dr inż. Aneta Białkowska

ANALIZA SKŁADU AMINOKWASOWEGO

Skład aminokwasowy białka wyznacza się zwykle po jego hydrolizie
kwasowej, np. w 6M HCl w temperaturze 105-110°C przez 24 godz. W
tych warunkach tryptofan ulega prawie całkowitemu rozłożeniu, a
częściowemu cystyna, cysteina i metionina.

W celu uwolnienia tryptofanu z łańcucha polipeptydowego

praktycznie bez strat stosuje się hydrolizę zasadową roztworem Ba(OH)

2

,

gotując hydrolizat przez 24 godziny.

W celu oznaczenia w białku cystyny, cysteiny i metioniny bez

strat, przed kwaśną hydrolizą poddaje się białko reakcji utleniania za
pomocą kwasu nadmrówkowego, w wyniku której z cystyny i cysteiny
powstaje kwas cysteinowy, a z metioniny sulfon metioniny, produkty te są
odporne na długotrwałe gotowanie z kwasem solnym.
Walina i izoleucyna uwalniają się dość trudno z białka i dlatego oznacza
się je dopiero po 96 godz. hydrolizy.

METODA CHEMICZNA

METODA ENZYMATYCZNA

Subtylizyna i pronaza (proteaza ze Streptomyces griseus) hydrolizują białka
całkowicie, ale reakcja enzymatyczna biegnie bardzo wolno

.

dr inż. Aneta Białkowska

ANALIZA SKŁADU AMINOKWASOWEGO

Rozdział i ilościowe oznaczanie aminokwasów w

hydrolizatach kwasowych

Chromatografia jonowymienna

na sulfonowanych żywicach

polistyrenowych

RP-HPLC (derywatyzacja przed

kolumną)

Reakcja z ninhydryną

Detekcja promieniowania w

zakresie światła widzialnego

Reakcja np. z N-(4-chinolilo)

karbaminianem N-sukcynoimidu

– przekształcenie aminokwasów

w pochodne fluorescencyjne

Detekcja promieniowania

fluorescencyjnego

Metoda Moore’a i Steina

dr inż. Aneta Białkowska

ANALIZA SKŁADU AMINOKWASOWEGO

ANALIZA SKŁADU AMINOKWASOWEGO POZWALA OKREŚLIĆ, W

JAKICH STOSUNKACH MOLOWYCH WYSTĘPUJĄ

POSZCZEGÓLNE AMINOKWASY W POLIPEPTYDZIE, ALE NIE

DOSTARCZA INFORMACJI O ICH KOLEJNOŚCI.

dr inż. Aneta Białkowska

IDENTYFIKACJA N-TERMINALNEGO AMINOKWASU

dr inż. Aneta Białkowska

IDENTYFIKACJA N-TERMINALNEGO AMINOKWASU

dr inż. Aneta Białkowska

IDENTYFIKACJA N-TERMINALNEGO AMINOKWASU

dr inż. Aneta Białkowska

IDENTYFIKACJA N-TERMINALNEGO AMINOKWASU

MIMO DUśEJ CZUŁOŚCI WIĘKSZOŚCI OMÓWIONYCH

METOD OZNACZANIA AMINOKWASÓW N-KOŃCOWYCH, NIE

MOśNA ICH STOSOWAĆ WIELOKROTNIE DO ANALIZY TEJ

SAMEJ PRÓBY POLIPETYDU, PONIEWAś PODCZAS

HYDROLIZY KWASOWEJ POLIPEPTYD ULEGA CAŁKOWITEJ

DEGRADACJI DO WOLNYCH AMINOKWASÓW.

IDENTYFIKACJA C-TERMINALNEGO AMINOKWASU

dr inż. Aneta Białkowska

dr inż. Aneta Białkowska

SPECYFICZNE EGZOPEPTYDAZY

KARBOKSYPEPTYDAZY

(odszczepiają

po jednej reszcie aminokwasowej od C-

końca począwszy)

AMINOPEPTYDAZY

(odszczepiają

po jednej reszcie aminokwasowej od N-

końca począwszy)

Karboksypeptydaza A charakteryzuje
się

szeroką

specyficznością,

z

C-końca

polipeptydu najszybciej uwalnia Tyr, Phe,
Trp, Leu, Ile, Met, Thr, Gln, His, Ala, Val, nie
uwalnia Pro, ani Arg, natomiast pozostałe
aminokwasy odłącza wolno lub bardzo wolno.

Karboksypeptydaza B

odłącza od C-końca polipeptydu

tylko aminokwasy zasadowe.

IDENTYFIKACJA C- LUB N-TERMINALNEGO

AMINOKWASU (

HYDROLIZA ENZYMATYCZNA POLIPEPTYDU

)

dr inż. Aneta Białkowska

SEKWENCJONOWANIE BIAŁKA ENZYMATYCZNEGO

dr inż. Aneta Białkowska

SEKWENCJONOWANIE BIAŁKA ENZYMATYCZNEGO

W CELU USTALENIA SEKWENCJI DŁUGIEGO POLIPEPTYDU NALEśY

GO NAJPIERW ROZCIĄĆ NA MNIEJSZE FRAGMENTY SKŁADAJĄCE

SIĘ Z 20-50 RESZT, KTÓRE PO ROZDZIELENIU PODDAJE SIĘ

SEKWENCJONOWANIU.

SPECYFICZNE POCIĘCIE POLIPEPTYDU MOśNA OSIAGNĄĆ

METODAMI CHEMICZNYMI LUB ENZYMATYCZNYMI

.

dr inż. Aneta Białkowska

CHEMICZNA HYDROLIZA POLIPEPTYDÓW

dr inż. Aneta Białkowska

ENZYMATYCZNA HYDROLIZA POLIPEPTYDÓW

ENDOPROTEINAZY

TRYPSYNA

(hydrolizuje białka po C-terminalnej stronie

reszt lizynowych i argininowych – a więc

aminokwasów zasadowych – zostawiając te

reszty na końcach C peptydów powstających

w wyniku jej działania)

CHYMOTRYPSYNA

(hydrolizuje białka po C-terminalnej stronie

reszt aminokwasów aromatycznych (Phe,

Tyr, Trp)

PROTEINAZA V

8

(Staphylococcus aureus)

(hydrolizuje białka po C-terminalnej stronie

reszt kwasu glutaminowego)

PROTEINAZA izolowana z opieńki

miodowej (Armillaria mellea)

(hydrolizuje białka po N-terminalnej stronie

reszt lizyny)

dr inż. Aneta Białkowska

SEKWENCJONOWANIE BIAŁKA ENZYMATYCZNEGO

METODA NAKŁADAJĄCYCH SIĘ FRAGMENTÓW PEPTYDÓW

dr inż. Aneta Białkowska

SEKWENCJONOWANIE BIAŁKA ENZYMATYCZNEGO-

SPEKTROMETRIA MAS

dr inż. Aneta Białkowska

SEKWENCJONOWANIE BIAŁKA ENZYMATYCZNEGO -

BADANIA PROTEOMICZNE

PROTEOMIKA – ZAJMUJE SIĘ BADANIEM RZECZYWISTEJ

EKSPRESJI INFORMACJI GENETYCZNEJ, A WIĘC SKUPIA SIĘ NA

BADANIU, KTÓRE BIAŁKA SĄ TAK NAPRAWDĘ PRODUKOWANE

PRZEZ DANY ORGANIZM BĄDŹ KOMÓRKI OKREŚLONEGO TYPU.

ETAPY W BADANIACH PROTEOMICZNYCH:

1. elektroforeza dwuwymiarowa

2. spektrometria mas

dr inż. Aneta Białkowska

ELEKTROFOREZA DWUKIERUNKOWA

1. ELEKTROFOREZA W PIERWSZYM WYMIARZE

Prowadzona jest z użyciem gradientu pH. Każde białko migruje do

takiego miejsca na żelu, w którym przestaje być obdarzone ładunkiem
(czyli do swojego punktu izoelektrycznego) i tam się zatrzymuje.
Technikę tę nazywamy

ogniskowaniem izoelektrycznym

.

2. ELEKTROFOREZA W DRUGIM WYMIARZE

Prowadzona jest w obecności dodecylosiarczanu sodu, zróżnicowanie

migracji białek opiera się w tym wypadku na różnicach w ich masach

cząsteczkowych.

Metodą elektroforezy dwuwymiarowej można rozdzielić ponad 1000
białek. Jest to przy tym metoda bardzo czuła: pozwala na wykrywanie
białek na poziomie fentomolowym (10

-15

mola).

SEKWENCJONOWANIE BIAŁKA ENZYMATYCZNEGO -

BADANIA PROTEOMICZNE

dr inż. Aneta Białkowska

Obraz po dwuwymiarowej elektroforezie białek ekstraktów komórkowych. Ogniskowanie

izoelektryczne przeprowadzono w poziomie, a elekktroforezę w obecności SDS – w pionie. Zdjęcia

zaczerpnięte z bazy danych SWISS-2DPAGE.

SEKWENCJONOWANIE BIAŁKA ENZYMATYCZNEGO -

BADANIA PROTEOMICZNE

dr inż. Aneta Białkowska

Obraz po dwuwymiarowej elektroforezie białek ekstraktów komórkowych. Ogniskowanie

izoelektryczne przeprowadzono w poziomie, a elekktroforezę w obecności SDS – w pionie. Zdjęcia

zaczerpnięte z bazy danych SWISS-2DPAGE.

SEKWENCJONOWANIE BIAŁKA ENZYMATYCZNEGO -

BADANIA PROTEOMICZNE

dr inż. Aneta Białkowska

SEKWENCJONOWANIE BIAŁKA ENZYMATYCZNEGO -

BADANIA PROTEOMICZNE

dr inż. Aneta Białkowska

OKREŚLENIE TRÓJWYMIAROWEJ STRUKTURY

(KONFORMACJI) BIAŁKA ENZYMATYCZNEGO

1. Rentgenografia strukturalna

Opiera się na rejestracji obrazów dyfrakcyjnych promieni

rentgenowskich, powstających na skutek subtelnych interakcji tego
promieniowania z chmurami elektronowymi atomów, tworzących
analizowany kryształ. Na podstawie rejestracji obrazów
dyfrakcyjnych promieniowania X przechodzącego przez kryształ pod
różnymi kątami wyznacza się trójwymiarową mapę gęstości
elektronowej w komórce elementarnej kryształu.

2. Modelowanie molekularne

Opiera się na domniemaniu, że dwa białka wykazujące homologię co

do sekwencji aminokwasowej mają podobną strukturę przestrzenną.

Usługa służąca do przewidywania struktury o nazwie SWISS-MODEL

jest dostępna na stronie ExPASy
(http://www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html).

dr inż. Aneta Białkowska

OKREŚLENIE TRÓJWYMIAROWEJ STRUKTURY

(KONFORMACJI) BIAŁKA ENZYMATYCZNEGO