowy)

dr inż. Aneta Białkowska

Immobilizacja enzymów z

zastosowaniem aldehydu glutarowego

dr inż. Aneta Białkowska

Immobilizacja enzymów z zastosowaniem

karbodiimidu (EDC)

EDC – N-[3-dietyloaminopropylo]-N-etylokarbodiimid

dr inż. Aneta Białkowska

Wiązanie wewnątrz nośnika:

wiązanie w matrycy nośnika (tzw. pułapkowanie)

Metoda polega na zmieszaniu biokatalizatora z monomerem lub rozpuszczalnym
polimerem i przeprowadzeniu procesu polimeryzacji lub usieciowania

w celu

utwardzenia żelu (w formie kulek, bloków, włókien). W tym wypadku cząsteczki
enzymów (lub komórki drobnoustrojów) zamykane są wewnątrz nośnika w sposób
mechaniczny i nie ma zagrożenia utraty ich aktywności enzymatycznej, co może
zachodzić przy tworzeniu wiązań chemicznych. Istotnym problemem jest natomiast
uzyskanie żelu o odpowiedniej porowatości, zapewniającej zatrzymanie biokatalizatora
wewnątrz i jednoczesne zabezpieczenie właściwej dyfuzji substratów i produktów.

Sposoby pułapkowania:

żelowanie, np. agar lub żelatyna;

kriożele, np. żele alkoholu poliwinylowego zestalające się w -20

°

C;

precypitacja polimerów w rozpuszczalnikach organicznych np. octan celulozy
rozpuszczający się w chlorku metylenu; dla immobilizacji komórek stosuje się tlenki
nieorganiczne (tlenek tytanu), silikażele;

polimeryzacja, polegająca na zatrzymaniu biokatalizatora w trakcie tworzenia żelu
poliakrylamidowego (monomer – akryloamid jest substancję bardzo toksyczną dla
komórek więc stosuje się czasem substancje osłonowe);

polikondensacja, zasada tej metody jest analogiczna do polimeryzacji z tą różnicą, że
wykorzystuje się oligomery.

Podstawowe sposoby unieruchamiania

biokatalizatorów

dr inż. Aneta Białkowska

II. Wiązanie wewnątrz nośnika:

wiązanie w matrycy nośnika (zamykanie wewnątrz
półprzepuszczalnych membran)

Materiał biologiczny jest zamykany w mikrokapsułkach (np. liposomy,
kapsułki nylonowe, polimocznikowe, pochodne celulozowe) lub
pomiędzy półprzepuszczalnymi membranami, przez które mogą
dyfundować substraty i metabolity.
Na membrany i do kapsułkowania używa się takich materiałów, jak
silikon, nylon, polioctan, celuloza i poliwęglany. Techniki zamykania
komórek są dość proste i tanie do przeprowadzenia, jednak mogą mieć
zastosowanie wyłącznie do przemian substratów małocząsteczkowych

Podstawowe sposoby unieruchamiania

biokatalizatorów

dr inż. Aneta Białkowska

Metody unieruchamiania enzymów

(inny podział)

Metody

immobilizacji

enzymów

Fizyczne

Chemiczne

Adsorpcja na

nierozpuszczalnej

matrycy

Pułapkowanie

wewnątrz
struktury

polimeru

Zamknięcie

wewnątrz

określonej

przestrzeni

Kowalencyjne

wiązanie z

nierozpuszczalną

matrycą

Sieciowanie

dr inż. Aneta Białkowska

Charakterystyka metod unieruchamiania

enzymów

Fizyczne metody immobilizacji

(pomiędzy enzymem a złożem tworzą się wiązania jonowe, wodorowe,
obecne są również oddziaływania hydrofobowe i /lub siły van der
Waalsa)

Zachowanie struktury enzymu

Łatwość przeprowadzenia procesu immobilizacji

Niski koszt procesu immobilizacji

Wymywanie enzymu ze złoża (metoda adsorpcji)

Konieczność

stosowania

niskocząsteczkowych

substratów

(zamykanie

pomiędzy

membranami

półprzepuszczalnymi)

dr inż. Aneta Białkowska

Chemiczne metody immobilizacji

(polegają na

tworzeniu wiązań kowalencyjnych łączących biokatalizator z
nierozpuszczalną matrycą, sieciowaniu enzymu z zastosowaniem
wielofunkcyjnych odczynników lub wiązaniu biokatalizatora z innymi
cząsteczkami (np. innym białkiem lub rozpuszczalnym syntetycznym
polimerem), poprzez tworzenie wiązań sieciujących, co umożliwia
wydzielenie go z mieszaniny reakcyjnej przy użyciu techniki ultrafiltracji)

Stabilność układu enzym-matryca

Możliwa zmiana struktury enzymu i częściowa utrata

aktywności

Skomplikowana procedura immobilizacji

Wysoki koszt procesu immobilizacji

,

wymagający

użycia

dodatkowych

związków

sieciujących lub

aktywujących grupy funkcyjne złoża lub/i enzymu

Charakterystyka metod unieruchamiania

enzymów

dr inż. Aneta Białkowska

duża trwałość chemiczna i biologiczna, która pozwoli na długotrwałe wykorzystanie
immobilizowanego biokatalizatora;

wysoka odporność mechaniczna, niezbędna w środowiskach, w których obecny jest,
np. piasek, silnie niszczący materiał lub też zachodzi intensywne mieszanie
(oczyszczalnie ścieków);

duża powierzchnia czynna, pojemność i porowatość. Parametry te pozwalają na
efektywniejsze wykorzystanie preparatu ze względu na zwiększony kontakt między
biokatalizatorem a środowiskiem i łatwiejszą dyfuzję;

możliwość otrzymania różnych form dogodnych z technologicznego punktu widzenia;

bezproblemowe przeprowadzenie nośnika w formę zdolną do reakcji wiązania z
biokatalizatorem (aktywacja);

wysoka hydrofilowość, umożliwiająca zachodzenie reakcji sprzęgania enzymu z
nośnikiem w środowisku wodnym;

przy sprzęganiu kowalencyjnym nośnik powinien łączyć się tylko z tymi grupami
funkcyjnymi, które nie uczestniczą w procesie katalizy;

nośnik nie powinien ograniczać działania enzymu;

niska cena i dostępność;

łatwość w izolacji nośnika z immobilizowanym biokatalizatorem ze środowiska
reakcji po zakończeniu procesu;

możliwość regeneracji nośnika i jego ponownego wykorzystania do immobilizacji.

CECHY DOBREGO NOŚNIKA

dr inż. Aneta Białkowska

NOŚNIKI ENZYMÓW

Rozpuszczalne

Nierozpuszczalne

Rozpuszczalny dekstran
Glikol polioksyetylenowy
Alkohol poliwynylowy

Organiczne

Nieorganiczne

Krzemionka
Tlenki metali
Ziemia okrzemkowa
Hydroksyapatyt
Szkło porowate
śel krzemionkowy

Syntetyczne

Naturalne

Poliakrylamid
Poliuretan
Polipropylen
Polistyren
Silikony
śywice jonowymienne
śywice epoksydowe

Chityna
Chitozan
Skrobia modyfikowana
Agar
Alginian
Kolagen

dr inż. Aneta Białkowska