Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki 
 

 

1

1. Naprawa DNA: 

2. Źródła uszkodzeń DNA: 
Wyróżniamy dwa źródła uszkodzeń DNA: endogenne uszkodzenia DNA wynikające z 
błędów powstających w czasie replikacji DNA oraz stresu oksydacyjnego, którego źródłem 
jest metabolizm tlenowy generujący reaktywne formy tlenu uszkadzające DNA; oraz czynniki 
egzogenne - środowiskowe: promieniowanie ultrafioletowe, promieniowanie jonizujące 
gamma i X, mutageny chemiczne (wynikające z zanieczyszczenia środowiska czy palenia 
tytoniu). 
3. Następstwa uszkodzeń DNA: 

•  Zmiany w sekwencjach kodujących i regulacyjnych prowadzą do powstania białek 

nieaktywnych, o zmienionej aktywności lub braku białka. 

•  Akumulacja mutacji w wyniku dużego natężenia czynnika mutagennego lub obniżenia 

aktywności systemów naprawy DNA prowadzi do nowotworów i starzenia organizmu. 

•  Mutacje w komórkach linii zarodkowej są dziedziczone i się rozprzestrzeniają; 

powstają dziedziczne choroby genetyczne. 

•  Uszkodzenie DNA na dużą skalę prowadzą od razu do śmierci; choroba popromienna. 

4. Unikanie uszkodzeń DNA: 
Jedną ze strategii ochrony DNA w komórce może być niedopuszczanie, aby nie korzystnych 
czynnik zadziałał na DNA, aby uszkodzenie DNA w ogóle nie nastąpiło. Przykładami takich 
strategii jest np. obecność melaniny w fibroblastach skóry jako ekran ochronny przeciwko 
promieniowaniu UV. Innym przykładem jest szereg mechanizmów wewnątrzkomórkowych 
usuwających reaktywne formy tlenu czy enzym dUTPaza, który uniemożliwia wprowadzanie 
dUMP do DNA. 
5 i 6. Dowód na istnienie naprawy DNA: 
Dowodem na obecność mechanizmów reperacji DNA w komórce jest nieliniowa krzywa 
przeżywalności w obecności UV: przy niskich dawkach UV przeżywalność komórek jest 
wysoka, a przy wyższych dawkach w pewnym momencie przeżywalność gwałtownie spada; 
przy bardzo wysokich dawkach pojawiają się komórki bardziej oporne. Częstość mutacji 
natomiast najpierw wzrasta, a potem maleje. Jak interpretować takie krzywe? Przy niskich 
dawkach UV uszkodzenia DNA są wydajnie naprawiane i tylko niektóre uszkodzenia są 
mutagenne, ale wraz ze wzrastającą dawką rośnie liczba mutantów przy zachowaniu jeszcze 
sporej przeżywalności. Przy wyższych dawkach przeżywalność gwałtownie maleje, co 
wynika z tego, że uszkodzeń jest zbyt dużo, aby mogły być skutecznie naprawione; ponadto 
same mechanizmy reperacji zostają uszkodzone na skutek mutacji, co dodatkowo zwiększa 
częstość mutacji, co prowadzi do bardzo dużej niestabilności genomu i dużej liczby 
nieprawidłowych białek, co bezpośrednio prowadzi do śmierci komórek. W wyniku selekcji 
pojawiają się i namnażają się rzadkie mutanty oporne na UV, które mogą na przykład powstać 
w wyniku mutacji zwiększających wydajność mechanizmów naprawczych. Przeciwieństwem 
takich mutantów są mutanty bardzo wrażliwe na UV, które jeszcze przed naświetleniem miały 
uszkodzone mechanizmy reperacji DNA. 
7. Rodzaje uszkodzeń DNA: 
Przykłady: zablokowane widełki replikacyjne na skutek napotkania nienaturalnej struktury 
DNA powstałej w wyniku modyfikacji DNA; blokada taka może prowadzić do pęknięć DNA; 
dimery tymin indukowane przez UV, alkilacje reszt azotowych, jedno- i dwuniciowe 
pęknięcia DNA, duże fragmenty jednoniciowego DNA oraz wiązania poprzeczne między 
DNA a innymi związkami, np. cisplatyną (cross-links). 

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki 
 

 

2

8. Rodzaje naprawy DNA u Eukariota: 

•   Aktywność egzonukleolityczna w kierunku 3’-5’ polimerazy DNA 
•   Bezpośrednia naprawa uszkodzeń (reversion repair, RR) 
•   Naprawa niedopasowanych nukleotydów (Mismatch Repair, MR) 
•   Naprawa przez wycinanie zasad (Base Excision Repair, BER) 
•   Naprawa przez wycinanie nukleotydów (Nucleotide Excision Repair, NER) 
•   Niehomologiczne łączenie końców (Non-Homologous End Joining, NHEJ) 
•   Homologiczna rekombinacja (Homologous Recombination, HR) 

9. Naprawa błędów podczas replikacji: 
Częstość mutacji generowana podczas replikacji DNA wynosi jedna mutacja na 10

10

 

wprowadzonych nukleotydów, mimo że polimeraza DNA myli się raz na 10

8

 nukleotydów. 

Różnica ta wynika z aktywności korekcyjnej głównej polimerazy DNA δ, która wycinana 
błędnie wprowadzane nukleotydy, dzięki aktywności egzonukleolitycznej w kierunku 
odwrotnym do syntezy DNA, czyli 3’ → 5’. Z polimerazą DNA δ współdziała kompleks 
PCNA, który przytrzymuje polimerazę DNA do matrycy. Inne polimerazy DNA β i ε biorą 
udział bezpośrednio w naprawie uszkodzeń DNA napotkanych przez widełki replikacyjne, ale 
dokładny mechanizm tej naprawy jest nieznany. 
10. Bezpośrednia naprawa uszkodzeń: 
Jednoniciowe pęknięcia mogą być  łączone bezpośrednio przez ligazę DNA. Alkilowe 
modyfikacje DNA mogą być usuwane przez specyficzne enzymy, np. przez metylotransferazę 
O6-metyloguaninową (MGMT), która katalizuje w jednej reakcji przeniesienie grupy 
metylowej z metyloguaniny (łączy się z T zamiast z C) na grupę cysteinową w centrum 
aktywnym enzymu, co inaktywuje enzym i kieruje enzym do ubikwitynacji i degradacji. 
Ludzki enzym MGMT jest homologiem bakteryjnego białka Ada, które pełni podobną 
funkcję. 
11. Bezpośrednia naprawa uszkodzeń – fotoliza: 
W wyniku działania promieniowania UV powstaje m.in. dimer cyklobutylowy pomiędzy 
sąsiadującymi pirymidynowymi zasadami, które w większości organizmów są bardzo 
wydajnie usuwane przez enzym fotolizę w reakcji zależnej od światła widzialnego. Fotoliaza 
zawiera dwa chromofory flawinowy FADH oraz folianowy MTHF. Enzym przyłącza się do 
dimeru, ale staje się aktywny dopiero pod wpływem światła widzialnego: MTHF absorbuje 
foton i przekazuje energię wzbudzenia do FADH

-

, który przekazuje elektron do dimeru 

generując anion dimeru, który przekształca się w dwie pirymidyny, a elektron powraca do 
FADH. Należy zaznaczyć,  że u człowiek obecny jest enzym homologiczny do fotolizy, ale 
pełni on zupełnie inne funkcje. 
12. Naprawa niedopasowanych nukleotydów (Mismatch Repair, MR): 
Mechanizm ten naprawia błędy zrobione przez polimerazę DNA (stąd wynika różnica między 
częstością mutacji wprowadzanych przez polimerazę DNA in vitro i in vivo) oraz powstałe w 
wyniku deaminacji, oksydacji i metylacji zasad (zmiany we właściwościach parowania 
zasad). Mechanizm ten usuwa błędnie wprowadzone zasady azotowe tylko z nowopowstałej 
nici DNA po replikacji, gdyż nowa nić przez krótki czas nie jest metylowana, co pozwala na 
rozpoznanie, która zasada jest mylnie wprowadzona, a która była tylko matrycą i pochodzi ze 
starej cząsteczki DNA. Metylowane są reszty adeniny na azocie N6 oraz cytozyny, metylaza 
Dam rozpoznaje sekwencje GATC oraz CCA/TGG. U eukariontów DNA nie jest tak często 
metylowane i nowa nić może być rozpoznawana tylko dzięki przerwom w nowej nici DNA, 
zanim ligała połączy wszystkie fragmenty. 
13. Naprawa niedopasowanych nukleotydów (Mismatch Repair, MR): 
Za rozpoznanie uszkodzenia DNA odpowiedzialny jest kompleks MutSα  złożony z dwóch 
białek MSH2 i MSH6, które przyłączają się do miejsca ze źle sparowanymi nukleotydami. Po 

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki 
 

 

3

rozpoznaniu zmienionej nici DNA, czemu towarzyszy hydroliza ATP, co prowadzi do zmiany 
konformacji i możliwości ślizgania się dimeru wzdłuż DNA. Umożliwia to po przyłączeniu 
do miejsca uszkodzenia kolejnego kompleksu MutLα, złożonego z białek MLH1 i PMS2, 
przesunięcie tetrameru i odsłonięcie miejsca uszkodzenia dla egzonukleazy I, która degraduje 
nić ze źle wstawionym nukleotydem na pewnej długości. Zdegradowana nić jest odtwarzana 
przez polimerazę δ na matrycy starej nici DNA już bez błędu w sekwencji. Mutacje w genach 
MSH2, PMS2 i MLH1 powodują dziedzicznego niepolipowatego raka jelita grubego. 
14. Naprawa przez wycinanie zasad (Base Excision Repair, BER): 
BER jest odpowiedzialny za usuwanie zmodyfikowanych zasad, które są rozpoznawane przez 
specyficzne enzymy zwane glikozylazami DNA. Rodzaje uszkodzeń naprawiane przez BER 
obejmują: utlenione zasady (powstają spontanicznie w wyniku działania rodników tlenowych, 
promieniowania UV i jonizującego), alkilowane zasady (endogenne związki alkilujące, 
karcinogeny np. nitrozoamina). Przykłady uszkodzeń: uracyl w DNA, pofragmentowane i 
utlenione pirymidyny, N-alkilowane puryny (np. 7-metyloguanina) czy 8-oksoguanina 
(główna forma utlenionej puryny i jest wysoko mutagenna, bo łączy się z adeniną zamiast z 
guaniną). Ponadto N-alkilowane puryny są podatne na spontaniczną hydrolizę wiązania N-
glikozylowego, co powoduje odłączenie puryny i powstanie miejsca apurynowego AP w 
DNA. 
15. Naprawa przez wycinanie zasad (Base Excision Repair, BER): 
ETAP 1 obejmuje rozpoznanie uszkodzenia, usunięcie zasady oraz przecięcie nici DNA: 
specyficzna glikozylaza rozpoznaje uszkodzenie, a następnie hydrolizuje wiązanie 
glikozydowe między zasadą azotową a rybozą, w wyniku czego następuje usunięcie zasady z 
DNA i powstaje tzw. miejsce AP); występują dwa typy glikozylaz: glikozylaza typu I tylko 
usuwa zasadę, natomiast glikozylaza typu II ma aktywność 3’-endonukleazy (liazy AP) i 
eliminuje wiązanie fosfodiestrowe, przecina nić DNA i powstaje wolny koniec 3’-OH oraz 
nietypowy koniec 5’-deoksyryboza-5-fosforan (5’-dRP); w przypadku glikozylazy typu I nić 
jest przecinana przez inny enzym: endonukleazę AP (APE1). 
ETAP 2 obejmuje odsunięcie na zewnątrz nici DNA od końca 5’ i syntezę pierwszego 
nukleotydu na końcu 3’ za pomocą polimerazy β. 
ETAP 3 zachodzi według dwóch scenariuszy w zależności od natury chemicznej końca 5’. W 
szlaku podstawowym następuje usunięcie końca 5’-dRP (forma hemiacetalu) przez 
polimerazę β posiadającą aktywność liazy AP oraz połączenie końców 3’-OH i normalnego 
końca 5’-P dzięki kompleksowi ligazy III z białkiem XRCC1. Niektóre końce 5’ (formy 
aldehydowe) są odporne na działanie polimerazy β i wtedy w alternatywnym szlaku następuje 
odłączenie polimerazy β i przyłączenie w jej miejsce kompleksu polimeraz δ/ε i PCNA, które 
wydłużają nić DNA od miejsca AP, przy czym koniec 5’ zostaje jeszcze bardziej odsunięty od 
DNA. Odstający koniec 5’-dRP zostaje usunięty w końcu przez endonukleazę FEN1, a 
przerwa w DNA zostaje połączona przez ligazę I. 
16. Naprawa przez wycinanie nukleotydów (Nucleotide Excision Repair, NER): 
NER odpowiedzialny jest za usuwanie różnych modyfikacji chemicznych zaburzających 
strukturę DNA, takich jak dimery pirymidynowe, fotoprodukty, międzyniciowe nowe 
wiązania poprzeczne (powstałe w wyniku działania UV), połączenia kowalencyjne DNA ze 
związkami chemicznymi –toksynami. W NER bierze udział około 30-stu białek, które 
regulują dwie różne drogi naprawy: szlak GGR (global genomic repair) niezwiązany z 
transkrypcją i szlak TCR (transcription-coupled repair), który odbywa się tylko podczas 
transkrypcji, kiedy polimeraza RNA napotka zmienioną strukturę DNA. Komórki z 
uszkodzonym szlakiem NER wykazują nadwrażliwość na promieniowanie UV. Znanych jest 
kilka zespołów chorobowych związanych z uszkodzeniami systemu NER: xeroderma 
pigmentosum (XPA, XPB, XPC, XPD), zespół Cockayne’a (mutacje w genach CSA i CSB), 
trichotiodystrofia, zespół wrażliwości na UV (UVSS). Są to wieloobjawowe zespoły 

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki 
 

 

4

chorobowe obejmujące zaburzenia neurologiczne, zwiększoną zachorowalność na 
nowotwory, starzenie skóry, choroby oczu. 
17. Naprawa przez wycinanie nukleotydów – szlak niezwiązany z transkrypcją GGR: 
Rozpoznanie uszkodzenia: biorą w tym udział trzy kompleksy, kolejność ich przyłączania nie 
jest ostatecznie ustalona; są to XPC-HR23B, XPA-RPA oraz kompleks XPE zbudowany z 
dimeru DDB1 i DDB2. 
Rozkręcenie DNA: kompleks czynnika transkrypcyjnego TFIIH zbudowanego z siedmiu 
białek (m.in. z XPB i XPD) ma aktywność helikazy DNA i przyłącza się do miejsca 
uszkodzenia jako czwarty w kolejności kompleks. 
Wycięcie DNA z uszkodzeniem: uszkodzenie zostaje wycięte z pewnym zapasem po obu 
stronach; od końca 3’ DNA zostaje przecięte przez białko XPG, a z drugiego końca przez 
kompleks ERCC1-XPF. 
Uzupełnienie przerwy w DNA: polimerazy ε i δ syntetyzują nową nić na matrycy istniejącej 
nici DNA. Na końcu nowa nić jest łączona z DNA przez DNA ligazę I. 
18. Naprawa przez wycinanie nukleotydów – szlak zależny od transkrypcji TCR: 
Uszkodzenie DNA może zablokować kompleks polimerazy RNA II podczas transkrypcji 
genu, co indukuje rzyłączenie białek CSA i CSB oraz TFIIS, których zadaniem jest 
translokacja kompleksu polimerazy RNA II z miejsca uszkodzenia i zrobienie miejsca dla 
białek naprawczych. Następnie przyłączone zostają białka ERCC1-XPF i XPG, które 
wycinają uszkodzony fragment DNA, a luka w DNA jest wypełniana przez polimerazy i 
ligazę. Po naprawie kompleks transkrypcyjny przyłączany jest na nowo i transkrypcja jest 
kontynuowana. 
19. Naprawa przez rekombinację – naprawa dwuniciowych złamań DNA, które są dla 
komórki najgroźniejsze: 
Dwuniciowe złamania DNA mogą być naprawiane przez niehomologiczne łączenie końców 
(Non-Homologous End Joining, NHEJ), które jednak generuje błędy (dominuje u ssaków i w 
fazie G0/G1) lub homologiczną rekombinację (Homologous Recombination, HR), która nie 
generuje zmian w DNA (dominuje u drożdży i w fazach S i G2). 
Białka rozpoznające dwuniciowe złamania DNA inicjują zarówno naprawę DNA, jak również 
inicjują sygnał o uszkodzeniu DNA w celu zatrzymania cyklu komórkowego. Pierwszymi 
białkami rozpoznającymi dwuniciowe złamanie DNA jest kompleks MRN (Mre11-Rad50-
Nbs1; u drożdży Mre11-Rad50-Xrs2), który niezależnie promuje naprawę przez NHEJ i HR. 
20-22. Struktura i funkcje kompleksu MRN: 
Funkcją tego kompleksu jest rozpoznanie dwuniciowego pęknięcia DNA oraz obróbka 
końców złamania, która może polegać na wyrównywaniu końców DNA do połączenia na 
drodze NHEJ lub indukowanie tworzenia długich jednoniciowych końców, które później 
biorą udział w homologicznej rekombinacji. Innymi funkcjami kompleksu MRN jest 
przyłączanie innych białek niezbędnych do inicjowania i przekazywania sygnału o 
uszkodzeniu DNA (przyłączenie kinazy Atm – u drożdży Tel1 poprzez białko Nbs1, co 
umożliwia fosforylację histonu H2A przez ATM po obu stronach złamania DNA). 
Charakterystyczna budowa kompleksu MRN z długimi, hakowatymi domenami Rad50 i 
możliwość tworzenia białkowych obręczy razem z promowaniem przyłączania kohezyn w 
miejscu złamania DNA sugeruje, że funkcją kompleksu MRN może być utrzymywanie razem 
końców złamania DNA. Przez tworzenie długich jednoniciowych końców DNA umożliwia 
także w dalszych etapach przyłączenie ATR (Mec1) i innych białek odpowiedzi na 
uszkodzenia DNA w miejsce złamania. Kompleks MRN niezbędny jest też do przyłączania 
kompleksów przebudowujących chromatynę w obrębie uszkodzenia DNA. 

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki 
 

 

5

23. Niehomologiczne łączenie końców (Non-Homologous End Joining, NHEJ): 
Do złamania DNA niezależnie przemieszcza się kompleks MRN oraz heterodimer Ku70-
Ku80. Kompleks MRN ma aktywność helikazy, endo i egzonukleazy, co umożliwia 
wyrównanie końców DNA przez przycinanie wystających końców 3’. Wystające końce 5’ 
prawdopodobnie przycinane są przez białko FEN-1. Kompleks Ku70-Ku80 chroni końce 
DNA przed trawieniem egzonukleazami (nie powstają lepkie końce) oraz przyłącza 
podjednostkę katalityczną DNA-PK (kinaza białkowa zależna od DNA z rodziny ATR i 
ATM, nie występuje u drożdży), która jest aktywowana przez jednoniciowe DNA przy 
złamaniu. Do kompleksu Ku70/80 przyłącza się też białko Artemis, które bierze udział w 
obróbce końców DNA. DNA-PK z kolei aktywuje białko XRCC4, które tworzy kompleks i 
aktywuje ligazę IV, która łączy końce złamanego DNA. 
24. Homologiczna rekombinacja (Homologous Recombination, HR): 
Kompleks MRN oprócz roli w inicjacji NHEJ może również indukować resekcję (degradację 
jednej nici DNA) w kierunku 5’-3’, dzięki czemu powstają jednoniciowe końce DNA, które 
biorą udział w homologicznej rekombinacji. Do końców jednoniciowego DNA przyłącza się 
białko Rad52, które może promować naprawę przez dopasowanie pojedynczych nici DNA 
(SSA: single-strand annealing) na podstawie krótkich mikrohomologii (~30 pz) lub przez 
homologiczną rekombinację. W SSA biorą udział białka Rad52 oraz Rad59, które indukują 
parowanie lepkich końców w obrębie mikrohomologii, a fragmenty niehomologiczne są 
usuwane przez Rad1-10 oraz MSH2 i MSH6. Niestety podczas naprawy SSA generowane są 
delecje. Zatem homologiczna rekombinacja jest preferowana przez komórkę, gdyż ta droga 
naprawy nie generuje błędów w DNA. Do końców jednoniciowych nici przyłącza się białko 
Rad52 o strukturze pierścienia, które chroni nici przed degradacją egzonukleolityczną. 
Podobną funkcję ma białko Rpa1 (Rfa1), które opłaszcza jednoniciowe DNA na całej 
długości. Następnie do nici DNA przyłącza się białko Rad51, które zastępuje białko Rpa1 i 
opłaszcza jednoniciowe DNA tworząc tzw. filamenty Rad51, które są odpowiedzialne za 
inwazję nici DNA do homologicznej cząsteczki DNA. W interakcje z Rad51 wchodzą też 
białka BRCA1 i BRCA2 oraz Rad54, 55, 57 i 59, które są niezbędne do zajścia rekombinacji. 
Po inwazji nici do homologicznej cząsteczki DNA tworzy się struktura Holliday’a – struktura 
heterodupleksu między homologicznymi niciami (charakterystyczne przekrzyżowania nici), 
która się następnie przemieszcza na boki, czemu towarzyszy synteza brakujących nici. Potem 
dochodzi do ligacji nowych fragmentów i cząsteczki DNA się oddzielają. 
25-27. Organizacja w czasie i przestrzeni obróbki dwuniciowych pęknięć DNA: 
Organizację obróbki dwuniciowych pęknięć DNA w czasie i przestrzeni ustalono na 
podstawie analizy kinetyki lokalizacji białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA w obrębie 
jądra. Białka te wykrywano fluorescencyjnie w miejscu uszkodzenia dzięki temu, że 
połączono je z różnymi typami białek fluorescencyjnych o różnych kolorach fluorescencji. 
U drożdży ustalono, że do miejsca złamania DNA przyłącza się najpierw kompleks Mre11-
Rad50-Xrs2 (MRX, odpowiednik kompleksu MRN), a potem do niego dołącza kinaza Tel1. 
W przypadku niskiej aktywności kinazy zależnej od cyklin Cdk (np. w G1), kompleks MRX i 
Tel1 odłączają się i przyłączają się białka promujące naprawę przez NHEJ. Przy wysokiej 
aktywności Cdk kompleks MRX sam i przy pomocy innej egzonukleazy generuje długie 
jednoniciowe odcinki DNA. MRX i Tel1 indukują również fosforylację histonu H2A w 
sąsiednich obszarach chromatyny, po czym się odłączają od miejsca uszkodzenia. 
Jednoniciowe DNA zostaje spłaszczone przez białko RPA, do którego przyłącza się kinaza 
Mec1 (ATR) za pośrednictwem białka Ddc2 (ATRIP). W tym samym czasie do końców DNA 
przyłącza się kompleks pierścieniowy Ddc1-Mec3-Rad17, a do niego z kolei przyłącza się 
kompleks Rad24-Rfc2-5. Wszystkie wymienione powyżej białka i kompleks są niezbędne do 
prawidłowej naprawy uszkodzenia i do wysłania sygnału o uszkodzeniu komórki w celu 
zatrzymania cyklu komórkowego. Na końcu zostają przyłączone białka Rad52 i Rad51, które 

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki 
 

 

6

biorą udział tylko w naprawie DNA przez HR. Jednocześnie z białkami Ddc2-Mec1 do 
miejsca uszkodzenia przyłącza się białko adaptorowe Rad9, które pośredniczy w fosforylacji 
kinaz efektorowych Chk1 i Rad53 przez Tel1 i Mec1. 
28-29. Rola białka adaptorowego Rad9: 
Po przyłączeniu do miejsca uszkodzenia i aktywacji kinaz Mec1 i Tel1 następuje fosforylacja 
i aktywacja białka adaptorowego Rad9. Ufosforylowany Rad9 może przyłączyć nieaktywną 
kinazę efektorową Rad53, co umożliwia fosforylację Rad53 przez Mec1. Fosforylacja Rad53 
aktywuje swoją własną trans-autofosforylację w wielu miejscach. Tak w pełni zaktywowana 
kinaza Rad53 jest uwalniana z miejsca uszkodzenia. Nowa cząsteczka Rad53 może zostać 
przyłączona do Rad9, co stanowi mechanizm amplifikacji sygnału o uszkodzeniu DNA (drugi 
mechanizm to zwielokrotnienie miejsc przyłączenia dla Rad9 w obrębie uszkodzenia DNA w 
postaci fosforylowanych histonów H2A i odsłonięcia zmetylowanej lizyny 79 histonu H3). 
Zmetylowana lizyna 79 histonu H3 jest miejscem przyłączenia do chromatyny białka Rad9 
(Crb2 i 53BP1) poprzez konserwatywną domenę tudor. 
30-32. Rola modyfikacji i przebudowy chromatyny w naprawie DNA: 
Po przyłączeniu kinazy ATM (Tel1) do miejsca uszkodzenia następuje fosforylacja histonu 
H2AX (H2A u drożdży). Do ufosforylowanego H2AX przyłączają się następnie kohezyny 
oraz kompleks modyfikujący chromatynę NuA4, który acetyluje histony. Umożliwia to 
przyłączenie kompleksu przebudowującego chromatynę INO80, który usuwa histony przy 
złamaniu DNA, aby mogły być utworzone regiony jednoniciowego DNA. Po odłączeniu 
ATM i powstaniu jednoniciowych fragmentów przyłączona zostaje kinaza ATR (Mec1), która 
fosforyluje kolejne histony H2AX oraz białka adapterowe, które przyłączają się do właśnie do 
ufosforylowanej seryny histonu H2A oraz zmetylowanej lizynie 79 na histonie H3, co 
dodatkowo wzmacnia sygnał o uszkodzeniu DNA. Po dokonaniu naprawy DNA sygnał o 
uszkodzeniu musi być wyłączony. Przyłączenie kompleksu przebudowującego chromatynę 
TIP60 pozwala na usunięcie dimerów H2AX/H2B i wstawienie nieufosforylowanych 
histonów H2A i tym samym wyłączenie sygnału. 
 

1. Modele starzenia komórki. Dieta niskokaloryczna - sposób na 
długowieczność: 

2. Limit Hayflick’a wskazuje, że każda komórka ma zaprogramowany wiek:  
Hayflick stwierdził,  że komórki ludzkie w hodowli dzielą się maksymalnie około 50 razy i 
umierają. Eksperymenty, w których przeszczepiano stare komórki na młody organizm 
wykazały,  że zdolność do liczby podziałów jest cechą wewnętrzna komórki i nie ma 
znaczenia wpływ młodego organizmu na przeszczepione komórki. U większości zwierząt 
istnieje pozytywna korelacja między maksymalną  długością  życia, a maksymalną liczbą 
podziałów komórek. Z drugiej strony komórki pobrane od pacjentów z progerią Wernera - 
syndromem przedwczesnego starzenia zdolne są do tylko 10-ciu podziałów. Ale przy okazji 
rozważań na temat długości życia musimy rozważać zarówno replikacyjny czas życia, czyli 
zdolność do podziałów, jak i chronologiczny czas życia komórki, czyli rzeczywista długość 
życia, która nie ustaje wraz z podziałami. 
3. Z czego wynika zaprogramowany wiek komórki? 
Wczesne teorie wskazywały na istnienie genów śmierci („death gene”) lub genów starzenia, 
które by indukowały w pewnym momencie starzenie i śmierć komórki, ale do tej pory nie 
zidentyfikowano takich genów. Obecnie uważa się,  że starzenie wynika z osłabienia 
wewnętrznych mechanizmów komórkowych zapewniających długowieczność. 

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki 
 

 

7

4. Mechanizmy starzenia – hipotezy: 

•  Telomerowa teoria starzenia 
•  Teoria mutacji genowych 
•  Teoria osłabionej naprawy DNA 
•  Teoria akumulacji odpadów w komórce: np. teoria wolnorodnikowa 
•  Teorie gerontologiczne: zmiany hormonalne, szybkość metabolizmu 
•  Teorie ewolucyjne: adaptacyjna, antagonistyczna plejotropia i „disposable soma”  

5-6. Struktura i skracanie telomerów. Telomerowa hipoteza starzenia: 
Liniowe chromosomy eukariotyczne zakończone są charakterystyczną strukturą telomerową 
zbudowaną z wielu tandemowych powtórzeń sekwencji TTAGGG oraz wystającym 
jednoniciowym ogonem 3’. Ze względu na to, że polimeraza DNA nie może syntetyzować 
nici DNA w kierunku 3’ do 5’ i musi korzystać ze startera RNA na nici opóźnionej. Po 
odłączeniu primera koniec 5’ ulega skróceniu. Z każdym cyklem replikacyjnym może 
następować skrócenie chromosomu. Dodatkowo nić z końcem 5’ telomeru nie dostarcza 
matrycy dla wydłużonej wystającej nici 3’ i po replikacji cząsteczka potomna jest tego końca 
pozbawiona. Nić 3’ może jednak być wydłużana przy udziale telomerazy, która ma własną 
matrycę do elongacji. Jednak telomeraza nie jest aktywna we wszystkich komórkach, co 
doprowadziło do hipotezy, że przyczyną starzenia komórek jest systematyczne skracanie 
chromosomów i utrata ważnych genów. Hipoteza ta jest poparta obserwacjami, że im starsze 
komórki tym krótsze mają telomery, że w komórkach z progerią obserwuje się szybszą utratę 
telomerów oraz że komórki nowotworowe – replikacyjnie nieśmiertelne mają stałą  długość 
telomerów, dzięki stałej aktywności telomerazy. Ale (!) większość komórek somatycznych 
ma ograniczoną liczbę podziałów i nie jest możliwe tak silne skrócenie telomerów, aby 
nastąpiła utrata dużej liczby genów oraz nie zidentyfikowano też żadnego, zlokalizowanego 
blisko telomerów genu,  którego utrata powodowałaby starzenie. 
7. Teoria mutacji genowych i osłabionej naprawy DNA: 
Z wiekiem komórek obserwuje się nagromadzanie mutacji (starzenie DNA), które mogą 
prowadzić do zmian funkcji białek. Z wiekiem spada też wydajność naprawy DNA, co 
prowadzi do akumulacji mutacji. Istnieje też korelacja między długością  życia gatunku a 
sprawnością systemów naprawy DNA. Prawie wszystkie znane choroby charakteryzujące się 
przyspieszonym starzeniem spowodowane są mutacjami w genach związanych z naprawą 
DNA, ochroną telomerów czy całego DNA. Zatem jedną z przyczyn starzenia może być 
postępujące uszkodzenia genomów. 
8. Choroby przedwczesnego starzenia: 

Choroba / gen / 
maksymalny czas życia 

 
Uszkodzony proces 

 
Objawy 

Syndrom Wernera / 
helikaza WRN / 48 lat 

Naprawa DNA (HR, 
NHEJ), replikacja DNA, 
metabolizm telomerów, 
apoptoza 

siwienie, katarakta, 
arterioskleroza, 
osteoporoza, cukrzyca, 
atrofia skóry 

Syndom Cockayne’a / 
CSB i CSA / 20 lat 

Naprawa DNA (BER, 
NER) 

neurodegeneracja, 
katarakta, 
arterioskleroza, 
osteoporoza, cukrzyca, 

Syndrom Blooma / 
BLM / 28 lat 

Naprawa DNA ??? 

nowotwory,  cukrzyca, 
katarakta 

Syndrom Hutchinsona-
Gilforda / LMNA /12 
lat 

Struktura jądra, 
transkrypcja 

arterioskleroza, 
osteoporoza, atrofia 
mięśni 

 

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki 
 

 

8

9. Teoria akumulacji odpadów w komórce: 
W starych komórkach obserwuje się nagromadzanie żółto-brązowego barwnika lipofuscyny, 
który tworzy nierozpuszczalne agregaty; mogą one stanowić nawet 30% objętości 
cytoplazmy; barwnik ten oddziałuje z białkami, tłuszczami i DNA, co może istotnie zaburzać 
metabolizm komórki. 
Teoria wolnorodnikowa starzenia mówi, że przyczyną starzenia są reaktywne formy tlenu 
(ROS), które uszkadzają DNA, białka i lipidy; z wiekiem uszkodzenia te się nagromadzają, a 
systemy obronne słabiej działają; ten mechanizm może mieć znaczenie zwłaszcza dla 
chronologicznego czasu życia komórki. Ale np. nadekspresja genu SOD1 kodującego 
dysmutazę nadtlenkową zwiększa długość życia u muszki, ale delecja tego genu z kolei nie 
skraca  życia. Z drugiej strony mutant myszy z przyspieszoną akumulacją mutacji 
mitochondrialnych wykazuje objawy przyspieszonego starzenia. Stwierdzono też w badaniach 
na dużą skalę, że podawanie antyoksydantów (np. witaminy E) nie wpływa na długość życia; 
niekoniecznie musi to być dowód przeciwko tej teorii, gdyż po prostu zewnętrzne podawanie 
antyoksydantów nie musi mieć przełożenia bezpośredniego na metabolizm ROS w komórce. 
10. Ewolucyjne teorie starzenia: 
Starzenie jako adaptacja: uważano kiedyś,  że starzenie może być cechą przystosowawczą 
wynikającą z potrzeby zrobienia miejsca dla młodych osobników, ale obecnie uważa się, że 
dobór działa na poziomie osobniczym, a nie gatunkowym; na poziomie osobnika 
nieśmiertelność jest korzystniejsza od starzenia i śmierci. 
Antagonistyczna plejotropia: starzenie wynika z akumulacji mutacji, które dają większą 
rozrodczość w młodym wieku, ale wpływają niekorzystnie w wieku późniejszym; znane są 
przykłady takich mutacji u C. elegans i muszki owocowej; rozmnażanie wpływa negatywnie 
na długość  życia; presja selekcyjna działa słabo w wieku dojrzałym (np. brak eliminacji 
mutacji powodującej pląsawicę Huntingtona ujawniająca się około 35 roku życia). 
Disposable soma: każdy organizm ma ograniczoną ilość energii, którą może całkowicie 
poświęcić na utrzymywanie zdrowej komórki (długowieczność), ale wszystkie organizmy 
muszą się rozmnażać i dużo energii na to jest zużywane, a na tym z kolei cierpi sama 
komórka, która akumuluje uszkodzenia, co objawia się starzeniem. 
11. Gerontologiczne teorie starzenia: 
Szybkość metabolizmu: im szybszy metabolizm tym krótsze życie np. mysz; efekt pozorny, 
zależy to od sposobu obliczania tempa metabolizm; okazuje się,  że mysz i słoń mają takie 
samo tempo metabolizmu, jeśli uwzględni się ilość skonsumowanego tlenu przez całe życie 
na wagę ciała. 
Zmiany hormonalne: z wiekiem obniża się ilość niektórych hormonów np. u mężczyzn 
testosteronu (w latach 20-tych mężczyznom wszczepiano mężczyznom jądra od małp czy 
kóz, aby zapewnić sobie długowieczność); testosteron raczej wpływa na to, że mężczyźni 
zaczynają się szybciej starzeć od kobiet i stąd prawdopodobnie wynika, że kobiety żyją 
średnio o 5-7 lat dłużej od mężczyzn. 
12. Zmiany hormonalne a starzenie: 
Niski poziom hormonu wzrostu (GH), a także czynnika wzrostu podobnego do insuliny IGF-1 
(jego ekspresja i sekrecja indukowana jest przez GH) oraz osłabienie drogi sygnalnej zależnej 
od IGF-1 wydłużają życie u organizmów modelowych. Przykłady: mutacje daf-2 (receptor dla 
IGF-1) i age-1 (kaskada sygnałowa IGF-1) u C. elegans wydłużają  życie; stulatkowie mają 
niski poziom IGF-1 oraz wysoką wrażliwość na insulinę; karły nie leczone hormonem 
wzrostu żyją dłużej, ale szybciej pojawiają się obniżający nich objawy starzenia (obniżający 
się z wiekiem poziom GH wpływa na spadek masy mięśniowej, powoduje osteoporozę i 
wzrost ilości tkanki tłuszczowej); osoby cierpiące na gigantyzm żyją krócej (wysoki poziom 
GH); duże rasy psów (wysoki poziom IGF-1) żyją krócej; liczne mutanty myszy typu dwarf 

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki 
 

 

9

(karzeł)  są  długowieczne. UWAGA! Wydłużenie  życia nie jest równoznaczne z brakiem 
objawów starzenia. 
13. Droga sygnalna zależna od IGF-1: 
U C. elegans aktywacja receptora insulinowego DAF-2 przez hormon IGF-1 indukuje 
kaskadę sygnalną z udziałem kinazy PI3K (fosfatydylinozytol-3-kinaza) oraz kinazy PDK1 
(kinaza zależna od PI3K), która kończy się aktywacją kinaz Akt1 i Akt2, które fosforylują i 
deaktywują czynnik transkrypcyjny DAF-16. Brak aktywacji tej kaskady sygnałowej poprzez 
np. obniżenie poziomu IGF-1 czy mutację w receptorze DAF-2, prowadzi do aktywacji białka 
DAF-16, które hamuje rozwój robaka w kierunku dojrzałości płciowej i rozmnażanie, a 
jednocześnie indukuje powstanie stadium pośredniego larwy typu dauer, która cechuje się 
długowiecznością (żyją nawet 4 razy dłużej od osobników normalnych). 
14-16. Mechanizm starzenia komórek drożdży: 
Dwie kluczowe obserwacje doprowadziły do poznania molekularnego mechanizmu starzenia 
się drożdży: stwierdzono, że komórki potomne drożdży dziedziczą stary replikacyjny wiek 
komórek macierzystych (im starsza komórka macierzysta, tym komórki potomne mają 
zdolność do mniejszej liczby podziałów) oraz wyizolowano cztery mutacje „youth” (uth1 do 
uth4) przedłużających życie replikacyjne drożdży; trzy z tych mutacji znajdują się w genach 
regulujących powstawanie „cichej” heterochromatyny, w tym w genie SIR2, który koduje 
deacetylazę histonową. Sir2 katalizuje przy udziale NAD

+

 odłączenie grupy acetylowej od 

substratu z wytworzeniem acetylo-ADP-rybozy i nikotynoamidu, który zwrotnie hamuje 
aktywność Sir2. Okazało się, że wzrost aktywności Sir2 poprzez kondensację chromatyny w 
obrębie genów rybosomalnych hamuje powstawanie i akumulację kolistych cząsteczek DNA, 
które powstają na skutek rekombinacji między homologicznymi tandemami genów 
rybosomalnych, co prowadzi do wydłużenia  życia. Ustalono, że przyczyną skracania życia 
replikacyjnego jest toksyczna akumulacja kolistych cząsteczek DNA. Dziedziczenie starego 
wieku replikacyjnego u drożdży odbywa się przez przekazywanie kolistych cząsteczek DNA 
komórkom potomnym. 
17. Sposoby na przedłużenie życia: 
Na podstawie danych naukowych wydaje się, że sposobami na przedłużenie życie mogły być 
inhibitory drogi sygnalnej regulowanej przez IGF-1 lub metformina, lek na cukrzycę typu 
drugiego; lek ten zwiększa wrażliwość komórek na insulinę i obniża poziom cukru we krwi 
przez hamowanie glukoneogenezy w wątrobie, co zmniejsza aktywację drogi sygnalnej 
zależnej od IGF-1. Inną drogą może być dieta niskokaloryczna (restrykcja kaloryczna), która 
jest jedynym naukowo potwierdzonym sposobem na wydłużenie życia. 
18-21. Dieta niskokaloryczna (calorie restriction): 
Definicja: redukcja o 30-50% dziennej dawki kalorii przy zachowaniu odpowiedniej ilości 
cukrów, białek i tłuszczów oraz wszystkich witamin i mikroelementów. Wpływ diety 
niskokalorycznej na długość  życia odkryto u szczurów w 1935 roku przez McKaya i wsp. 
Okazało się, że szczury na zredukowanej diecie osiągają maksymalny wiek dłuższy o jedną 
trzecią od szczurów na diecie pełnej. Podobnie dłuższy jest średni wiek szczurów na diecie 
niskokalorycznej, co akurat świadczy o lepszej kondycji ogólnej tych szczurów. Dieta 
niskokaloryczna ma podobne efekty u wszystkich dotychczas zbadanych organizmów od 
pierwotniaków do ssaków. 
22. Dieta niskokaloryczna zwalnia procesy starzenia: 
Dieta niskokaloryczna obniża poziom glukozy, insuliny i cholesterolu we krwi; zwiększa 
wrażliwość komórek na insulinę; obniża ciśnienie krwi; zwiększa sprawność umysłową u 
starszych zwierząt; zwiększa aktywność mechanizmów naprawczych DNA oraz zmniejsza 
produkcję reaktywnych form tlenu i związane z tym uszkodzenia tkanek. 

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki 
 

 

10

23. Mniej kalorii = mniej chorób: 
Dieta niskokaloryczna bardzo istotnie zmniejsza zachorowalność na wiele typów 
nowotworów, także na cukrzycę, degeneracyjne choroby układu nerwowego i choroby 
autoimmunologiczne. 
24. Dieta niskokaloryczna ma także skutki negatywne: 
•  Zwierzęta rosną wolniej i osiągają mniejszą masę maksymalną 
•  Opóźnione dojrzewanie płciowe 
•  Krótszy okres płodności 
•  Obniżona temperatura ciała; wrażliwość na zmiany temperatury (zanik tkanki 

tłuszczowej) 

•  Zanik tkanki mięśniowej (ale ten związany z wiekiem jest osłabiony); słabsza siła 

fizyczna 

•  Łatwiejszy wzrost toksyn we krwi 
•  Gorsze gojenie ran 
•  Zmiany psychiczne: depresja, nadpobudliwość 
25. Waga ciała czy ilość tkanki tłuszczowej nie wpływają na przedłużenie życia:  
Szczury, które otrzymywały 92% normalnej liczby kalorii, ale które miały wagę ciała 
mniejszą o 40% niż grupa kontrolna, charakteryzowały się: większym średnim czasem życia, 
ale nie zaobserwowano zwiększenia maksymalnego czasu życia. Genetycznie zmienione 
„otyłe” myszy (posiadają dwukrotnie więcej tkanki tłuszczowej niż normalne myszy) 
hodowane na diecie niskokalorycznej osiągały prawie dwukrotnie wyższy maksymalny wiek 
podobnie jak myszy kontrolne. Zatem przyczyną wydłużania  życia przez dietę 
niskokaloryczną, nie jest mała waga i mniejsza ilość tkanki tłuszczowej. 
26. Kierunki badań na dietą niskokaloryczną: 
Jaki jest efekt stosowania diety niskokalorycznej u naczelnych, w tym u człowieka? 
Jaki jest molekularny mechanizm działania diety niskokalorycznej? 
Czy istnieją substancje (nutraceutyki), które miałyby takie samo działanie jak dieta 
niskokaloryczna? 
27-28. Czy dieta niskokaloryczna działa u naczelnych? 
Prowadzone są testy na dwóch gatunkach małp: Macaca mulatta i Saimiri sciureus. Badany 
jest efekt stosowania tej diety od urodzenia i u dorosłych już zwierząt. Na wyniki tych badań 
trzeba będzie poczekać jeszcze kilkanaście lat. Rozpoczęto też badania nad efektami 
stosowania tej diety u człowieka. 
29-31. Czy dieta niskokaloryczna działa u człowieka? 
Starożytni Grecy i Rzymianie doceniali dobroczynne efekty ograniczania ilości spożywanego 
jedzenia. Pierwszą osobą, która stosowała dietę niskokaloryczną był  Włoch Luigi Cornaro 
(żył ponad 80 lat). Prof. Maurice Gueniot był znany ze stosowania diety niskokalorycznej 
(102 lata). Ciekawym przykładem na poparcie diety niskokalorycznej jest analiza populacji na 
Okinawie w Japonii. Liczba stulatków na Okinawie jest 2-40 razy większa niż na pozostałych 
wyspach Japonii. Ilość kalorii spożywana przez dzieci w wieku szkolnym na Okinawie 
wynosi tylko 62% zalecanej dawki w Japonii. Dorośli z Okinawy spożywają 20% mniej 
kalorii niż wynosi średnia krajowa w Japonii; o 40% mniej niż w USA; dieta oparta na 
warzywach, zbożach, rybach, owocach. Liczba zgonów z powodu udarów, nowotworów i 
chorób serca jest o 35% mniejsza niż na pozostałych wyspach japońskich. Liczba zgonów 
osób w wieku 60-64 lat jest o połowę mniejsza niż w innych częściach Japonii. Inny przykład 
to eksperyment Biosphere 2, w którym na dwa lata 4 mężczyzn i 4 kobiety zostały zamknięte 
w sztucznym środowisku odizolowanym od reszty świata; dzienna dawka kalorii wynosiła 
1750-2100 kcal (dieta niskokaloryczna); zaobserwowano spadek wagi: 19% (mężczyźni), 
13% (kobiety), obniżenie ciśnienia krwi, obniżenie stężenia cukru, cholesterolu i insuliny we 

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki 
 

 

11

krwi. Podobne zmiany fizjologiczne, hormonalne i biochemiczne zaobserwowano u osób z 
Caloric Restriction Society praktykujących dietę niskokaloryczną od 3 do 15 lat. 
32-33. Jak dieta niskokaloryczna przedłuża życie? 

•  Opóźnienie rozwoju – brak genetycznego programu starzenia, nie ma genów starzenia 
•  Zwolnienie metabolizmu – tylko na początku diety, potem tempo normalne 
•  Osłabienie stresu oksydacyjnego – zwiększenie poziomu białek błony 

mitochondrialnej UCP (uncoupling protein), które przenoszą protony z cytoplazmy do 
mitochondrium i zmniejszają produkcję ATP i gradient protonowy (powstaje mniej 
ROS) 

•  Zwiększenie wrażliwości na insulinę, obniżenie ilości insuliny i glukozy we krwi, 

redukcja tkanki tłuszczowej – zmiany hormonalne 

 

34-35. Hipoteza hormezy i ksenohormezy – próba syntezy wiedzy o regulacji 
długowieczności: 
Hormeza opisuje zjawisko, kiedy określony bodziec, który jest szkodliwy dla organizmu przy 
wysokim natężeniu, wykazuje działanie stymulujące i korzystne przy niskim natężeniu. 
Ksenohormeza mówi o tym, że organizmy rozwinęły mechanizmy pozwalające na odbieranie 
hormetycznych sygnałów od innych organizmów z tego samego środowiska. Według tej 
hipotezy dieta niskokaloryczna jest czynnikiem stresowym o niskim natężeniu, który 
aktywuje szereg mechanizmów w komórce, których celem jest ochrona kondycji komórki, co 
obejmuje osłabienie apoptozy, zmniejszenie produkcji reaktywnych form tlenu czy syntezę 
hormonów, które aktywują te mechanizmy także w innych komórkach organizmu. 
36. Co jest białkiem efektorowym aktywowanym przez dietę niskokaloryczną? 
U drożdży niezbędna jest obecność deacetylazy Sir2, aby działała dieta niskokaloryczna. 
Ponadto delecja genu SIR2 skraca życie komórek drożdżowych. U człowieka jest siedem 
homologów białka Sir2; są to syrtuiny Sirt1-7, które oprócz histonów deacetylują wiele 

Dieta niskokaloryczna 

Niski poziom glukozy we krwi

Obniżenie poziomu insuliny we krwi

Tkanka tłuszczowa uwalnia tłuszcz 

i zwiększa wydzielanie adiponektyny

Adiponektyna uwrażliwia 

 komórki na insulinę 

Dalsze obniżenie poziomu

insuliny we krwi 

Dieta obfita 

Wysoki poziom glukozy we krwi 

Zwieksznie poziomu insuliny we krwi

Tkanka tłuszczowa magazynuje tłuszcz

i zmniejsza wydzielanie adiponektyny 

Spadek wrażliwości komórek na insulinę

Wzrost ilości glukozy we krwi, co powoduje

chroniczne wydzielanie insuliny do krwi i 

w końcu prowadzi do cukrzycy typu II 

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki 
 

 

12

innych białek, nie tylko histony. Białka Sir mogłyby być takim elementem odbierających 
sygnał stresowy w postaci diety niskokalorycznej. 
37-38. Molekularny mechanizm działania deacetylazy SIRT1: 

•  Deacetylacja p53 i Ku70: hamowanie apoptozy 
•  Reguluje transkrypcję poprzez oddziaływanie z czynnikami transkrypcyjnymi z 

rodziny FOXO (forkhead): obniżenie transkrypcji BIM (hamowanie apoptozy) a 
zwiększenie transkrypcji MnSOD (obrona przed stresem oksydacyjnym), p27 
(zatrzymanie cyklu komórkowego), GADD45 (naprawa DNA) 

•  Hamowanie białka PPARγ (receptor hormonów steroidowych), które stymuluje 

tworzenie nowych komórek tłuszczowych i promuje magazynowanie tłuszczów 

•  Ochrania komórki nerwowe (mutant myszy Walerian ma podwyższony poziom NAD i 

charakteryzuje się wysoką ochroną przed degeneracją neuronów) 

Zatem białko SIRT1 spełnia wszystkie warunki białka odbierającego czynnik stresowy i 
zmieniającego metabolizm komórki w kierunku zapewnienia przeżycia komórki i jej ochrony. 
Ale jak deacetylazy Sir2 i SIRT1 są aktywowane przez dietę niskokaloryczną?  
Aktywność Sir2 może być zwiększona przez usuwanie inhibitora nikotynoamidu lub przez 
zwiększenie ilości NAD

+

. Okazało się,  że dieta niskokaloryczna i inne czynniki stresowe 

aktywują gen PNC1, kodujący nikotynoamidazę, która rozkłada nikotynoamid i przez to 
zwiększa aktywność Sir2. Ponadto zaobserwowano u drożdży wzrost oddychania tlenowego, 
co z kolei zwiększa pulę NAD

+

 niezbędnego do aktywności katalitycznej Sir2. 

39-41. Resweratrol jako nutraceutyk imitujący dietę niskokaloryczną: 
W teście in vitro badano wpływ setek związków chemicznych na aktywność ludzkiego 
homologa Sir2, SIRT1. Najsilniejszym aktywatorem sirtuin okazał się polifenol resweratol, 
wtórny metabolit roślinny, którego najwięcej jest w winogronach i czerwonym winie. 
Potwierdzono później,  że resweratrol ma takie samo działanie jak dieta niskokaloryczna 
(wydłuża życie u drożdży) i wymaga do działania obecności białka Sir2. 
 

1. Apoptoza 

2. Apoptoza a programowana śmierć komórki – definicje: 
Apoptoza – morfologiczny opis śmierci komórki, inny niż  nekroza, czyli przypadkowa 
śmierć pod wpływem czynników zewnętrznych 
Programowana śmierć komórki (programmed cell death) – opisuje proces, który indukuje 
śmierć pojedynczej komórki podczas rozwoju organizmu w ściśle określonym miejscu i w 
ściśle określonym czasie 
Terminy te często używa się wymiennie, bo prawie każda programowana śmierć komórki 
odbywa się na drodze apoptozy, ale np. śmierć komórki w wyniku uszkodzeń DNA odbywa 
się na drodze apoptozy, która nie była z góry zaprogramowana i bez uszkodzenia DNA śmierć 
by nie nastąpiła. 
3. Klasyfikacja typów śmierci komórki: 
Nekroza: przypadkowa i bierna śmierć spowodowana przez niszczące czynniki zewnętrzne: 
fizyczne, chemiczne, biologiczne. 
Apoptoza:  ściśle regulowany aktywny proces fizjologiczny o charakterystycznych cechach 
morfologicznych, w wyniku którego usuwane są niepotrzebne lub niewykorzystane komórki 
podczas embriogenezy i rozwoju organów oraz uszkodzone, nieprawidłowo umiejscowione, 
zmutowane lub zainfekowane komórki, co stanowi mechanizm obronny organizmu; brak 
apoptozy prowadzić może do nowotworów i chorób autoimmunologicznych, a zbyt 
intensywna apoptoza może powodować choroby neurodegeneracyjne np. chorobę 
Alzheimera. 
Programowana śmierć komórki podobna do apoptozy: kondensacja chromatyny w stopniu 
słabym, zwykle niezależna od kaspaz. 

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki 
 

 

13

Programowana śmierć komórki podobna do nekrozy: brak kondensacji chromatyny. 
Autofagia: samotrawienie. 
Mitotyczna katastrofa: defektywne punkty kontrolne cyklu komórkowego po uszkodzeniach 
DNA, co prowadzi do aneuploidalnych komórek. 
4. Przebieg nekrozy (martwicy): 
Niekorzystne czynniki zewnętrzne w krótkim czasie (minuty) powodują zaburzenia 
homeostazy grupy komórek: następuje utrata selektywnej przepuszczalności błony, co 
powoduje napływ wody i jonów (głównie wapnia i sodu). W wyniku napływu wody następuje 
pęcznienie cytoplazmy i organelli, a wysoki poziom jonów wapnia indukuje nukleazy. 
Dochodzi do chaotycznego cięcia DNA, a pęcznienie komórki prowadzi do przerwania 
ciągłości błony komórkowej, a z pękających lizosomów wydostają się hydrolazy, które 
degradują białka, RNA i DNA. Rozpad komórek wywołuje odpowiedź układu 
immunologicznego i rozwinięcie procesu zapalnego. 
5. Przebieg apoptozy: 
Apoptoza może być inicjowana przez brak czynników wzrostu, hormony i cytokiny (TNF-
alfa i TGF-beta) poprzez aktywację receptorów błonowych oraz przez czynniki cytotoksyczne 
(chemioterapeutyki) i fizyczne (promieniowanie UV i gamma: uszkodzenia DNA), które 
indukują kaskadę zmian morfologicznych i biochemicznych. Zmiany morfologiczne obejmują 
zaburzenie asymetrii błony komórkowej, obkurczanie cytoplazmy i organelli, kondensację a 
potem fragmentaryzację chromatyny oraz uwypuklanie błony komórkowej, które tworzą 
pęcherzyki zawierające fragmenty cytoplazmy i jądra. Powstałe w ten sposób ciałka 
apoptotyczne fagocytowane są przez sąsiadujące komórki lub makrofagi, co nie wywołuje 
odczynu zapalnego. 
6. Porównanie apoptozy i nekrozy: 
                            Apoptoza                                                            Nekroza                      

 

7. C. elegans – modelowy organizm do badań nad programowaną śmiercią komórek: 
C. elegans posiada przeźroczyste ciało zbudowane tylko z 1090 komórek somatycznych, z 
których dokładnie 131 ulega zaprogramowanej śmierci w trakcie rozwoju tego robaka. 
Poszukiwanie genów odpowiedzialnych za ten proces zaowocowało na początku lat 90-tych 
odkryciem molekularnego mechanizmu programowanej śmierci komórki, w której kluczową 
rolę pełni proteaza Ced-3, nazwane później kaspazą. Kaspaza Ced3 jest aktywowana przez 
przyłączenie białka Ced-4. Jednak w normalnych warunkach białko Ced-4 samo pozostaje 
nieaktywne, bo przyłączony jest do niego inhibitor Ced-9. Program samobójczej śmierci jest 
aktywowany przez aktywację transkrypcji białka Egl-1, który inhibuje Ced-9, który nie może 

• 

Proces aktywny zależny od ATP 

• 

Utrata homeostazy jonów 

• 

Obkurczanie komórki 

• 

Asymetria błony komórkowej przy 
zachowaniu integralności 

• 

Obkurczanie cytoplazmy, organelle nie 
pękają 

• 

Kondensacja chromatyny, specyficzna 
fragmentacja DNA 

• 

Pęcznienie mitochondriów, spadek 
potencjału błon mitochondrialnych 

• 

Rozpad komórki na ciałka apoptotyczne 

• 

Fagocytoza przez komórki sąsiadujące i 
makrofagi 

• 

Brak odczynu zapalnego 

• 

Obejmuje pojedyncze komórki 

• 

Proces pasywny, niezależny od ATP 

• 

Proces regulowany i enzymatyczny 

• 

Pęcznienie komórki 

• 

Utrata integralności, zwiększona 
przepuszczalność 

• 

Pęcznienie cytoplazmy, dezintegracja 
organelli 

• 

Dezintegracja jądra, niespecyficzna 
degradacja DNA 

• 

Pęcznienie i pękanie mitochondriów, 
mitochondria niefunkcjonalne 

• 

Liza komórki. Brak ciałek apoptotycznych 

• 

Fagocytoza resztek komórki przez makrofagi 
i komórki żerne 

• 

Odczyn zapalny  

• 

Obejmuje całe grupy komórek 

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki 
 

 

14

dalej inhibować Ced-4, który może zaktywować kaspazę Ced-3. W normalnych warunkach 
ekspresja Egl-1 jest hamowana przez białko TRA-1A. 
8. Porównanie mechanizmu programowanej śmierci komórek u C. elegans i ssaków: 
Późniejsze badania wykazały, że wyższe organizmy – ssaki  posiadają po kilka kaspaz, które 
są aktywowane przy udziale białek adapterowych Apaf-1 i FADD, które są odpowiednikami 
białka Ced-4. Również zidentyfikowano homologi białek Ced-9 (Bcl-2) i Egl-1 (Bax, Bik), 
które również pełnią funkcje anty- lub proapoptotyczne. 
9. Szlaki sygnalizacyjne apoptozy: 
Wyróżniamy dwa szlaki sygnalizacyjne aktywujące apoptozę u drożdży: szlak zewnętrzny 
zależny od błonowych receptorów śmierci oraz szlak wewnętrzny oparty na wycieku 
cytochromu c z mitochondrium do cytoplazmy, co indukuje tworzenie apoptosomu. 
Aktywacja obu szlaków umożliwia autoaktywację kaspaz inicjujących, które aktywują 
następnie kaspazy fazy wykonawczej apoptozy. 
10. Kaspazy to proteazy, które inicjują apoptozę i warunkują nieodwracalność tego 
procesu: 
Proteazy hydrolazy peptydowe, które przecinają wiązanie peptydowe na końcach białek 
(egzopeptydazy) lub wewnątrz polipeptydu (endopeptydazy). Endopeptydazy są dzielone 
według biorącego udział w katalizie aminokwasu z centrum aktywnego enzymu. Kaspaza jest 
proteazą cysteinową, która specyficznie przecina wiązanie peptydowe od strony karbosylowej 
reszty kwasu asparaginowego (caspase: cysteine-dependent aspartate specific protease). 
11-13. Struktura kaspazy: 
Kaspazy są syntetyzowane jako nieaktywne prekursory – zymogeny (prokaskazy). Kaspazy są 
aktywowane przez proteolityczne cięcie za specyficznymi resztami kwasu asparaginowego w 
wyniku autoproteolizy lub przez inne kaspazy. W wyniku cięcia powstaje duża (p20) i mała 
podjednostka (p10), które w wyniku tetrameryzacji tworzą centrum aktywne proteazy. 
Kaspazy inicjujące: kaspaza 8, 9 i 10 
Kaspazy efektorowe: kaspaza 3, 6 i 7 
Kaspazy nieapoptotyczne – aktywatory cytokin: kaspaza 1, 4, 5, 11, 12, 13, 14 
Na N-końcu prokaspaz znajduje się prodomena, która jest odcina podczas aktywacji. 
Prodomena może być bardzo krótka lub zawierać motywy DED (death effector domain) lub 
CARD (caspase recruitment domain), które biorą udział w interakcjach z białkami 
adaptorowymi i między prokaspazami, co umożliwia zajście aktywacji prokaspazy. 
Mechanizm aktywacji polega na zbliżeniu monomerów przez indukujące apoptozę kofaktory i 
utworzenie homodimeru, co indukuje autoproteolizę albo też kofaktory indukują zmiany 
konformacyjne w prekursorach kaspaz, co indukuję autokatalizę.  
Homologi kaspaz odkryto także u organizmów jednokomórkowych: bakterii, pierwotniaków i 
grzybów, ale ich funkcja oraz możliwość wystąpienia u nich samobójczej śmierci jest 
dyskusyjna i bardzo kontrowersyjna. 
14. Substraty kaspaz: 

•  Prekursory kaspaz wykonawczych: prokaspaza 3, 6, 7 
•  Białka proapoptotyczne: Bid 
•  Białka, które hamują apoptozę: Bcl-2, Bcl-xL, ICAD (inhibitor CAD – nukleaza 

aktywowana przez kaspazy) 

•  Rozkład struktur komórkowych: laminy (prowadzi to do kondensacji chromatyny), 

gelzolina (aktywna forma po cięciu rozkłada filamenty aktynowe) 

•  Inaktywacja białek związanych z naprawą DNA (PARP, DNA-PK), replikacją (RFC), 

splicingiem, regulacją cyklu komórkowego i transkrypcji 

 
 

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki 
 

 

15

15. Szlaki sygnalizacyjne apoptozy – szlak zewnętrzny indukowany przez receptory 
śmierci: 
Receptory  śmierci należą do rodziny receptorów czynnika nekrozy TNF; składają się z 
zewnątrzkomórkowej domeny bogatej w cysteiny oraz wewnątrzkomórkowej domeny śmierci 
(DD – death domain). Przyłączenie do receptora odpowiedniego ligandu indukuje 
trimeryzację receptora. Receptory śmierci po trymeryzacji mogą przyłącząć w cytoplazmie 
białka adaptorowe: od razu FADD (Fas associated death  domain) lub FADD a potem 
TRADD (TNFR1-associated death domain) poprzez interakcję między domenami śmierci DD 
obecnymi w receptorach i białkach adapterowych, a powstałe kompleksy nazywamy 
kompleksami sygnałowymi indukującymi śmierć: DISC (death inducing signaling complex). 
FADD zawiera jeszcze inną domenę DED (death effector domain), poprzez którą przyłącza i 
aktywuje kaspazy inicjujące (kaspaza 8) zawierające również domenę DED. Zgromadzenie 
przy receptorze białek adapterowych umożliwia jednocześnie przyłączenie i zbliżenie do 
siebie prokaspazy inicjujących, co indukuje ich autoaktywację. Szlak ten ma znaczenie dla 
homeostazy układu immunologicznego, eliminacji komórek zainfekowanych przez wirusy i 
komórek nowotworowych. 
16. Szlak wewnętrzny – mitochondrialny apoptozy: 
Aktywowany jest przez promieniowanie, czynniki uszkadzające DNA, związki 
cytotoksyczne, szok termiczny, wzrost stężenia reaktywnych form tlenu oraz przez brak 
czynników wzrostu. W wyniku nie do końca poznanego mechanizmu dochodzi do uwolnienia 
niezbędnego mitochondrium cytochromu c niezbędnego do utworzenia apoptosomu i 
aktywacji inicjującej prokaspazy 9. Oprócz cytochromu c uwalniane są z mitochondrium inne 
białka indukujące apoptozę: Smac/Diablo i HtrA2/Omi, które znoszą działanie inhibicyjne w 
kierunku kaspaz białka XIAP oraz endonukleaza G i czynnik indukujący apoptozę AIF, które 
to kierują się do jądra i w sposób pośredni lub bezpośredni przyczyniają się do degradacji 
DNA niezależnie od kaspaz. 
17. Tworzenie apoptosomu i aktywacja prokaspazy 9: 
Uwolniony cytochrom c z mitochondrium do cytoplazmy przyłącza się do C-końcowej 
domeny WD40 białka Apaf-1, co indukuje zmianę konformacji tego białka i odsłonięcie 
miejsca przyłączenia dATP w białku Apaf-1. Przyłączenie dATP do Apaf-1 indukuje 
oligomeryzację siedmiu cząsteczek białka Apaf-1 poprzez N-końcowe domeny CARD, co w 
efekcie daje kompleks apoptosomu. Do apoptosomu poprzez domenę CARD mogą się teraz 
przyłączać prokaspazy 9, co inicjuje ich autokatalizę i aktywację. 
18. Inne proteazy biorące udział w apotozie niezależnie od kaspaz – szlak ceramidowy: 
Aktywacja receptora śmierci TNF-R1 powoduje aktywację sfingomielinazy i ceramidazy; w 
wyniku rozpadu sfingomieliny powstaje fosforan choliny i ceramid, z którego powstaje 
sfingozyna, która akumuluje się w lizosomach i indukuje ich rozpad, co uwolnia do 
cytoplazmy proteazy katepsyny. Katepsyny mogą też być uwolnione po permealizacji błony 
lizosomów przez fosfolipazę A2 (PLA2; degraduje fosfolipidy) aktywowaną przez reaktywne 
formy tlenu. 
19. Współdziałanie szlaku zewnętrznego i wewnętrznego apoptozy: 
Indukcja szlaku zewnętrznego za pośrednictwem receptorów śmierci może też zaktywować 
szlak wewnętrzny apoptozy zależny od mitochondriów, co dodatkowo wzmacnia apoptozę 
indukowaną z zewnątrz. Dzieje się to za pomocą białka Bid (z rodziny Bcl-2), które jest cięte 
przez kaspazę 8, a skrócona forma tego białka – tBid indukuje wyciek cytochromu c z 
mitochondriów. 
20. Negatywna regulacja procesu apoptozy: 
Antyapoptotyczne czynniki wzrostu i cytokiny aktywują specyficzne szlaki sygnalne np.  
szlak zależny od kinazy Akt, która inhibuje czynniki transkrypcyjne indukujące ekspresję np. 
ligandów dla receptorów śmierci; kinaza Akt inhibuje także proapoptotyczne białko Bad 

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki 
 

 

16

przez jego sekwestrację poprzez białko 14-3-3. Inny mechanizm to aktywacja czynnika 
transkrypcyjnego NF-kB, który aktywuje ekspresję białka hamującego apoptozę IAP, które 
bezpośrednio przyłącza się do kaspaz 3, 7 i 9, co hamuje ich aktywność. Czynniki wzrostu 
mogą też aktywować białko Bcl-2, które jest jednym z głównych antyapoptotycznych 
regulatorów w komórce. 
21-22. Antyapoptotyczne białko Bcl-2: 
W 1986 r. wykryto, że komórki białaczkowe mają często translokację t(14,18), w wyniku 
której onkogen Bcl-2 (B-cell leukemia/lymphona) zostaje przeniesiony z chrom. 14 na 18, 
gdzie podlega silniejszej aktywacji ekspresji. W 1988 r. stwierdzono, że białko Bcl-2 inhibuje 
apoptozę i posiada domenę transbłonową, która lokalizuje to białko w zewnętrznej błonie 
mitochondrialnej. W 1993 roku pokazano, że Bcl-2 tworzy heterodimery z białkami z tej 
samej rodziny, ale o działaniu pro-apoptotycznym. Antyapoptotyczny mechanizm działania 
Bcl-2 polega na: inhibicji białek proapoptotycznych np. Bax, przyłączaniu i inaktywacji 
białka Apaf-1, inhibicji syntezy reaktywnych form tlenu oraz hamowaniu wypływu 
cytochromu c z mitochondrium do cytoplazmy. 
Białko Bcl-2 należy rodziny białek zawierających charakterystyczne domeny BH (Bcl-2 
Homology domain). Do tej rodziny należą zarówno białka pro- i antyapoptotyczne. 
Wyróżniamy trzy podrodziny w tej grupie: białka proapoptotyczne zawierające tylko jedną 
domenę BH i nie zawierające domeny transbłonowej (Bim, Bid, Bad, Puma, Noxa), białka 
antyapoptotyczne typu Bcl-2 zawierające cztery domeny BH (Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1) oraz 
białka proapoptotyczne podobne do białka Bax (Bax, Bak) posiadające trzy domeny BH. 
23. Pozytywna regulacja procesu apoptozy: 

•  Inhibicja czynnika hamującego apoptozę IAP przez Smac/Diablo (przyłącza i inhibuje 

IAP) oraz proteazę serynową Omi/HtrA2 (przyłącza i degraduje IAP) 

•  Aktywacja proapoptotycznych białek z rodziny Bcl-2 (translokacja do błon 

mitochondrialnych, oligomeryzacja i ułatwianie/indukowanie wypływu cytochromu c 
z mitochondriów) 

•  Hamowanie antyapoptotycznych białek Bcl-2/Bcl-xL przez Puma, Noxa i Bid 

24. Regulacja apoptozy przez białko p53: 
Mechanizm zależny od transkrypcji: w wyniku uszkodzeń DNA białko p53 ulega stabilizacji i 
aktywuje ekspresję genów kodujących białka proapoptotyczne Bax, Bid, Puma, Noxa, Apaf-
1, kaspazę 6, receptory śmierci Fas i DR5, ligand dla Fas (TNFSF6), PTEN i FDXR lub 
hamowanie ekspresji, np. IAP.  
Mechanizm niezależny od transkrypcji: szybka (wcześniej niż aktywacja transkrypcji) 
redystrybucja p53 do mitochondriów i promowanie uwolnienia cytochromu c do cytoplazmy 
poprzez tworzenie kompleksów z anty-apoptotycznymi białkami Bcl-2 i Bcl-xL oraz poprzez 
bezpośrednią aktywację pro-apoptotycznych białek Bax i Bak; p53 w podobny sposób może 
też działać w cytoplazmie. 
25. Mechanizm wypływu cytochromu c – antagonistyczne działanie białek rodziny Bcl-2: 
Zaproponowano kilka hipotez wyjaśniających uwolnienie cytochromu c po indukcji apoptozy: 
A: VDAC + Bax = połączenie białka Bax z kanałem anionowym zależnym od napięcia 
VDAC tworzy nowy większy por, przez który wychodzi cytochrom c, 
B: Zamknięcie kanału VDAC skutkuje zaburzeniem homeostazy ATP/ADP, co powoduje 
permealizację błony mitochondrialnej. 
C: Interakcje Bax z białkami błony mitochondrialnej indukuje utworzenie megakanału PTP – 
permeability transition pore, który składa się kanału anionowego VDAC w błonie 
zewnętrznej mitochondrium, białka ANT (translokaza nukleotydów adeninowych w błonie 
wewnętrznej), cyklofiliny D z matrix, kinazy kreatyninowej z przestrzeni międzybłonowej 
oraz cytosolowej heksokinazy. Według tej hipotezy otwarcie megakanału powoduje spadek 
potencjału błony mitochondrialnej, zaburzenie homeostazy jonowej mitochondrium, co 

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki 
 

 

17

prowadzi do puchnięcia mitochondrium i przerwania ciągłości błony mitochondrialnej i 
uwolnienia cytochromu c. 
D: W wyniku oligomeryzacji Bax i Bak w błonie mitochondrialnej powstają kanały, przez 
które wycieka cytochrom c. 
E: Wzrost ilości ROS i jonów wapnia może zaburzać działanie kanału VDAC (permealizacja 
błony) i powodować  pęcznienie matriks (wyciek cytochromu c). Mechanizm wzrostu ilości 
ROS jest nieznany. ROS powodują także peroksydację lipidów, w tym kardiolipiny, z którą 
związany jest cytochrom c w błonie wewnętrznej mitochondriów, co wydaje się przyczyniać 
do uwolnienia cytochromu c. 
26-27. Apoptoza – fakty i mity: 

•  Mechanizm uwolnienia cytochromu c z mitochondriów jest nieznany, nie wiadomo 

jaką drogą jest uwalniany 

•  Nie wiadomo czy megakanał mitochondrailny PTP w ogóle istnieje 
•  Zamknięcie a nie otwarcie VDAC sprzyja uwolnieniu cytochromu c 
•  Wypływ cytochromu c następuje przed otwarciem PTP (permealizacją) i spadkiem 

potencjału błonowego mitochondrium 

•  Wydaję się,  że wypływ cytochromu c może być zależny od wcześniejszej aktywacji 

kaspaz i tworzenie apoptosomu może być niezbędne tylko do przyspieszenia śmierci; 
może to być tylko kolejny marker apoptozy, który nie jest absolutnie niezbędny do 
zabicia komórki: brak Apaf-1 u samic, które przeżywają, nie powoduje zaburzeń, a u 
samce są niepłodne, większość zwierząt nie przeżywa, ze względu na na zaburzenia 
rozwoju mózgu - nadmiar komórek nerwowych; w innych tkankach brak Apaf-1 lub 
brak przyłączania cyt. c do Apaf-1 opóźniał, ale nie blokował apoptozy.

 

Myszy 

pozbawione czynnika indukującego apoptozę AIF umierają podczas embriogenezy, 
ale bez objawów nadmiaru komórek 

•  Inne mutanty białka AIF (myszy arlekin) są bardziej wrażliwe na apoptozę niż oporne, 

za to są bardzo wrażliwe na stres oksydacyjny – fizjologiczna rola AIF polega na 
formowaniu kompleksu I w łańcuchu oddechowym 

•  Brak endonukleazy G nie powoduje zaburzeń apoptozy 
•  Wydaje się, że uwolnienie AIF i Endo G jest wydarzeniem późnym, następującym po 

aktywacji kaspaz 

•  Brak ANT czy cyklosporyny A składników PTP nie zaburza apoptozy 
•  Delecja Smac/Diablo i Omi/HTrA2 nie powodują zaburzeń apoptozy; knockout 

Omi/HtrA2 jest nawet bardziej wrażliwy na apoptozę, a ponadto obserwuje się 
neuropatie związane z zaburzeniami funkcjonowania mitochondriów; funkcja 
fizjologiczna Omi/Htr2A polega na niszczeniu lub naprawianiu białek o złej 
konformacji 

Wniosek: szlak mitochondrialny apoptozy może tylko wzmacniać i przyspieszać apoptozę i 
nie jest jej głównym i absolutnie koniecznym induktorem. 
 

1. Metody wykrywania apoptozy. Apoptoza u drożdży. 

2. Metody wykrywania apoptozy: 

1.  Obserwacja mikroskopowa (kurczenie komórek, tworzenie ciałek apoptotycznych, 

rozpad jądra, kondensacja chromatyny) 

2.  Utrata zdolności do usuwania barwników z komórek (propydylek jodu, trypan blue) 
3.  Fragmentacja DNA 
4.  Wykrywanie fosfatydyloseryny na powierzchni komórek 
5.  Wykrywanie nadprodukcji reaktywnych form tlenu 
6.  Utrata potencjału błony mitochondrialnej 

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki 
 

 

18

7.  Uwolnienie cytochromu c z mitochondriów do cytoplazmy (analiza Western blot 

frakcji mitochondrialnej i cytosolowej) 

8.  Wykrywanie cięcia prokaspaz (Western blot) 
9.  Wykrywanie enzymatycznej aktywności kaspaz 
10. Wykrywanie cięcia substratów dla kaspaz (PARP, laminy, ICAD) 

3. Obserwacja morfologii jądra komórkowego: 
DNA jądrowe znakowane jest barwnikiem np. DAPI, który świeci na niebiesko w świetle 
UV. W ten sposób można zobaczyć czy jądro stanowi jedną całość czy uległo fragmentacji. 
4. Utrata zdolności do usuwania barwników z komórek (propydylek jodu - PI): 
Żywe komórki nie akumulują niektórych związków, takich jak propydylek jodu, który świeci 
na czerwono w mikroskopie fluorescencyjnym. Tylko martwe komórki – nekrotyczne lub 
apoptotyczne z objawami nekrozy świecą na czerwono. 
5. Wizualizacja cięcia DNA na fragmenty o różnej długości za pomocą elektroforezy 
agarozowej (obraz drabinki DNA): 
Po indukcji apoptozy aktywowane są endonukleazy, które tną DNA najpierw na duże 
fragmenty o długości 200-300 tys. pz i 20-50 tys. pz, a potem między nukleosomami na 
fragmenty o długości DNA nukleosomowego lub ich wielokrotności (180-200 pz). Za 
tworzenie tych krótszych fragmentów odpowiedzialna jest endonukleaza CAD/DFF40, która 
w normalnych warunkach hamowana jest przez białko ICAD/DFF45, które jest cięte przez 
kaspazy wykonawcze. DNA cięte w wyniku apoptozy dają charakterystyczny obraz drabinki 
w elektroforezie. 
6. Wykrywanie złamań DNA za pomocą metody TUNEL: 
TUNEL: Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP Nick-End Labeling. 
Metoda ta służy do wykrywania fluorescencyjnie złamań DNA. Końce 3’-OH złamań 
wykrywane są przez dodawanie do nich wyznakowanych fluorochromem deoksynukleotydów 
(np. dUTP-FITC) za pomocą terminalnej deoksynukleotydylotransferazy (TdT). Sygnał 
fluorescencyjny może być wykryty przez cytometrię przepływową lub w mikroskopie 
fluorescencyjnym. 
7. Wykrywanie fosfatydyloseryny na powierzchni komórek apoptotycznych: 
Przemieszczenie fosfatydyloseryny (PS) z wewnętrznej do zewnętrznej warstwy błony 
komórkowej (asymetrię  błony zapewnia flipaza, która jest inaktywowana przez kaspazy; 
jednocześnie aktywowana jest skramblaza/flopaza, która przemieszcza PS na zewnątrz błony 
komórkowej). PS jest rozpoznawana przez receptor PSR na makrofagach; dodatkowo 
apoptotyczne komórki wydzielają lizofofatydylocholinę, która stanowi chemoatraktant dla 
komórek  żernych. Do PS łatwo przyłącza się białko aneksyna V, która po wyznakowaniu 
fluorochromem służy do wykrycia w mikroskopie lub cytometrii przepływowej wykrycia PS 
na powierzchni komórek. 
8. Wykrywanie obecności reaktywnych form tlenu (ROS): 
Zwiększoną produkcję ROS w komórkach można wykrywać za pomocą dihydrorodaminy 
123, która sama nie jest związkiem fluorescencyjnym, ale po utlenieniu przez ROS 
przekształca się we fluorescencyjny związek rodaminę 123, która wyznakowuje komórki po 
podwyższonym ROS. 
9. Utrata potencjału błony mitochondrialnej: 
Normalne mitochondria akumulują rodaminę 123, która nadaje komórkom wysoki poziom 
fluorescencji. W przypadku obniżenia potencjału błonowego rodamina wypływa do 
cytoplazmy i słabo wchodzi do mitochondriów, co powoduje, że rodaminę 123 można łatwo 
wypłukać z komórek i obniżyć ich fluorescencję. Zatem komórki apoptotyczne charakteryzują 
się obniżoną fluorescencją po inkubacji z rodaminą 123. 

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki 
 

 

19

10. Wykrywanie cięcia prokaspaz (Western blot): 
Autoaktywację kaspaz można wykrywać sprawdzając za pomocą elektroforezy białkowej i 
analizy Western, czy pojawią się podjednostki mała i duża kaspaz powstałych w wyniku 
cięcia danej prokaspazy. 
11-12. Wykrywanie enzymatycznej aktywności kaspaz: 
Aktywne kaspazy rozpoznają jako substrat inhibitor w postaci peptydu VAD (walina-alanina-
kwas asparaginowy) połączonego z fluorochromem (FITC) oraz z fluorometyloketonem 
(FMK); FMK kowalencyjnie łączy się z cysteiną w centrum aktywnym kaspazy, co trwale 
inhibuje jej aktywność enzymatyczną, a jednocześnie wyznakowuje komórki fluoresceiną, 
która nie może być teraz wypłukana z komórek, gdyż jest na stałe związana z kaspazami; 
ester metylowy reszcie kwasu asparaginowego zapewnia łatwe wnikanie inhibitora do 
komórek. Stosując podwójne barwienie z użyciem inhibitorów kaspaz i propydylku jodu 
można wyróżnić cztery populacje komórek: populację A – żywe komórki (brak barwienia), B 
– wczesne apoptotyczne komórki (wyznakowane tylko FITC), C- późne apoptotyczne 
komórki (wyznakowane FILC, ale już martwe w wyniku apoptozy), populacja D- komórki 
nekrotyczne (wyznakowane tylko propydylkiem jodu, brak aktywności kaspazowej). 
13-15. Apoptoza u drożdży: 
U drożdży można zaobserwować  śmierć komórki z objawami apoptozy w odpowiedzi na 
kilka czynników stresowych: 

•   szok osmotyczny (1.5 M NaCl) 
•   prom. UV (90-120 J/m2) 
•   wysokie stężenie feromonu 

α 

•   chronologicznie stare komórki i hodowle 
•   stres oksydacyjny (H2O2) 
•   obniżenie pH (kwas octowy). 

Obserwowanymi objawami apoptozy było: kondensacja chromatyny, fragmentacja jądra, 
wykrywanie złamań DNA metodą TUNEL,

 

utrata asymetrii błony komórkowej (PS po 

stronie zewnętrznej) oraz wzrost produkcji ROS.  
Jednak obecność programowanej samobójczej śmierci u organizmu jednokomórkowego 
wydawała się wątpliwa, gdyż nie ma ani fizjologicznego uzasadnienia dla takiej śmierci, bo 
oznacza ona koniec organizmu (apoptoza u ssaków jest tylko elementem homeostazy 
organizmu wielokomórkowego), ale także nie były znane żadne homologi znanych białek 
pro- czy antyapoptotycznych u drożdży. 
16-17. Odkrycie aktywności kaspazy u drożdżowej proteazy Yca1 podobnej do ludzkich 
kaspaz: 
Przełomowe wydawało się odkrycie homologa kaspazy u drożdży na podstawie 
wyrafinowanych metod porównywania sekwencji białkowych. Okazało się,  że u wielu 
niższych organizmów, w tym u drożdży, zidentyfikowano całą rodzinę białek podobnych do 
ssaczych kaspaz, które nazwano metakaspazami. Homologia między tymi białkami była 
niewielka, ale absolutnie konserwatywne były reszty aminokwasowe tworzące centrum 
aktywne ssaczych kaspaz: cysteina i histydyna. 
Potem eksperymentalnie potwierdzono, że drożdżowa metakaspaza Yca1 wydaje się ulegać 
aktywacji po indukcji stresem oksydacyjnym i pojawianie się takich markerów apoptozy jak 
złamania DNA i produkcja ROS zależało od obecności w komórkach tego enzymu. Ponadto 
brak białka Yca1 zwiększało przeżywalność komórek po stresie oksydacyjnym. Do 
wykazania aktywności kaspazy Yca1 zastosowano klasyczne metody używane w badaniu 
apoptozy u ssaków. 

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki 
 

 

20

18. Zaproponowany mechanizm apoptozy u drożdży: 
Różne czynniki stresowe o niskim natężeniu indukują wzrost ROS, który w nieznany sposób 
aktywuje kaspazę Yca1, która indukuje aktywację apoptozy poprzez fragmentowanie DNA, 
kondesancję chromatyny, co prowadzi do śmierci. 
19-20. Inaktywacja Cdc13p indukuje apoptozę zależną od kinazy Mec1:  
Białko Cdc13 u drożdży jest przyłączone do telomerów i w ten sposób chroni je przed 
rozpoznawaniem ich jako złamań DNA. Komórki z mutacją punktową cdc13-1 są normalne, 
ale po przeniesieniu ich do wyższej temperatury (37°C) dochodzi do odłączenia białka cdc13 
od telomerów, co aktywuje szlak sygnalny zależny od kinazy Mec1, który indukuje 
zatrzymanie cyklu komórkowego w fazie G2/M, a potem śmierć. Niedawno na podstawie 
wzrostu ilości ROS mierzonej barwieniem dihydrorodaminą 123 oraz znakowania inhibitorem 
kaspaz FIC-VAD-FMK wysunięto wniosek, że  śmierć mutanta cdc13-1 zachodzi drogą 
apoptozy. Wykazano jednak później,  że wszystkie zastosowane metody produkują 
nieprawdziwe wyniki i wcale nie mierzą rzeczywistych procesów apoptotycznych, a same 
komórki umierają w zupełnie inny sposób (patrz niżej). 
21-22. Dowody na brak roli kaspazy Yca1 w indukowaniu śmierci komórek cdc13-1: 
- inhibitor kaspaz FITC-VAD-FMK akumulowany jest zarówno przez pojedyncze mutanty 
cdc13-1 jak i podwójne cdc13-1 yca1 mutanty pozbawione metakaspazy Yca1 
- delecja genu metakaspazy YCA1 nie hamuje śmierci komórek cdc13-1 w temp. 37°C. 
23-26. Dowody na to, że komórki drożdży niespecyficznie przyłączają fluorochromy i 
inhibitory kaspaz: 
- aktywacja kaspazy w komórkach cdc13-1 nie występuje w komórkach nieprzepuszczalnych 
dla PI w temp. 37

o

C, zatem aktywacja kaspazy nie poprzedza śmierci komórek. 

- dodanie inhibitora kaspaz Z-VAD-FMK nie hamowało akumulacji FITC-VAD-FMK w 
komórkach cdc13-1, ani nie opóźniało śmierci komórek. 
- martwe komórki cdc13-1 niespecyficznie przyłączają inhibitor kaspaz FITC-DEVD, jak 
również same fluorochromy FITC czy fluoresceinę. 
- komórki drożdży zabite wysoką temperaturą (80°C) akumulują inhibitor kaspaz FITC-VAD-
FMK. 
27-31. Rola ROS w uśmiercaniu mutanta cdc13-1: 
Stwierdzono,  że następuje wzrost ilości ROS w żywych komórkach mutantach cdc13-1, co 
poprzedza jego śmierć, ale dodanie antyoksydanta w postaci N-acetylocysteiny (NAC) 
zmniejszające produkcję ROS, nie obniżało  śmiertelności komórek cdc13-1 w temp. 37

o

C. 

Oznacza to, że komórki cdc13-1 umierają niezależnie od obecności ROS. Ponadto 
stwierdzono frakcję komórek martwych o podwyższonej fluorescencji rodaminy 123, które 
nie znikało jednak po dodaniu NAC, co wskazywało znowu na niespecyficzne barwienie 
komórek martwych, co nie jest związane z aktywną produkcją ROS. Hipoteza ta została 
potwierdzono przez barwienie DHR123 komórek martwych. Okazało się, że komórki drożdży 
zabite wysoką temperaturą (80°C) wykazują niespecyficzny wzrost zielonej fluorescencji w 
obecności DHR123. Kolejny dowód na to, że mutant cdc13-1 nie umiera na skutek apoptozy 
indukowanej przez wzrost stężenia reaktywnych form tlenu: ekspresja antyapoptotycznego 
białka ssaków Bcl-xL zmniejszała produkcję ROS w komórkach cdc13-1, ale nie wpływało to 
na zwiększenie przeżywalności w temp. 37

o

C. 

31-32. Inaktywacja białka Cdc13p prowadzi do śmierci poprzez permanentne 
zatrzymanie cyklu komórkowego na granicy faz G2/osmotycznego. 
Komórki z dużym pączkiem potomnym stale rosną i stają się z czasem bardzo wrażliwe na 
pęknięcie w miejscu złączenia obu pączków. Dodanie osmotycznego stabilizatora zwiększało 
przeżywalność mutanta cdc13-1 inkubowanego w niepermisyjnej temperaturze 37

o

C, co 

potwierdza, że te mutanty umierają w wyniku pękania komórek, a nie apoptozy. 

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki 
 

 

21

33. Komórki drożdży niespecyficznie przyłączają fluorochromy i inhibitory kaspaz nie 
mogą być stosowane u drożdży: 
Zostało to potwierdzone przez niezależnych badaczy. 
34. Alternatywą dla inhibitora kaspaz u drożdży może być D2R (Asp-Rhodamina110-
Asp), ale wykrywamy tylko aktywność proteazową: 
Stosując związek D2R można wykrywać aktywność proteazową w komórkach drożdży bez 
niespecyficznego znakowania martwych komórek, bowiem D2R staje się związkiem 
fluorescencyjnym tylko w żywych komórkach po enzymatycznym odcięciu reszt kwasu 
asparaginowego. 
36. Metoda TUNEL też produkuje artefakty u drożdży: 
Czynniki „apoptotyczne” u drożdży nie indukują dwuniciowych pęknięć DNA. Okazało się, 
że metoda TUNEL u drożdży wykrywa pęknięcia pojedynczych nici DNA, a nie podwójnych 
tak jak u ssaków. 
37. Nowe odkrycia na temat „apoptozy” u drożdży: 
Zidentyfikowano drożdżowe homologi ludzkich anty- i proapoptotycznych białek oraz 
wykazano ich rolę w apoptozie u drożdży: np. Nma111 (HtrA2/OMI), Ndi1(AIF lub AMID), 
Dnm1 (Drp1), Fis1 (odpowiednik funkcjonalny Bcl-2), Bir1 (XIAP), a Bir1 jest substratem 
dla Nma111. Podczas apoptozy wywołanej stresem oksydacyjnym indukowana jest 
fosforylacja histonu H2B-Ser10, co niezbędne jest do kondensacji chromatyny i być może do 
degradacji DNA, ale proces ten jest niezależny od Yca1. Odkryto także regulowaną śmierć w 
centrum starej kolonii, ale niezależną od Yca1 i AIF. 
38. Apoptoza u drożdży: – fakt? – artefakt? – raczej brak na razie dostatecznych 
dowodów na istnienie apoptozy u drożdży: 
Apoptoza u drożdży ma na razie charakter czysto opisowy: opisywana jest apoptoza w 
różnych warunkach i u różnych mutantów. Brak jest w tej chwili dowodów molekularnych na 
istnienie regulowanego/zaprogramowanego szlaku śmierci. Nie wiadomo czy ROS są 
induktorem czy regulatorem programowanej śmierci. Nie zaobserwowano na razie 
jakiejkolwiek współdziałania między zidentyfikowanymi drożdżowymi homologami ludzkich 
białek proapoptotycznych. Nie wiadomo czy drożdżowych białka proapoptotyczne mają inne 
ważne funkcje poza apoptozą, a ich udział w apoptozie jest przypadkowy zgodnie z regułą 
„złe białko w złym miejscu”. W zdecydowanej większości publikacji metody wykrywania 
markerów apoptozy u ssaków zastosowana została bez stosownych kontroli, bez kalibracji, 
bez wiedzy, co daną metodą wykrywamy u drożdży. Nie wiadomo, w jaki sposób powstają 
markery apoptozy u drożdży i czy one są faktycznym powodem śmierci komórki (na czym 
polega faza zniszczenia, czy może cechy te tylko pojawiają podczas pewnych typów śmierci u 
drożdży. Nie wyznaczono tzw. „point of no return” dla apoptozy u drożdży i nie wiadomo czy 
cechy apoptotyczne są odwracalne. Brak dowodów, że metakaspaza Yca1 jest 
odpowiednikiem funkcjonalnym ludzkich kaspaz; nieznane są aktywatory, inhibitory i 
substraty dla Yca1, nie udało się wykazać aktywności kaspazowej in vitro, nie jest znana 
żadna rola fizjologiczna dla tej proteazy. Trudno zdefiniować rolę fizjologiczną samobójczej 
śmierci organizmu jednokomórkowego (usuwanie starych komórek z populacji, altruistyczna 
śmierć dla dostarczenia środków odżywczych, usuwanie komórek, które się nie krzyżują). Nie 
można wykluczyć regulowanej/programowanej śmierci u mikroorganizmów, ale nie musi ona 
zachodzić identycznie jak apoptoza u organizmów wielokomórkowych; lepszą strategią 
byłoby poznawanie tych procesów u drożdży bez bezkrytycznego i często na siłę 
odwoływania się do apoptozy. 

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki 
 

 

22

1. Degradacja białek. Lizosomy. Autofagia. Peroksysomy. 

2-3. Homeostaza komórki: 
Homeostaza komórki jest utrzymywana przez dokładnie regulowany mechanizm 
równoważenia syntezy i degradacji składników komórki. Białka o krótkim czasie półtrwania 
ulegają w cytoplazmie degradacji za pomocą systemu proteasomowego zależnego od 
ubikwityny; proces ten jest selektywny i odbywa się w cytosolu. Drugi mechanizm mniej 
selektywny zachodzi w lizosomach, gdzie znajdują się hydrolazy. Białka i inne długotrwałe 
składniki oraz całe organelle są trawione na drodze autofagii. 
4. Ubikwityna: 
Małe, obojętne białko, złożone z 76 aminokwasów o masie 8,6 kDa. Ubikwityna występuje u 
wszystkich eukariontów i wykazuje bardzo wysoką konserwatywność sekwencji, np. 
drożdżowa i ludzka ubikwityna różnią się tylko trzema aminokwasami. Ubikwityna 
zbudowana jest z jednej globularnej domeny, utworzonej z pięciu harmonijek β oraz jednej α-
helisy; rdzeń białka jest silnie hydrofobowy oraz kilka skupień apolarnych aminokwasów na 
powierzchni. Z powierzchni cząsteczki wystaje ogon zakończony C-terminalną glicyną, za 
pomocą której jest przymocowana do aktywującego enzymu E1, a potem do substratu 
białkowego. 
5. Funkcje ubikwitynacji: 

•  Poliubikwitynacja: sygnał do degradacji 
•  Monoubikwitynacja: 
-  Endocytoza (włączanie białek do błony komórkowej) 
-  Sortowanie białek 
-  Regulacja ekspresji (regulacja lokalizacji czynników transkrypcyjnych między jądrem 

a retikulum) 

-  Naprawa DNA i odpowiedź na uszkodzenia DNA (modyfikacja histonu H2B) 

6-7. Trzystopniowa reakcja ubikwitynacji: 
E1 – enzym aktywujący ubikwitynę (jeden enzym); najpierw przy udziale ATP powstaje 
ubikwitynoadenylan z wydzieleniem PPi, a następnie zaktywowana ubikwityna zostaje 
przeniesiona na grupę –SH cysteiny w enzymie E1 z wytworzeniem wiązania tioestrowego i 
uwolnieniem AMP. 
E2 – enzym przenoszący ubikwitynę na substrat (kilka enzymów, u drożdży 13 białek Ubc); 
enzym E2 przejmuje ubikwitynę z enzymu E1 w reakcji transestryfikacji. 
E3 – ligaza ubikwitynowa (setki enzymów o różnej specyficzności substratowej); pośredniczy 
w przeniesieniu ubikwityny z enzymu E2 na resztę lizyny w substracie; E3 rozpoznaje 
substrat jak i odpowiedni enzym E2; enzym E3 spełnia rolę tylko pomostu zbliżając do siebie 
substrat i enzym E2-Ub, a w przypadku białek E3 z domeną HECT przejmuje ubikwitynę z 
E2, a potem przenosi ją na substrat; na tym etapie dochodzi również do poliubikwitynacji; 
wyróżniamy cztery typy ligaz ubikwitynowych E3: rodzina HECT (domena HECT służy do 
przyłączenia enzymu E2-Ub, a drugim końcem przyłącza substrat, który jest rozpoznawany 
przez sekwencję-sygnał zwany degronem; rodzina RING (nazwa rodziny od 
charakterystycznej domenie rozpoznawanej przez enzym E2); oraz rodzin typu kulina i APC 
(zobacz wykład o regulacji cyklu komórkowego, gdzie oba kompleksy zostały omówione 
szczegółowo). 
8. Kompleks proteasomu 26S: 
Proteasom składa się z części korowej 20S zbudowanych z czterech pierścieni, każdy złożony 
z siedmiu podjednostek. Wnętrze cylindra stanowią domeny, które maja aktywność peptydaz. 
Z obu końców część korowa jest zamknięta jednostką regulacyjną 19S, złożoną z podstawy i 
wieczka. Rolą tej jednostki jest przyłączenie poliubikwitynowych substratów, odcięcie 
cząsteczek ubikwityny, rozwinięcie substratu oraz wciągnięcie do cylindra, gdzie peptyd 
ulega degradacji. 

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki 
 

 

23

9. Rodzina białek ubikwitynowych: 

•  Ubikwityna 
•  SUMO (Small Ubiquitin-related MOdifier), odkryte w 1996 r. jako kowalencyjna 

modyfikacja RanGEF, o indukuje jądrową lokalizację tego białka; u ssaków 4 
izoformy 

•  Nedd8 
•  ThiS: prokariotyczne białko przenoszące siarkę na organiczne kofaktory, np. tiaminę 
•  Atg8 i Atg12 biorą udział w reakcjach podobnych w mechanizmie do ubikwitynacji 

(podczas autofagii) 

10. Sumoilacja: 
Proces dodawania cząsteczki SUMO do białka zachodzi identycznie jako proces 
ubikwitynacji z udziałem specjalnych enzymów E1, E2 i E3, ale samo SUMO po syntezie 
musi ulec obróbce w postaci odcięcia C-końca, tak aby na końcu znajdowała się reszta 
glicyny, która bierze udział we wszystkich reakcjach przyłączania SUMO. 
11. Funkcje sumoilacji – inhibicja transkrypcji oraz kierowanie białek do jądra i do 
struktur subjądrowych np. do ciałek PML: 
SUMO blokuje inne modyfikacje np. ubikwitynację czy acetylację (brak degradacji lub 
interakcji z innymi białkami) albo prowadzi do zmian konformacyjnych w białku, co może 
też wpływać na jego interakcje z innymi białkami; np. na przykład SUMO może umożliwiać 
przyłączanie korepresorów. SUMO może też przyciągać deacetylazy histonowe HDAC, które 
przyczyniają się do kondensacji chromatyny i represji transkrypcji; HDAC może też 
promować sumoilację czynnika transkrypcyjnego przez usuwanie grupy acetylowej z lizyny 
na czynniku transkrypcyjnym; samo HDAC może ulegać aktywacji po sumoilacji. 
12. Lizosomy: 

•  Pęcherzyki o średnicy 0,2-1,0 µm, zbudowane z pojedynczej błony, w liczbie kilkaset 

na komórkę, zawierają kwaśne enzymy hydrolityczne w liczbie około 40-stu 

•  Występują u wszystkich eukariontów; brak u bakterii: kwaśna hydroliza odbywa się w 

przestrzeni między ścianą a błoną komórkową 

•  Wewnątrz lizosomów kwaśne pH 4.5-5,0 dzięki działaniu pomp protonowych 

zależnych od ATP: H+-ATPaza 

•  Funkcja: kontrolowane trawienie substancji odżywczych lub toksycznych 

pochodzących z zewnątrz komórki lub jej wnętrza; rozkład białek, wielocukrowców, 
lipoprotein, kwasów nukleinowych 

•  Enzymy: lipaza, sfingomielinaza, nukleazy, fosfatazy, katepsyny, galaktozydazy, 

galaktozaminidaza, itd. 

•  Same enzymy lizosomalne są chronione przed trawieniem przez glikolizację 
•  Strawione cząstki są wydalane do cytoplazmy 
•  Wyróżniamy lizosomy pierwotne (zawierające hydrolazy, ale bez substratów) i wtórne 

(lizosomy pierwotne po połączeniu z wakuolami autofagowymi lub endosomami i 
fagosomami) 

13-14. Formowanie lizosomów pierwotnych: 

•  Synteza nieaktywnych prekursorów enzymów lizosomowych na szorstkim retikulum 

endoplazmatycznym 

•  Nieaktywne enzymy są lokalizowane w świetle retikulum endoplazmatycznym, gdzie 

podlegają glikozylacji (dodawane są dwie reszty oraz 8 cząsteczek mannoz, a na 
końcu przy udziale fosfotransferazy do jednej z cząsteczek mannoz zostaje dodana 
fosfo-N-acetyloglukozoamina) 

•  Pęcherzyki zawierające enzymy odpączkowują od retikulum i kierują się do aparatu 

Golgiego 

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki 
 

 

24

•  Nieaktywne enzymy nabywają sygnał kierujący do lizosomów (N-

acetyloglukozoamina zostaje odcięta przez diesterazę i pozostaje mannowo-6-
fosforan, który jest sygnałem kierującym białka do lizosomów), łączą się z 
odpowiednim receptorem w cysternie Trans aparatu Golgiego i odpączkowują kierując 
się do lizosomów 

•  Po dostarczeniu enzymu do lizosomu enzym odłącza się od receptora na skutek 

obniżenia pH, a receptor wraca do aparatu Golgiego 

15. Formowanie lizosomów wtórnych: 
Lizosomy pierwotne przekształcają się w lizosomy wtórne po połączeniu z autofagosomem, 
fagosomem lub endosomem, a po strawieniu dostarczonych substratów lizosom przekształca 
się w ciałko resztkowe. 
16. Choroby związane z dysfunkcją lizosomów: 

•  Brak specyficznej hydrolazy prowadzi do wypełnienia lizosomów zagęszczonymi 

substancjami, co uniemożliwia normalne działanie lizosomów: 

-  mukopolisacharydozy (choroba Hurleya, deformacja kości) 
-  choroba wtrętów/inkluzji komórkowych spowodowana jest brakiem wielu hydrolaz w 

lizosomach; przyczyną choroby jest brak fosfotransferazy i na enzymach 
lizosomalnych w aparacie Golgiego nie powstaje znacznik Man-6-P, który kieruje 
wszystkie hydrolazy do lizosomów 

-  gangliozydaza Taya-Sachsa (brak heksozaminidazy, gangliozydy nagromadzają się w 

błonie komórkowej komórek mózgu; prowadzi to znacznych zaburzeń układu 
nerwowego: niedorozwój umysłowy, osłabienie mięśniowe, wiśniowa plamka oczna 
na siatkówce i postępujące niedowidzenie, śmierć następuje w ciągu 5 lat) 

-  Zidentyfikowano prawie 40 różnych dziedzicznych chorób związanych z dysfunkcją 

lizosomów 

17. Autofagia = samotrawienie: 

•  Jest to proces zależny od lizosomów/wakuoli, które zawierają szereg enzymów 

hydrolitycznych, co pozwala na degradację na ich terenie wszystkich składników 
komórkowych 

•  Mechanizm dostarczenia składników i organelli komórkowych do lizosomów w celu 

strawienia nazywamy autofagią 

•  Proces ten jest konserwatywny i występuje u wszystkich komórek eukariotycznych 
•  Indukowany jest przez:  
-  stres zewnętrzny: głównie przez brak substancji odżywczych (adaptacja do warunków 

głodowych; uzyskanie niezbędnych do przeżycia składników odżywczych) oraz inne 
czynniki stresowe (wysoka temperatura, zbyt dużo komórek, niedotlenienie) 

-  stres wewnętrzny: akumulacja uszkodzonych struktur i organelli (usuwanie 

uszkodzonych organelli i struktur zaburzających metabolizm) 

-  usuwanie wewnątrzkomórkowych patogenów (ograniczenie infekcji) 

18. Proces autofagii: 
Autofagia rozpoczyna się od tworzenia błonowej struktury preautofagosomalnej (PAS: pre-
autophagosomal structure), której pochodzenie i sposób formowania nie jest znane. Następnie 
PAS zaczyna się rozrastać i zawijać zamykając stopniowo fragment cytoplazmy z 
zawartością, w tym nawet całe organella, tworząc charakterystyczną strukturę fagoforu. 
Dokładny mechanizm tworzenia się fagoforu jest również słabo poznany i może przebiegać 
poprzez dołączanie małych pęcherzyków błonowych lub większych cystern do PAS. Kolejne 
stadium autofagii to autofagosom zbudowany z pęcherzyka z zamkniętym w środku 
fragmentem cytoplazmy. Ostatni etap autofagii to połączenie autofagosomu z lizosomem i 
utworzenie autofagolizosomu, w którym następuje trawienie zawartości komórkowej. 

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki 
 

 

25

19. Funkcje autofagii: 

•  Organizmy jednokomórkowe: przeżycie warunków głodowych 
•  Organizmy wielokomórkowe: 
-  Eliminacja nienormalnych struktur komórkowych 
-  Regulacja liczby komórek, rola w rozwoju i różnicowaniu 
-  Typ II programowanej śmierci komórki niezależnej od kaspaz 
-  Adaptacja do warunków głodowych 
-  Obrona przed patogenami 
-  Obrona przed komórkami nowotworowymi 
-  Umożliwia przeżycie noworodkom w okresie zaraz po urodzeniu, ale zanim 

rozpocznie się karmienie (szczególnie wrażliwe jest serce; noworodek mysi 
pozbawiony genu ATG5 umiera pierwszego dnia życia) 

-  Ochrona przed starzeniem (usuwanie uszkodzonych struktur; autofagia jest 

aktywowana przez dietę niskokaloryczną) 

20. Funkcje autofagii – obrona przed patogenami, czyli ksenofagia: 
Ksenofagia to trawienie wewnątrzkomórkowych patogenów (np. Mycobacterium tuberculosis 
lub Streptococcus grupyA) na drodze autofagii. Pojawienie się patogenu w cytoplazmie 
indukuje tworzenie autofagoforu wokół patogenów, które zostają strawione w później 
utworzonym autofagolizosomem. Patogen nie tylko zostaje unicestwiony, ale ksenofagia 
dostarcza także antygenów, które stymulują układ odpornościowy. W niektórych przypadkach 
zamknięcie patogenu w pęcherzyku autofagosomowym sprzyja namnażaniu bakterii. 
21. Autofagia jako mechanizm opóźniający starzenie: 
Rośliny pozbawione możliwości autofagii wykazują szybką utratę chlorofilu (chloroza), 
przyspieszone obumieranie liści, co wynika z konieczności dostarczenia składników 
odżywczych do nasion; w normalnych warunkach jest to znaczne opóźnione dzięki 
uzyskiwaniu składników na drodze autofagii. 
22. Skutki deregulacji autofagii: 

•  Choroby mięśni – niektóre dziedziczne miopatie spowodowane nagromadzeniem 

autofagowych wakuoli 

•  Choroby neurodegeneracyjne – brak usuwania agregatów białkowych 
•  Rozwijanie infekcji bakteryjnych i wirusowych: niektóre patogeny hamują 

dojrzewanie autofagosomu, który staje się miejscem namnażania patogenu 

•  Choroby wątroby spowodowane nadmierną autofagią 
•  Nowotwory: autofagia może ułatwiać przeżywanie komórek nowotworowych w 

warunkach głodowych (przy słabym ukrwieniu guza)  i usuwać uszkodzenia 
wynikające z chemoterapii – inaktywacja autofagii w późnym stadium guza miałyby 
tutaj efekt antynowotworowy; we wczesnym stadium nowotworu autofagia przyczynia 
się do redukcji guza. 

23. Typy autofagii: 

•  Makroautofagia – przebiega z utworzeniem autofagosomu 
•  Mikroautofagia – fragment cytoplazmy ulega sekwestracji bezpośrednio przez 

lizosom dzięki inwaginacjom błony lizosomowej 

•  Autofagia zależna od białek opiekuńczych – białka są dostarczane do lizosomów 

przez białka opiekuńcze, które rozpoznają receptory w błonie lizosomowej 

•  Peksofagia (tylko u drożdży)– autofagia peroksysomów, która może zachodzić na 

drodze mikro- (mikropeksofagia) lub makroautofagii (makropeksofagia) 

•  Mitofagia – autofagia mitochondriów 

24. Szlak Cvt u drożdży (cytoplasma to vacuole targeting): 
Mechanizm dostarczania aminopeptydazy I do wakuoli: prekursor Ape1 w cytoplazmie 
tworzy oligomer, do którego przyłącza się receptor kargo Atg19, a do niego przyłącza się 

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki 
 

 

26

adaptor Atg11; powstały kompleks Cvt indukuje powstawanie struktury preautofasomalnej 
PAS (mechanizm nieznany), a potem łączy się z Atg8 na powierzchni PAS znajdującym się 
przy wakuoli, co indukuje przyłączanie innych białek Atg i utworzenie pęcherzyka Cvt, który 
potem  łączy się z wakuolą. Po indukcji autofagii Atg11 indukuje tworzenie autofagosomu 
zamiast indukcji cvt. 
25. Indukcja autofagii – powstanie kompleksu ATG13-ATG1-ATG17-ATG11 oraz 
fosforylacja fosfatydyloinozytoli w błonie PAS: 
W normalnych warunkach kompleks ATG13-ATG1-ATG17-ATG11 nie może powstać, gdyż 
ATG13 jest utrzymywany w stanie hiperfosforylowanym, który uniemożliwia utworzenie 
tego kompleksu. Aby zmniejszyć ufosforylowanie ATG13, zaktywowana musi być 
specyficzna fosfataza, która jest jednak hamowana przez szlak sygnałowy TOR w 
normalnych warunkach. Dopiero brak pożywienia hamuje szlak TOR, co uaktywnia fosfatazę 
defosforylującą ATG13. Warunki głodowe indukują również związaną z PAS kinazę 
fosfatydyloinozytolową, która fosforyluje fosfatydyloinozytole w błonie PAS, co być może 
umożliwia przyłączanie białek, tzw. autofagin, warunkujących proces autofagii. 
26. Formowanie autofagosomu: 
Do utworzenia autofasomu niezbędne jest powstanie kompleksu Atg12-Atg5-Atg16 i 
aktywacja białka Atg8, a także ich inkorporacja do PAS. Powstanie kompleksu Atg12-Atg5-
Atg16 jest wieloetapowe i obejmuje reakcje podobne do ubikwitynacji, gdzie Atg12 jest 
najpierw aktywowane przez białko Atg7 (odpowiednik enzymu E1), potem Atg12 jest 
przeniesiony na białko Atg10 (odpowiednik E2), by w końcu połączyć się z Atg5. Do dimeru 
Atg12-Atg5 dołącza się Atg16, który wtedy łączy się z trzema innymi trimerami Atg12-Atg5-
Atg16. Ten wieloskładnikowy kompleks integruje się z błoną PAS. Aktywacja białka Atg8 z 
kolei rozpoczyna się od odcięcia C-końca przez proteinazę cysteinową Atg4. Atg8 przez 
nową C-końcową resztę glicyny łączy się z Atg7 (odpowiednik enzymu E1), potem Atg8 jest 
przeniesione jest na białko Atg3 (odpowiednik E2), by w końcu połączyć się z 
fosfatydyloetanolaminą w błonie PAS, prawdopodobnie przy udziale kompleksu Atg12-Atg5-
Atg16. Atg8 może być później odcinany z PAS, by zwiększyć jego pulę w cytoplazmie, co 
umożliwia jego wprowadzenie do innych pęcherzyków, które zapewniają rozrost PAS do 
autofasomu. 
27. Peroksysomy: 

•  Pęcherzyki o średnicy 0,2-1,0 µm, zbudowane z pojedynczej błony, zawierające 

oksydazy tworzące nadtlenek wodoru i katalazę oraz peroksydazę, które nadtlenek 
wodoru rozkładają 

•  Funkcje:  β-oksydacja kwasów tłuszczowych, katabolizm puryn, cykl glioksylanowy 

roślin (ciąg reakcji, w wyniku których dwuwęglowe reszty kwasu octowego - acetylo-
CoA przekształcają się w czterowęglowy kwas bursztynowy, co umożliwia 
przekształcanie tłuszczów w cukrowce; glioksysomy), synteza fosfolipidów eterowych 
– plazmalogen (składnik mieliny) i soli kwasów tłuszczowych; utlenianie toksycznych 
związków w wątrobie (np. utlenianie etanolu) 

•  Peroksysomy i glioksysomy nazywamy mikrociałami 

28. Enzymy peroksysomów: 
Podstawowe enzymy peroksysomów to oksydazy flawoproteinowe, które przy udziale tlenu 
utleniają szereg substratów. Produktem ubocznym jest toksyczny nadtlenek wodoru, który jest 
rozkładany do wody i tlenu przy udziale katalizy lub do samej wody przez peroksydazę, 
czemu towarzyszy utlenienie alkoholu lub aldehydu. 
29-30. Biogeneza peroksysomów: 
Długo niewyjaśnione pozostawało pochodzenie peroksysomów. Na endosymbiontyczne 
pochodzenie peroksysomów wskazywało to, że powstają przez podział istniejących 
peroksysomów, a specyficzne białka błony i matriks peroksysomów syntetyzowane są na 

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki 
 

 

27

wolnych rybosomach i transportowane są następnie do wnętrza peroksysomów. Peroksysomy 
mogą też być wytworem retikulum endoplazmatycznego, gdyż są otoczone tylko pojedynczą 
błoną, nie posiadają  własnego DNA i białka peroksysomowe nie mają specyficznych 
presekwencji kierujących i peroksysomowe nie ulegają  żadnym cięciom. Ostatnio 
udowodniono jak zachodzi biogeneza peroksysomów z retikulum. Do błony retikulum 
endoplazmatycznego włącza się białko Pex3, do którego przyłącza się następnie białko 
Pex19. Kompleks Pex3-Pex19 umożliwia powstanie pęcherzyka oraz import innych białek 
charakterystycznych dla peroksysomów do wnętrza tego pęcherzyka, co w końcu daje w pełni 
funkcjonalny peroksysom. Peroksysomy dzielą się przez podział, który polega na wydłużeniu 
dużego pęcherzyka i jego fragmentacji na kilka mniejszych, które potem rosną i z czasem 
dostarczony zostaje do nich komplet enzymów peroksysomalnych. 
31. Dysfunkcja peroksysomów: 
Adrenoleukodystrofia związana z chromosomem X: spowodowana akumulacją 
długołańcuchowych kwasów tłuszczowych w cytosolu; kwasy te nie są transportowane do 
wnętrza peroksysomów, gdzie są rozkładane; mutacja w genie ABCD1 kodującym ABC 
transportera, dla którego kwasy tłuszczowe są substratem; choroba charakteryzuje się 
degeneracją układu nerwowego. 
Choroba Zellwegera spowodowana jest redukcją lub brakiem funkcjonalnych peroksysomów 
w komórkach wątroby, nerek i mózgu. Wynika z braku peroksyny Pex2, która bierze udział w 
imporcie enzymów peroksysomalnych do pęcherzyków. Choroba objawia się tuż po 
urodzeniu zaćmą, torbielowatością rdzenia nerek, wadami serca, nieprawidłową mielinizacją 
włókien nerwowych nerwów obwodowych, deformacją czaszki opóźnionym rozwojem 
psychoruchowym, złogami wapniowymi w szpiku kostnym. Śmierć następuje w ciągu kilku 
tygodni lub miesięcy.