Naprawa DNA

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki

1. Naprawa DNA:

2. Źródła uszkodzeń DNA:
Wyróżniamy dwa źródła uszkodzeń DNA: endogenne uszkodzenia DNA wynikające z
błędów powstających w czasie replikacji DNA oraz stresu oksydacyjnego, którego źródłem
jest metabolizm tlenowy generujący reaktywne formy tlenu uszkadzające DNA; oraz czynniki
egzogenne - środowiskowe: promieniowanie ultrafioletowe, promieniowanie jonizujące
gamma i X, mutageny chemiczne (wynikające z zanieczyszczenia środowiska czy palenia
tytoniu).
3. Następstwa uszkodzeń DNA:

• Zmiany w sekwencjach kodujących i regulacyjnych prowadzą do powstania białek

nieaktywnych, o zmienionej aktywności lub braku białka.

• Akumulacja mutacji w wyniku dużego natężenia czynnika mutagennego lub obniżenia

aktywności systemów naprawy DNA prowadzi do nowotworów i starzenia organizmu.

• Mutacje w komórkach linii zarodkowej są dziedziczone i się rozprzestrzeniają;

powstają dziedziczne choroby genetyczne.

• Uszkodzenie DNA na dużą skalę prowadzą od razu do śmierci; choroba popromienna.

4. Unikanie uszkodzeń DNA:
Jedną ze strategii ochrony DNA w komórce może być niedopuszczanie, aby nie korzystnych
czynnik zadziałał na DNA, aby uszkodzenie DNA w ogóle nie nastąpiło. Przykładami takich
strategii jest np. obecność melaniny w fibroblastach skóry jako ekran ochronny przeciwko
promieniowaniu UV. Innym przykładem jest szereg mechanizmów wewnątrzkomórkowych
usuwających reaktywne formy tlenu czy enzym dUTPaza, który uniemożliwia wprowadzanie
dUMP do DNA.
5 i 6. Dowód na istnienie naprawy DNA:
Dowodem na obecność mechanizmów reperacji DNA w komórce jest nieliniowa krzywa
przeżywalności w obecności UV: przy niskich dawkach UV przeżywalność komórek jest
wysoka, a przy wyższych dawkach w pewnym momencie przeżywalność gwałtownie spada;
przy bardzo wysokich dawkach pojawiają się komórki bardziej oporne. Częstość mutacji
natomiast najpierw wzrasta, a potem maleje. Jak interpretować takie krzywe? Przy niskich
dawkach UV uszkodzenia DNA są wydajnie naprawiane i tylko niektóre uszkodzenia są
mutagenne, ale wraz ze wzrastającą dawką rośnie liczba mutantów przy zachowaniu jeszcze
sporej przeżywalności. Przy wyższych dawkach przeżywalność gwałtownie maleje, co
wynika z tego, że uszkodzeń jest zbyt dużo, aby mogły być skutecznie naprawione; ponadto
same mechanizmy reperacji zostają uszkodzone na skutek mutacji, co dodatkowo zwiększa
częstość mutacji, co prowadzi do bardzo dużej niestabilności genomu i dużej liczby
nieprawidłowych białek, co bezpośrednio prowadzi do śmierci komórek. W wyniku selekcji
pojawiają się i namnażają się rzadkie mutanty oporne na UV, które mogą na przykład powstać
w wyniku mutacji zwiększających wydajność mechanizmów naprawczych. Przeciwieństwem
takich mutantów są mutanty bardzo wrażliwe na UV, które jeszcze przed naświetleniem miały
uszkodzone mechanizmy reperacji DNA.
7. Rodzaje uszkodzeń DNA:
Przykłady: zablokowane widełki replikacyjne na skutek napotkania nienaturalnej struktury
DNA powstałej w wyniku modyfikacji DNA; blokada taka może prowadzić do pęknięć DNA;
dimery tymin indukowane przez UV, alkilacje reszt azotowych, jedno- i dwuniciowe
pęknięcia DNA, duże fragmenty jednoniciowego DNA oraz wiązania poprzeczne między
DNA a innymi związkami, np. cisplatyną (cross-links).

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki

8. Rodzaje naprawy DNA u Eukariota:

• Aktywność egzonukleolityczna w kierunku 3’-5’ polimerazy DNA
• Bezpośrednia naprawa uszkodzeń (reversion repair, RR)
• Naprawa niedopasowanych nukleotydów (Mismatch Repair, MR)
• Naprawa przez wycinanie zasad (Base Excision Repair, BER)
• Naprawa przez wycinanie nukleotydów (Nucleotide Excision Repair, NER)
• Niehomologiczne łączenie końców (Non-Homologous End Joining, NHEJ)
• Homologiczna rekombinacja (Homologous Recombination, HR)

9. Naprawa błędów podczas replikacji:
Częstość mutacji generowana podczas replikacji DNA wynosi jedna mutacja na 10

wprowadzonych nukleotydów, mimo że polimeraza DNA myli się raz na 10

nukleotydów.

Różnica ta wynika z aktywności korekcyjnej głównej polimerazy DNA δ, która wycinana
błędnie wprowadzane nukleotydy, dzięki aktywności egzonukleolitycznej w kierunku
odwrotnym do syntezy DNA, czyli 3’ → 5’. Z polimerazą DNA δ współdziała kompleks
PCNA, który przytrzymuje polimerazę DNA do matrycy. Inne polimerazy DNA β i ε biorą
udział bezpośrednio w naprawie uszkodzeń DNA napotkanych przez widełki replikacyjne, ale
dokładny mechanizm tej naprawy jest nieznany.
10. Bezpośrednia naprawa uszkodzeń:
Jednoniciowe pęknięcia mogą być łączone bezpośrednio przez ligazę DNA. Alkilowe
modyfikacje DNA mogą być usuwane przez specyficzne enzymy, np. przez metylotransferazę
O6-metyloguaninową (MGMT), która katalizuje w jednej reakcji przeniesienie grupy
metylowej z metyloguaniny (łączy się z T zamiast z C) na grupę cysteinową w centrum
aktywnym enzymu, co inaktywuje enzym i kieruje enzym do ubikwitynacji i degradacji.
Ludzki enzym MGMT jest homologiem bakteryjnego białka Ada, które pełni podobną
funkcję.
11. Bezpośrednia naprawa uszkodzeń – fotoliza:
W wyniku działania promieniowania UV powstaje m.in. dimer cyklobutylowy pomiędzy
sąsiadującymi pirymidynowymi zasadami, które w większości organizmów są bardzo
wydajnie usuwane przez enzym fotolizę w reakcji zależnej od światła widzialnego. Fotoliaza
zawiera dwa chromofory flawinowy FADH oraz folianowy MTHF. Enzym przyłącza się do
dimeru, ale staje się aktywny dopiero pod wpływem światła widzialnego: MTHF absorbuje
foton i przekazuje energię wzbudzenia do FADH

, który przekazuje elektron do dimeru

generując anion dimeru, który przekształca się w dwie pirymidyny, a elektron powraca do
FADH. Należy zaznaczyć, że u człowiek obecny jest enzym homologiczny do fotolizy, ale
pełni on zupełnie inne funkcje.
12. Naprawa niedopasowanych nukleotydów (Mismatch Repair, MR):
Mechanizm ten naprawia błędy zrobione przez polimerazę DNA (stąd wynika różnica między
częstością mutacji wprowadzanych przez polimerazę DNA in vitro i in vivo) oraz powstałe w
wyniku deaminacji, oksydacji i metylacji zasad (zmiany we właściwościach parowania
zasad). Mechanizm ten usuwa błędnie wprowadzone zasady azotowe tylko z nowopowstałej
nici DNA po replikacji, gdyż nowa nić przez krótki czas nie jest metylowana, co pozwala na
rozpoznanie, która zasada jest mylnie wprowadzona, a która była tylko matrycą i pochodzi ze
starej cząsteczki DNA. Metylowane są reszty adeniny na azocie N6 oraz cytozyny, metylaza
Dam rozpoznaje sekwencje GATC oraz CCA/TGG. U eukariontów DNA nie jest tak często
metylowane i nowa nić może być rozpoznawana tylko dzięki przerwom w nowej nici DNA,
zanim ligała połączy wszystkie fragmenty.
13. Naprawa niedopasowanych nukleotydów (Mismatch Repair, MR):
Za rozpoznanie uszkodzenia DNA odpowiedzialny jest kompleks MutSα złożony z dwóch
białek MSH2 i MSH6, które przyłączają się do miejsca ze źle sparowanymi nukleotydami. Po

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki

rozpoznaniu zmienionej nici DNA, czemu towarzyszy hydroliza ATP, co prowadzi do zmiany
konformacji i możliwości ślizgania się dimeru wzdłuż DNA. Umożliwia to po przyłączeniu
do miejsca uszkodzenia kolejnego kompleksu MutLα, złożonego z białek MLH1 i PMS2,
przesunięcie tetrameru i odsłonięcie miejsca uszkodzenia dla egzonukleazy I, która degraduje
nić ze źle wstawionym nukleotydem na pewnej długości. Zdegradowana nić jest odtwarzana
przez polimerazę δ na matrycy starej nici DNA już bez błędu w sekwencji. Mutacje w genach
MSH2, PMS2 i MLH1 powodują dziedzicznego niepolipowatego raka jelita grubego.
14. Naprawa przez wycinanie zasad (Base Excision Repair, BER):
BER jest odpowiedzialny za usuwanie zmodyfikowanych zasad, które są rozpoznawane przez
specyficzne enzymy zwane glikozylazami DNA. Rodzaje uszkodzeń naprawiane przez BER
obejmują: utlenione zasady (powstają spontanicznie w wyniku działania rodników tlenowych,
promieniowania UV i jonizującego), alkilowane zasady (endogenne związki alkilujące,
karcinogeny np. nitrozoamina). Przykłady uszkodzeń: uracyl w DNA, pofragmentowane i
utlenione pirymidyny, N-alkilowane puryny (np. 7-metyloguanina) czy 8-oksoguanina
(główna forma utlenionej puryny i jest wysoko mutagenna, bo łączy się z adeniną zamiast z
guaniną). Ponadto N-alkilowane puryny są podatne na spontaniczną hydrolizę wiązania N-
glikozylowego, co powoduje odłączenie puryny i powstanie miejsca apurynowego AP w
DNA.
15. Naprawa przez wycinanie zasad (Base Excision Repair, BER):
ETAP 1 obejmuje rozpoznanie uszkodzenia, usunięcie zasady oraz przecięcie nici DNA:
specyficzna glikozylaza rozpoznaje uszkodzenie, a następnie hydrolizuje wiązanie
glikozydowe między zasadą azotową a rybozą, w wyniku czego następuje usunięcie zasady z
DNA i powstaje tzw. miejsce AP); występują dwa typy glikozylaz: glikozylaza typu I tylko
usuwa zasadę, natomiast glikozylaza typu II ma aktywność 3’-endonukleazy (liazy AP) i
eliminuje wiązanie fosfodiestrowe, przecina nić DNA i powstaje wolny koniec 3’-OH oraz
nietypowy koniec 5’-deoksyryboza-5-fosforan (5’-dRP); w przypadku glikozylazy typu I nić
jest przecinana przez inny enzym: endonukleazę AP (APE1).
ETAP 2 obejmuje odsunięcie na zewnątrz nici DNA od końca 5’ i syntezę pierwszego
nukleotydu na końcu 3’ za pomocą polimerazy β.
ETAP 3 zachodzi według dwóch scenariuszy w zależności od natury chemicznej końca 5’. W
szlaku podstawowym następuje usunięcie końca 5’-dRP (forma hemiacetalu) przez
polimerazę β posiadającą aktywność liazy AP oraz połączenie końców 3’-OH i normalnego
końca 5’-P dzięki kompleksowi ligazy III z białkiem XRCC1. Niektóre końce 5’ (formy
aldehydowe) są odporne na działanie polimerazy β i wtedy w alternatywnym szlaku następuje
odłączenie polimerazy β i przyłączenie w jej miejsce kompleksu polimeraz δ/ε i PCNA, które
wydłużają nić DNA od miejsca AP, przy czym koniec 5’ zostaje jeszcze bardziej odsunięty od
DNA. Odstający koniec 5’-dRP zostaje usunięty w końcu przez endonukleazę FEN1, a
przerwa w DNA zostaje połączona przez ligazę I.
16. Naprawa przez wycinanie nukleotydów (Nucleotide Excision Repair, NER):
NER odpowiedzialny jest za usuwanie różnych modyfikacji chemicznych zaburzających
strukturę DNA, takich jak dimery pirymidynowe, fotoprodukty, międzyniciowe nowe
wiązania poprzeczne (powstałe w wyniku działania UV), połączenia kowalencyjne DNA ze
związkami chemicznymi –toksynami. W NER bierze udział około 30-stu białek, które
regulują dwie różne drogi naprawy: szlak GGR (global genomic repair) niezwiązany z
transkrypcją i szlak TCR (transcription-coupled repair), który odbywa się tylko podczas
transkrypcji, kiedy polimeraza RNA napotka zmienioną strukturę DNA. Komórki z
uszkodzonym szlakiem NER wykazują nadwrażliwość na promieniowanie UV. Znanych jest
kilka zespołów chorobowych związanych z uszkodzeniami systemu NER: xeroderma
pigmentosum (XPA, XPB, XPC, XPD), zespół Cockayne’a (mutacje w genach CSA i CSB),
trichotiodystrofia, zespół wrażliwości na UV (UVSS). Są to wieloobjawowe zespoły

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki

chorobowe obejmujące zaburzenia neurologiczne, zwiększoną zachorowalność na
nowotwory, starzenie skóry, choroby oczu.
17. Naprawa przez wycinanie nukleotydów – szlak niezwiązany z transkrypcją GGR:
Rozpoznanie uszkodzenia: biorą w tym udział trzy kompleksy, kolejność ich przyłączania nie
jest ostatecznie ustalona; są to XPC-HR23B, XPA-RPA oraz kompleks XPE zbudowany z
dimeru DDB1 i DDB2.
Rozkręcenie DNA: kompleks czynnika transkrypcyjnego TFIIH zbudowanego z siedmiu
białek (m.in. z XPB i XPD) ma aktywność helikazy DNA i przyłącza się do miejsca
uszkodzenia jako czwarty w kolejności kompleks.
Wycięcie DNA z uszkodzeniem: uszkodzenie zostaje wycięte z pewnym zapasem po obu
stronach; od końca 3’ DNA zostaje przecięte przez białko XPG, a z drugiego końca przez
kompleks ERCC1-XPF.
Uzupełnienie przerwy w DNA: polimerazy ε i δ syntetyzują nową nić na matrycy istniejącej
nici DNA. Na końcu nowa nić jest łączona z DNA przez DNA ligazę I.
18. Naprawa przez wycinanie nukleotydów – szlak zależny od transkrypcji TCR:
Uszkodzenie DNA może zablokować kompleks polimerazy RNA II podczas transkrypcji
genu, co indukuje rzyłączenie białek CSA i CSB oraz TFIIS, których zadaniem jest
translokacja kompleksu polimerazy RNA II z miejsca uszkodzenia i zrobienie miejsca dla
białek naprawczych. Następnie przyłączone zostają białka ERCC1-XPF i XPG, które
wycinają uszkodzony fragment DNA, a luka w DNA jest wypełniana przez polimerazy i
ligazę. Po naprawie kompleks transkrypcyjny przyłączany jest na nowo i transkrypcja jest
kontynuowana.
19. Naprawa przez rekombinację – naprawa dwuniciowych złamań DNA, które są dla
komórki najgroźniejsze:
Dwuniciowe złamania DNA mogą być naprawiane przez niehomologiczne łączenie końców
(Non-Homologous End Joining, NHEJ), które jednak generuje błędy (dominuje u ssaków i w
fazie G0/G1) lub homologiczną rekombinację (Homologous Recombination, HR), która nie
generuje zmian w DNA (dominuje u drożdży i w fazach S i G2).
Białka rozpoznające dwuniciowe złamania DNA inicjują zarówno naprawę DNA, jak również
inicjują sygnał o uszkodzeniu DNA w celu zatrzymania cyklu komórkowego. Pierwszymi
białkami rozpoznającymi dwuniciowe złamanie DNA jest kompleks MRN (Mre11-Rad50-
Nbs1; u drożdży Mre11-Rad50-Xrs2), który niezależnie promuje naprawę przez NHEJ i HR.
20-22. Struktura i funkcje kompleksu MRN:
Funkcją tego kompleksu jest rozpoznanie dwuniciowego pęknięcia DNA oraz obróbka
końców złamania, która może polegać na wyrównywaniu końców DNA do połączenia na
drodze NHEJ lub indukowanie tworzenia długich jednoniciowych końców, które później
biorą udział w homologicznej rekombinacji. Innymi funkcjami kompleksu MRN jest
przyłączanie innych białek niezbędnych do inicjowania i przekazywania sygnału o
uszkodzeniu DNA (przyłączenie kinazy Atm – u drożdży Tel1 poprzez białko Nbs1, co
umożliwia fosforylację histonu H2A przez ATM po obu stronach złamania DNA).
Charakterystyczna budowa kompleksu MRN z długimi, hakowatymi domenami Rad50 i
możliwość tworzenia białkowych obręczy razem z promowaniem przyłączania kohezyn w
miejscu złamania DNA sugeruje, że funkcją kompleksu MRN może być utrzymywanie razem
końców złamania DNA. Przez tworzenie długich jednoniciowych końców DNA umożliwia
także w dalszych etapach przyłączenie ATR (Mec1) i innych białek odpowiedzi na
uszkodzenia DNA w miejsce złamania. Kompleks MRN niezbędny jest też do przyłączania
kompleksów przebudowujących chromatynę w obrębie uszkodzenia DNA.

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki

23. Niehomologiczne łączenie końców (Non-Homologous End Joining, NHEJ):
Do złamania DNA niezależnie przemieszcza się kompleks MRN oraz heterodimer Ku70-
Ku80. Kompleks MRN ma aktywność helikazy, endo i egzonukleazy, co umożliwia
wyrównanie końców DNA przez przycinanie wystających końców 3’. Wystające końce 5’
prawdopodobnie przycinane są przez białko FEN-1. Kompleks Ku70-Ku80 chroni końce
DNA przed trawieniem egzonukleazami (nie powstają lepkie końce) oraz przyłącza
podjednostkę katalityczną DNA-PK (kinaza białkowa zależna od DNA z rodziny ATR i
ATM, nie występuje u drożdży), która jest aktywowana przez jednoniciowe DNA przy
złamaniu. Do kompleksu Ku70/80 przyłącza się też białko Artemis, które bierze udział w
obróbce końców DNA. DNA-PK z kolei aktywuje białko XRCC4, które tworzy kompleks i
aktywuje ligazę IV, która łączy końce złamanego DNA.
24. Homologiczna rekombinacja (Homologous Recombination, HR):
Kompleks MRN oprócz roli w inicjacji NHEJ może również indukować resekcję (degradację
jednej nici DNA) w kierunku 5’-3’, dzięki czemu powstają jednoniciowe końce DNA, które
biorą udział w homologicznej rekombinacji. Do końców jednoniciowego DNA przyłącza się
białko Rad52, które może promować naprawę przez dopasowanie pojedynczych nici DNA
(SSA: single-strand annealing) na podstawie krótkich mikrohomologii (~30 pz) lub przez
homologiczną rekombinację. W SSA biorą udział białka Rad52 oraz Rad59, które indukują
parowanie lepkich końców w obrębie mikrohomologii, a fragmenty niehomologiczne są
usuwane przez Rad1-10 oraz MSH2 i MSH6. Niestety podczas naprawy SSA generowane są
delecje. Zatem homologiczna rekombinacja jest preferowana przez komórkę, gdyż ta droga
naprawy nie generuje błędów w DNA. Do końców jednoniciowych nici przyłącza się białko
Rad52 o strukturze pierścienia, które chroni nici przed degradacją egzonukleolityczną.
Podobną funkcję ma białko Rpa1 (Rfa1), które opłaszcza jednoniciowe DNA na całej
długości. Następnie do nici DNA przyłącza się białko Rad51, które zastępuje białko Rpa1 i
opłaszcza jednoniciowe DNA tworząc tzw. filamenty Rad51, które są odpowiedzialne za
inwazję nici DNA do homologicznej cząsteczki DNA. W interakcje z Rad51 wchodzą też
białka BRCA1 i BRCA2 oraz Rad54, 55, 57 i 59, które są niezbędne do zajścia rekombinacji.
Po inwazji nici do homologicznej cząsteczki DNA tworzy się struktura Holliday’a – struktura
heterodupleksu między homologicznymi niciami (charakterystyczne przekrzyżowania nici),
która się następnie przemieszcza na boki, czemu towarzyszy synteza brakujących nici. Potem
dochodzi do ligacji nowych fragmentów i cząsteczki DNA się oddzielają.
25-27. Organizacja w czasie i przestrzeni obróbki dwuniciowych pęknięć DNA:
Organizację obróbki dwuniciowych pęknięć DNA w czasie i przestrzeni ustalono na
podstawie analizy kinetyki lokalizacji białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA w obrębie
jądra. Białka te wykrywano fluorescencyjnie w miejscu uszkodzenia dzięki temu, że
połączono je z różnymi typami białek fluorescencyjnych o różnych kolorach fluorescencji.
U drożdży ustalono, że do miejsca złamania DNA przyłącza się najpierw kompleks Mre11-
Rad50-Xrs2 (MRX, odpowiednik kompleksu MRN), a potem do niego dołącza kinaza Tel1.
W przypadku niskiej aktywności kinazy zależnej od cyklin Cdk (np. w G1), kompleks MRX i
Tel1 odłączają się i przyłączają się białka promujące naprawę przez NHEJ. Przy wysokiej
aktywności Cdk kompleks MRX sam i przy pomocy innej egzonukleazy generuje długie
jednoniciowe odcinki DNA. MRX i Tel1 indukują również fosforylację histonu H2A w
sąsiednich obszarach chromatyny, po czym się odłączają od miejsca uszkodzenia.
Jednoniciowe DNA zostaje spłaszczone przez białko RPA, do którego przyłącza się kinaza
Mec1 (ATR) za pośrednictwem białka Ddc2 (ATRIP). W tym samym czasie do końców DNA
przyłącza się kompleks pierścieniowy Ddc1-Mec3-Rad17, a do niego z kolei przyłącza się
kompleks Rad24-Rfc2-5. Wszystkie wymienione powyżej białka i kompleks są niezbędne do
prawidłowej naprawy uszkodzenia i do wysłania sygnału o uszkodzeniu komórki w celu
zatrzymania cyklu komórkowego. Na końcu zostają przyłączone białka Rad52 i Rad51, które

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki

biorą udział tylko w naprawie DNA przez HR. Jednocześnie z białkami Ddc2-Mec1 do
miejsca uszkodzenia przyłącza się białko adaptorowe Rad9, które pośredniczy w fosforylacji
kinaz efektorowych Chk1 i Rad53 przez Tel1 i Mec1.
28-29. Rola białka adaptorowego Rad9:
Po przyłączeniu do miejsca uszkodzenia i aktywacji kinaz Mec1 i Tel1 następuje fosforylacja
i aktywacja białka adaptorowego Rad9. Ufosforylowany Rad9 może przyłączyć nieaktywną
kinazę efektorową Rad53, co umożliwia fosforylację Rad53 przez Mec1. Fosforylacja Rad53
aktywuje swoją własną trans-autofosforylację w wielu miejscach. Tak w pełni zaktywowana
kinaza Rad53 jest uwalniana z miejsca uszkodzenia. Nowa cząsteczka Rad53 może zostać
przyłączona do Rad9, co stanowi mechanizm amplifikacji sygnału o uszkodzeniu DNA (drugi
mechanizm to zwielokrotnienie miejsc przyłączenia dla Rad9 w obrębie uszkodzenia DNA w
postaci fosforylowanych histonów H2A i odsłonięcia zmetylowanej lizyny 79 histonu H3).
Zmetylowana lizyna 79 histonu H3 jest miejscem przyłączenia do chromatyny białka Rad9
(Crb2 i 53BP1) poprzez konserwatywną domenę tudor.
30-32. Rola modyfikacji i przebudowy chromatyny w naprawie DNA:
Po przyłączeniu kinazy ATM (Tel1) do miejsca uszkodzenia następuje fosforylacja histonu
H2AX (H2A u drożdży). Do ufosforylowanego H2AX przyłączają się następnie kohezyny
oraz kompleks modyfikujący chromatynę NuA4, który acetyluje histony. Umożliwia to
przyłączenie kompleksu przebudowującego chromatynę INO80, który usuwa histony przy
złamaniu DNA, aby mogły być utworzone regiony jednoniciowego DNA. Po odłączeniu
ATM i powstaniu jednoniciowych fragmentów przyłączona zostaje kinaza ATR (Mec1), która
fosforyluje kolejne histony H2AX oraz białka adapterowe, które przyłączają się do właśnie do
ufosforylowanej seryny histonu H2A oraz zmetylowanej lizynie 79 na histonie H3, co
dodatkowo wzmacnia sygnał o uszkodzeniu DNA. Po dokonaniu naprawy DNA sygnał o
uszkodzeniu musi być wyłączony. Przyłączenie kompleksu przebudowującego chromatynę
TIP60 pozwala na usunięcie dimerów H2AX/H2B i wstawienie nieufosforylowanych
histonów H2A i tym samym wyłączenie sygnału.

1. Modele starzenia komórki. Dieta niskokaloryczna - sposób na
długowieczność:

2. Limit Hayflick’a wskazuje, że każda komórka ma zaprogramowany wiek:
Hayflick stwierdził, że komórki ludzkie w hodowli dzielą się maksymalnie około 50 razy i
umierają. Eksperymenty, w których przeszczepiano stare komórki na młody organizm
wykazały, że zdolność do liczby podziałów jest cechą wewnętrzna komórki i nie ma
znaczenia wpływ młodego organizmu na przeszczepione komórki. U większości zwierząt
istnieje pozytywna korelacja między maksymalną długością życia, a maksymalną liczbą
podziałów komórek. Z drugiej strony komórki pobrane od pacjentów z progerią Wernera -
syndromem przedwczesnego starzenia zdolne są do tylko 10-ciu podziałów. Ale przy okazji
rozważań na temat długości życia musimy rozważać zarówno replikacyjny czas życia, czyli
zdolność do podziałów, jak i chronologiczny czas życia komórki, czyli rzeczywista długość
życia, która nie ustaje wraz z podziałami.
3. Z czego wynika zaprogramowany wiek komórki?
Wczesne teorie wskazywały na istnienie genów śmierci („death gene”) lub genów starzenia,
które by indukowały w pewnym momencie starzenie i śmierć komórki, ale do tej pory nie
zidentyfikowano takich genów. Obecnie uważa się, że starzenie wynika z osłabienia
wewnętrznych mechanizmów komórkowych zapewniających długowieczność.

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki

4. Mechanizmy starzenia – hipotezy:

• Telomerowa teoria starzenia
• Teoria mutacji genowych
• Teoria osłabionej naprawy DNA
• Teoria akumulacji odpadów w komórce: np. teoria wolnorodnikowa
• Teorie gerontologiczne: zmiany hormonalne, szybkość metabolizmu
• Teorie ewolucyjne: adaptacyjna, antagonistyczna plejotropia i „disposable soma”

5-6. Struktura i skracanie telomerów. Telomerowa hipoteza starzenia:
Liniowe chromosomy eukariotyczne zakończone są charakterystyczną strukturą telomerową
zbudowaną z wielu tandemowych powtórzeń sekwencji TTAGGG oraz wystającym
jednoniciowym ogonem 3’. Ze względu na to, że polimeraza DNA nie może syntetyzować
nici DNA w kierunku 3’ do 5’ i musi korzystać ze startera RNA na nici opóźnionej. Po
odłączeniu primera koniec 5’ ulega skróceniu. Z każdym cyklem replikacyjnym może
następować skrócenie chromosomu. Dodatkowo nić z końcem 5’ telomeru nie dostarcza
matrycy dla wydłużonej wystającej nici 3’ i po replikacji cząsteczka potomna jest tego końca
pozbawiona. Nić 3’ może jednak być wydłużana przy udziale telomerazy, która ma własną
matrycę do elongacji. Jednak telomeraza nie jest aktywna we wszystkich komórkach, co
doprowadziło do hipotezy, że przyczyną starzenia komórek jest systematyczne skracanie
chromosomów i utrata ważnych genów. Hipoteza ta jest poparta obserwacjami, że im starsze
komórki tym krótsze mają telomery, że w komórkach z progerią obserwuje się szybszą utratę
telomerów oraz że komórki nowotworowe – replikacyjnie nieśmiertelne mają stałą długość
telomerów, dzięki stałej aktywności telomerazy. Ale (!) większość komórek somatycznych
ma ograniczoną liczbę podziałów i nie jest możliwe tak silne skrócenie telomerów, aby
nastąpiła utrata dużej liczby genów oraz nie zidentyfikowano też żadnego, zlokalizowanego
blisko telomerów genu, którego utrata powodowałaby starzenie.
7. Teoria mutacji genowych i osłabionej naprawy DNA:
Z wiekiem komórek obserwuje się nagromadzanie mutacji (starzenie DNA), które mogą
prowadzić do zmian funkcji białek. Z wiekiem spada też wydajność naprawy DNA, co
prowadzi do akumulacji mutacji. Istnieje też korelacja między długością życia gatunku a
sprawnością systemów naprawy DNA. Prawie wszystkie znane choroby charakteryzujące się
przyspieszonym starzeniem spowodowane są mutacjami w genach związanych z naprawą
DNA, ochroną telomerów czy całego DNA. Zatem jedną z przyczyn starzenia może być
postępujące uszkodzenia genomów.
8. Choroby przedwczesnego starzenia:

Choroba / gen /
maksymalny czas życia

Uszkodzony proces

Objawy

Syndrom Wernera /
helikaza WRN / 48 lat

Naprawa DNA (HR,
NHEJ), replikacja DNA,
metabolizm telomerów,
apoptoza

siwienie, katarakta,
arterioskleroza,
osteoporoza, cukrzyca,
atrofia skóry

Syndom Cockayne’a /
CSB i CSA / 20 lat

Naprawa DNA (BER,
NER)

neurodegeneracja,
katarakta,
arterioskleroza,
osteoporoza, cukrzyca,

Syndrom Blooma /
BLM / 28 lat

Naprawa DNA ???

nowotwory, cukrzyca,
katarakta

Syndrom Hutchinsona-
Gilforda / LMNA /12
lat

Struktura jądra,
transkrypcja

arterioskleroza,
osteoporoza, atrofia
mięśni

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki

9. Teoria akumulacji odpadów w komórce:
W starych komórkach obserwuje się nagromadzanie żółto-brązowego barwnika lipofuscyny,
który tworzy nierozpuszczalne agregaty; mogą one stanowić nawet 30% objętości
cytoplazmy; barwnik ten oddziałuje z białkami, tłuszczami i DNA, co może istotnie zaburzać
metabolizm komórki.
Teoria wolnorodnikowa starzenia mówi, że przyczyną starzenia są reaktywne formy tlenu
(ROS), które uszkadzają DNA, białka i lipidy; z wiekiem uszkodzenia te się nagromadzają, a
systemy obronne słabiej działają; ten mechanizm może mieć znaczenie zwłaszcza dla
chronologicznego czasu życia komórki. Ale np. nadekspresja genu SOD1 kodującego
dysmutazę nadtlenkową zwiększa długość życia u muszki, ale delecja tego genu z kolei nie
skraca życia. Z drugiej strony mutant myszy z przyspieszoną akumulacją mutacji
mitochondrialnych wykazuje objawy przyspieszonego starzenia. Stwierdzono też w badaniach
na dużą skalę, że podawanie antyoksydantów (np. witaminy E) nie wpływa na długość życia;
niekoniecznie musi to być dowód przeciwko tej teorii, gdyż po prostu zewnętrzne podawanie
antyoksydantów nie musi mieć przełożenia bezpośredniego na metabolizm ROS w komórce.
10. Ewolucyjne teorie starzenia:
Starzenie jako adaptacja: uważano kiedyś, że starzenie może być cechą przystosowawczą
wynikającą z potrzeby zrobienia miejsca dla młodych osobników, ale obecnie uważa się, że
dobór działa na poziomie osobniczym, a nie gatunkowym; na poziomie osobnika
nieśmiertelność jest korzystniejsza od starzenia i śmierci.
Antagonistyczna plejotropia: starzenie wynika z akumulacji mutacji, które dają większą
rozrodczość w młodym wieku, ale wpływają niekorzystnie w wieku późniejszym; znane są
przykłady takich mutacji u C. elegans i muszki owocowej; rozmnażanie wpływa negatywnie
na długość życia; presja selekcyjna działa słabo w wieku dojrzałym (np. brak eliminacji
mutacji powodującej pląsawicę Huntingtona ujawniająca się około 35 roku życia).
Disposable soma: każdy organizm ma ograniczoną ilość energii, którą może całkowicie
poświęcić na utrzymywanie zdrowej komórki (długowieczność), ale wszystkie organizmy
muszą się rozmnażać i dużo energii na to jest zużywane, a na tym z kolei cierpi sama
komórka, która akumuluje uszkodzenia, co objawia się starzeniem.
11. Gerontologiczne teorie starzenia:
Szybkość metabolizmu: im szybszy metabolizm tym krótsze życie np. mysz; efekt pozorny,
zależy to od sposobu obliczania tempa metabolizm; okazuje się, że mysz i słoń mają takie
samo tempo metabolizmu, jeśli uwzględni się ilość skonsumowanego tlenu przez całe życie
na wagę ciała.
Zmiany hormonalne: z wiekiem obniża się ilość niektórych hormonów np. u mężczyzn
testosteronu (w latach 20-tych mężczyznom wszczepiano mężczyznom jądra od małp czy
kóz, aby zapewnić sobie długowieczność); testosteron raczej wpływa na to, że mężczyźni
zaczynają się szybciej starzeć od kobiet i stąd prawdopodobnie wynika, że kobiety żyją
średnio o 5-7 lat dłużej od mężczyzn.
12. Zmiany hormonalne a starzenie:
Niski poziom hormonu wzrostu (GH), a także czynnika wzrostu podobnego do insuliny IGF-1
(jego ekspresja i sekrecja indukowana jest przez GH) oraz osłabienie drogi sygnalnej zależnej
od IGF-1 wydłużają życie u organizmów modelowych. Przykłady: mutacje daf-2 (receptor dla
IGF-1) i age-1 (kaskada sygnałowa IGF-1) u C. elegans wydłużają życie; stulatkowie mają
niski poziom IGF-1 oraz wysoką wrażliwość na insulinę; karły nie leczone hormonem
wzrostu żyją dłużej, ale szybciej pojawiają się obniżający nich objawy starzenia (obniżający
się z wiekiem poziom GH wpływa na spadek masy mięśniowej, powoduje osteoporozę i
wzrost ilości tkanki tłuszczowej); osoby cierpiące na gigantyzm żyją krócej (wysoki poziom
GH); duże rasy psów (wysoki poziom IGF-1) żyją krócej; liczne mutanty myszy typu dwarf

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki

(karzeł) są długowieczne. UWAGA! Wydłużenie życia nie jest równoznaczne z brakiem
objawów starzenia.
13. Droga sygnalna zależna od IGF-1:
U C. elegans aktywacja receptora insulinowego DAF-2 przez hormon IGF-1 indukuje
kaskadę sygnalną z udziałem kinazy PI3K (fosfatydylinozytol-3-kinaza) oraz kinazy PDK1
(kinaza zależna od PI3K), która kończy się aktywacją kinaz Akt1 i Akt2, które fosforylują i
deaktywują czynnik transkrypcyjny DAF-16. Brak aktywacji tej kaskady sygnałowej poprzez
np. obniżenie poziomu IGF-1 czy mutację w receptorze DAF-2, prowadzi do aktywacji białka
DAF-16, które hamuje rozwój robaka w kierunku dojrzałości płciowej i rozmnażanie, a
jednocześnie indukuje powstanie stadium pośredniego larwy typu dauer, która cechuje się
długowiecznością (żyją nawet 4 razy dłużej od osobników normalnych).
14-16. Mechanizm starzenia komórek drożdży:
Dwie kluczowe obserwacje doprowadziły do poznania molekularnego mechanizmu starzenia
się drożdży: stwierdzono, że komórki potomne drożdży dziedziczą stary replikacyjny wiek
komórek macierzystych (im starsza komórka macierzysta, tym komórki potomne mają
zdolność do mniejszej liczby podziałów) oraz wyizolowano cztery mutacje „youth” (uth1 do
uth4) przedłużających życie replikacyjne drożdży; trzy z tych mutacji znajdują się w genach
regulujących powstawanie „cichej” heterochromatyny, w tym w genie SIR2, który koduje
deacetylazę histonową. Sir2 katalizuje przy udziale NAD

odłączenie grupy acetylowej od

substratu z wytworzeniem acetylo-ADP-rybozy i nikotynoamidu, który zwrotnie hamuje
aktywność Sir2. Okazało się, że wzrost aktywności Sir2 poprzez kondensację chromatyny w
obrębie genów rybosomalnych hamuje powstawanie i akumulację kolistych cząsteczek DNA,
które powstają na skutek rekombinacji między homologicznymi tandemami genów
rybosomalnych, co prowadzi do wydłużenia życia. Ustalono, że przyczyną skracania życia
replikacyjnego jest toksyczna akumulacja kolistych cząsteczek DNA. Dziedziczenie starego
wieku replikacyjnego u drożdży odbywa się przez przekazywanie kolistych cząsteczek DNA
komórkom potomnym.
17. Sposoby na przedłużenie życia:
Na podstawie danych naukowych wydaje się, że sposobami na przedłużenie życie mogły być
inhibitory drogi sygnalnej regulowanej przez IGF-1 lub metformina, lek na cukrzycę typu
drugiego; lek ten zwiększa wrażliwość komórek na insulinę i obniża poziom cukru we krwi
przez hamowanie glukoneogenezy w wątrobie, co zmniejsza aktywację drogi sygnalnej
zależnej od IGF-1. Inną drogą może być dieta niskokaloryczna (restrykcja kaloryczna), która
jest jedynym naukowo potwierdzonym sposobem na wydłużenie życia.
18-21. Dieta niskokaloryczna (calorie restriction):
Definicja: redukcja o 30-50% dziennej dawki kalorii przy zachowaniu odpowiedniej ilości
cukrów, białek i tłuszczów oraz wszystkich witamin i mikroelementów. Wpływ diety
niskokalorycznej na długość życia odkryto u szczurów w 1935 roku przez McKaya i wsp.
Okazało się, że szczury na zredukowanej diecie osiągają maksymalny wiek dłuższy o jedną
trzecią od szczurów na diecie pełnej. Podobnie dłuższy jest średni wiek szczurów na diecie
niskokalorycznej, co akurat świadczy o lepszej kondycji ogólnej tych szczurów. Dieta
niskokaloryczna ma podobne efekty u wszystkich dotychczas zbadanych organizmów od
pierwotniaków do ssaków.
22. Dieta niskokaloryczna zwalnia procesy starzenia:
Dieta niskokaloryczna obniża poziom glukozy, insuliny i cholesterolu we krwi; zwiększa
wrażliwość komórek na insulinę; obniża ciśnienie krwi; zwiększa sprawność umysłową u
starszych zwierząt; zwiększa aktywność mechanizmów naprawczych DNA oraz zmniejsza
produkcję reaktywnych form tlenu i związane z tym uszkodzenia tkanek.

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki

23. Mniej kalorii = mniej chorób:
Dieta niskokaloryczna bardzo istotnie zmniejsza zachorowalność na wiele typów
nowotworów, także na cukrzycę, degeneracyjne choroby układu nerwowego i choroby
autoimmunologiczne.
24. Dieta niskokaloryczna ma także skutki negatywne:
• Zwierzęta rosną wolniej i osiągają mniejszą masę maksymalną
• Opóźnione dojrzewanie płciowe
• Krótszy okres płodności
• Obniżona temperatura ciała; wrażliwość na zmiany temperatury (zanik tkanki

tłuszczowej)

• Zanik tkanki mięśniowej (ale ten związany z wiekiem jest osłabiony); słabsza siła

fizyczna

• Łatwiejszy wzrost toksyn we krwi
• Gorsze gojenie ran
• Zmiany psychiczne: depresja, nadpobudliwość
25. Waga ciała czy ilość tkanki tłuszczowej nie wpływają na przedłużenie życia:
Szczury, które otrzymywały 92% normalnej liczby kalorii, ale które miały wagę ciała
mniejszą o 40% niż grupa kontrolna, charakteryzowały się: większym średnim czasem życia,
ale nie zaobserwowano zwiększenia maksymalnego czasu życia. Genetycznie zmienione
„otyłe” myszy (posiadają dwukrotnie więcej tkanki tłuszczowej niż normalne myszy)
hodowane na diecie niskokalorycznej osiągały prawie dwukrotnie wyższy maksymalny wiek
podobnie jak myszy kontrolne. Zatem przyczyną wydłużania życia przez dietę
niskokaloryczną, nie jest mała waga i mniejsza ilość tkanki tłuszczowej.
26. Kierunki badań na dietą niskokaloryczną:
Jaki jest efekt stosowania diety niskokalorycznej u naczelnych, w tym u człowieka?
Jaki jest molekularny mechanizm działania diety niskokalorycznej?
Czy istnieją substancje (nutraceutyki), które miałyby takie samo działanie jak dieta
niskokaloryczna?
27-28. Czy dieta niskokaloryczna działa u naczelnych?
Prowadzone są testy na dwóch gatunkach małp: Macaca mulatta i Saimiri sciureus. Badany
jest efekt stosowania tej diety od urodzenia i u dorosłych już zwierząt. Na wyniki tych badań
trzeba będzie poczekać jeszcze kilkanaście lat. Rozpoczęto też badania nad efektami
stosowania tej diety u człowieka.
29-31. Czy dieta niskokaloryczna działa u człowieka?
Starożytni Grecy i Rzymianie doceniali dobroczynne efekty ograniczania ilości spożywanego
jedzenia. Pierwszą osobą, która stosowała dietę niskokaloryczną był Włoch Luigi Cornaro
(żył ponad 80 lat). Prof. Maurice Gueniot był znany ze stosowania diety niskokalorycznej
(102 lata). Ciekawym przykładem na poparcie diety niskokalorycznej jest analiza populacji na
Okinawie w Japonii. Liczba stulatków na Okinawie jest 2-40 razy większa niż na pozostałych
wyspach Japonii. Ilość kalorii spożywana przez dzieci w wieku szkolnym na Okinawie
wynosi tylko 62% zalecanej dawki w Japonii. Dorośli z Okinawy spożywają 20% mniej
kalorii niż wynosi średnia krajowa w Japonii; o 40% mniej niż w USA; dieta oparta na
warzywach, zbożach, rybach, owocach. Liczba zgonów z powodu udarów, nowotworów i
chorób serca jest o 35% mniejsza niż na pozostałych wyspach japońskich. Liczba zgonów
osób w wieku 60-64 lat jest o połowę mniejsza niż w innych częściach Japonii. Inny przykład
to eksperyment Biosphere 2, w którym na dwa lata 4 mężczyzn i 4 kobiety zostały zamknięte
w sztucznym środowisku odizolowanym od reszty świata; dzienna dawka kalorii wynosiła
1750-2100 kcal (dieta niskokaloryczna); zaobserwowano spadek wagi: 19% (mężczyźni),
13% (kobiety), obniżenie ciśnienia krwi, obniżenie stężenia cukru, cholesterolu i insuliny we

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki

krwi. Podobne zmiany fizjologiczne, hormonalne i biochemiczne zaobserwowano u osób z
Caloric Restriction Society praktykujących dietę niskokaloryczną od 3 do 15 lat.
32-33. Jak dieta niskokaloryczna przedłuża życie?

• Opóźnienie rozwoju – brak genetycznego programu starzenia, nie ma genów starzenia
• Zwolnienie metabolizmu – tylko na początku diety, potem tempo normalne
• Osłabienie stresu oksydacyjnego – zwiększenie poziomu białek błony

mitochondrialnej UCP (uncoupling protein), które przenoszą protony z cytoplazmy do
mitochondrium i zmniejszają produkcję ATP i gradient protonowy (powstaje mniej
ROS)

• Zwiększenie wrażliwości na insulinę, obniżenie ilości insuliny i glukozy we krwi,

redukcja tkanki tłuszczowej – zmiany hormonalne

34-35. Hipoteza hormezy i ksenohormezy – próba syntezy wiedzy o regulacji
długowieczności:
Hormeza opisuje zjawisko, kiedy określony bodziec, który jest szkodliwy dla organizmu przy
wysokim natężeniu, wykazuje działanie stymulujące i korzystne przy niskim natężeniu.
Ksenohormeza mówi o tym, że organizmy rozwinęły mechanizmy pozwalające na odbieranie
hormetycznych sygnałów od innych organizmów z tego samego środowiska. Według tej
hipotezy dieta niskokaloryczna jest czynnikiem stresowym o niskim natężeniu, który
aktywuje szereg mechanizmów w komórce, których celem jest ochrona kondycji komórki, co
obejmuje osłabienie apoptozy, zmniejszenie produkcji reaktywnych form tlenu czy syntezę
hormonów, które aktywują te mechanizmy także w innych komórkach organizmu.
36. Co jest białkiem efektorowym aktywowanym przez dietę niskokaloryczną?
U drożdży niezbędna jest obecność deacetylazy Sir2, aby działała dieta niskokaloryczna.
Ponadto delecja genu SIR2 skraca życie komórek drożdżowych. U człowieka jest siedem
homologów białka Sir2; są to syrtuiny Sirt1-7, które oprócz histonów deacetylują wiele

Dieta niskokaloryczna

Niski poziom glukozy we krwi

Obniżenie poziomu insuliny we krwi

Tkanka tłuszczowa uwalnia tłuszcz

i zwiększa wydzielanie adiponektyny

Adiponektyna uwrażliwia

komórki na insulinę

Dalsze obniżenie poziomu

insuliny we krwi

Dieta obfita

Wysoki poziom glukozy we krwi

Zwieksznie poziomu insuliny we krwi

Tkanka tłuszczowa magazynuje tłuszcz

i zmniejsza wydzielanie adiponektyny

Spadek wrażliwości komórek na insulinę

Wzrost ilości glukozy we krwi, co powoduje

chroniczne wydzielanie insuliny do krwi i

w końcu prowadzi do cukrzycy typu II

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki

innych białek, nie tylko histony. Białka Sir mogłyby być takim elementem odbierających
sygnał stresowy w postaci diety niskokalorycznej.
37-38. Molekularny mechanizm działania deacetylazy SIRT1:

• Deacetylacja p53 i Ku70: hamowanie apoptozy
• Reguluje transkrypcję poprzez oddziaływanie z czynnikami transkrypcyjnymi z

rodziny FOXO (forkhead): obniżenie transkrypcji BIM (hamowanie apoptozy) a
zwiększenie transkrypcji MnSOD (obrona przed stresem oksydacyjnym), p27
(zatrzymanie cyklu komórkowego), GADD45 (naprawa DNA)

• Hamowanie białka PPARγ (receptor hormonów steroidowych), które stymuluje

tworzenie nowych komórek tłuszczowych i promuje magazynowanie tłuszczów

• Ochrania komórki nerwowe (mutant myszy Walerian ma podwyższony poziom NAD i

charakteryzuje się wysoką ochroną przed degeneracją neuronów)

Zatem białko SIRT1 spełnia wszystkie warunki białka odbierającego czynnik stresowy i
zmieniającego metabolizm komórki w kierunku zapewnienia przeżycia komórki i jej ochrony.
Ale jak deacetylazy Sir2 i SIRT1 są aktywowane przez dietę niskokaloryczną?
Aktywność Sir2 może być zwiększona przez usuwanie inhibitora nikotynoamidu lub przez
zwiększenie ilości NAD

. Okazało się, że dieta niskokaloryczna i inne czynniki stresowe

aktywują gen PNC1, kodujący nikotynoamidazę, która rozkłada nikotynoamid i przez to
zwiększa aktywność Sir2. Ponadto zaobserwowano u drożdży wzrost oddychania tlenowego,
co z kolei zwiększa pulę NAD

niezbędnego do aktywności katalitycznej Sir2.

39-41. Resweratrol jako nutraceutyk imitujący dietę niskokaloryczną:
W teście in vitro badano wpływ setek związków chemicznych na aktywność ludzkiego
homologa Sir2, SIRT1. Najsilniejszym aktywatorem sirtuin okazał się polifenol resweratol,
wtórny metabolit roślinny, którego najwięcej jest w winogronach i czerwonym winie.
Potwierdzono później, że resweratrol ma takie samo działanie jak dieta niskokaloryczna
(wydłuża życie u drożdży) i wymaga do działania obecności białka Sir2.

1. Apoptoza

2. Apoptoza a programowana śmierć komórki – definicje:
Apoptoza – morfologiczny opis śmierci komórki, inny niż nekroza, czyli przypadkowa
śmierć pod wpływem czynników zewnętrznych
Programowana śmierć komórki (programmed cell death) – opisuje proces, który indukuje
śmierć pojedynczej komórki podczas rozwoju organizmu w ściśle określonym miejscu i w
ściśle określonym czasie
Terminy te często używa się wymiennie, bo prawie każda programowana śmierć komórki
odbywa się na drodze apoptozy, ale np. śmierć komórki w wyniku uszkodzeń DNA odbywa
się na drodze apoptozy, która nie była z góry zaprogramowana i bez uszkodzenia DNA śmierć
by nie nastąpiła.
3. Klasyfikacja typów śmierci komórki:
Nekroza: przypadkowa i bierna śmierć spowodowana przez niszczące czynniki zewnętrzne:
fizyczne, chemiczne, biologiczne.
Apoptoza: ściśle regulowany aktywny proces fizjologiczny o charakterystycznych cechach
morfologicznych, w wyniku którego usuwane są niepotrzebne lub niewykorzystane komórki
podczas embriogenezy i rozwoju organów oraz uszkodzone, nieprawidłowo umiejscowione,
zmutowane lub zainfekowane komórki, co stanowi mechanizm obronny organizmu; brak
apoptozy prowadzić może do nowotworów i chorób autoimmunologicznych, a zbyt
intensywna apoptoza może powodować choroby neurodegeneracyjne np. chorobę
Alzheimera.
Programowana śmierć komórki podobna do apoptozy: kondensacja chromatyny w stopniu
słabym, zwykle niezależna od kaspaz.

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki

Programowana śmierć komórki podobna do nekrozy: brak kondensacji chromatyny.
Autofagia: samotrawienie.
Mitotyczna katastrofa: defektywne punkty kontrolne cyklu komórkowego po uszkodzeniach
DNA, co prowadzi do aneuploidalnych komórek.
4. Przebieg nekrozy (martwicy):
Niekorzystne czynniki zewnętrzne w krótkim czasie (minuty) powodują zaburzenia
homeostazy grupy komórek: następuje utrata selektywnej przepuszczalności błony, co
powoduje napływ wody i jonów (głównie wapnia i sodu). W wyniku napływu wody następuje
pęcznienie cytoplazmy i organelli, a wysoki poziom jonów wapnia indukuje nukleazy.
Dochodzi do chaotycznego cięcia DNA, a pęcznienie komórki prowadzi do przerwania
ciągłości błony komórkowej, a z pękających lizosomów wydostają się hydrolazy, które
degradują białka, RNA i DNA. Rozpad komórek wywołuje odpowiedź układu
immunologicznego i rozwinięcie procesu zapalnego.
5. Przebieg apoptozy:
Apoptoza może być inicjowana przez brak czynników wzrostu, hormony i cytokiny (TNF-
alfa i TGF-beta) poprzez aktywację receptorów błonowych oraz przez czynniki cytotoksyczne
(chemioterapeutyki) i fizyczne (promieniowanie UV i gamma: uszkodzenia DNA), które
indukują kaskadę zmian morfologicznych i biochemicznych. Zmiany morfologiczne obejmują
zaburzenie asymetrii błony komórkowej, obkurczanie cytoplazmy i organelli, kondensację a
potem fragmentaryzację chromatyny oraz uwypuklanie błony komórkowej, które tworzą
pęcherzyki zawierające fragmenty cytoplazmy i jądra. Powstałe w ten sposób ciałka
apoptotyczne fagocytowane są przez sąsiadujące komórki lub makrofagi, co nie wywołuje
odczynu zapalnego.
6. Porównanie apoptozy i nekrozy:
Apoptoza Nekroza

7. C. elegans – modelowy organizm do badań nad programowaną śmiercią komórek:
C. elegans posiada przeźroczyste ciało zbudowane tylko z 1090 komórek somatycznych, z
których dokładnie 131 ulega zaprogramowanej śmierci w trakcie rozwoju tego robaka.
Poszukiwanie genów odpowiedzialnych za ten proces zaowocowało na początku lat 90-tych
odkryciem molekularnego mechanizmu programowanej śmierci komórki, w której kluczową
rolę pełni proteaza Ced-3, nazwane później kaspazą. Kaspaza Ced3 jest aktywowana przez
przyłączenie białka Ced-4. Jednak w normalnych warunkach białko Ced-4 samo pozostaje
nieaktywne, bo przyłączony jest do niego inhibitor Ced-9. Program samobójczej śmierci jest
aktywowany przez aktywację transkrypcji białka Egl-1, który inhibuje Ced-9, który nie może

•

Proces aktywny zależny od ATP

•

Utrata homeostazy jonów

•

Obkurczanie komórki

•

Asymetria błony komórkowej przy
zachowaniu integralności

•

Obkurczanie cytoplazmy, organelle nie
pękają

•

Kondensacja chromatyny, specyficzna
fragmentacja DNA

•

Pęcznienie mitochondriów, spadek
potencjału błon mitochondrialnych

•

Rozpad komórki na ciałka apoptotyczne

•

Fagocytoza przez komórki sąsiadujące i
makrofagi

•

Brak odczynu zapalnego

•

Obejmuje pojedyncze komórki

•

Proces pasywny, niezależny od ATP

•

Proces regulowany i enzymatyczny

•

Pęcznienie komórki

•

Utrata integralności, zwiększona
przepuszczalność

•

Pęcznienie cytoplazmy, dezintegracja
organelli

•

Dezintegracja jądra, niespecyficzna
degradacja DNA

•

Pęcznienie i pękanie mitochondriów,
mitochondria niefunkcjonalne

•

Liza komórki. Brak ciałek apoptotycznych

•

Fagocytoza resztek komórki przez makrofagi
i komórki żerne

•

Odczyn zapalny

•

Obejmuje całe grupy komórek

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki

dalej inhibować Ced-4, który może zaktywować kaspazę Ced-3. W normalnych warunkach
ekspresja Egl-1 jest hamowana przez białko TRA-1A.
8. Porównanie mechanizmu programowanej śmierci komórek u C. elegans i ssaków:
Późniejsze badania wykazały, że wyższe organizmy – ssaki posiadają po kilka kaspaz, które
są aktywowane przy udziale białek adapterowych Apaf-1 i FADD, które są odpowiednikami
białka Ced-4. Również zidentyfikowano homologi białek Ced-9 (Bcl-2) i Egl-1 (Bax, Bik),
które również pełnią funkcje anty- lub proapoptotyczne.
9. Szlaki sygnalizacyjne apoptozy:
Wyróżniamy dwa szlaki sygnalizacyjne aktywujące apoptozę u drożdży: szlak zewnętrzny
zależny od błonowych receptorów śmierci oraz szlak wewnętrzny oparty na wycieku
cytochromu c z mitochondrium do cytoplazmy, co indukuje tworzenie apoptosomu.
Aktywacja obu szlaków umożliwia autoaktywację kaspaz inicjujących, które aktywują
następnie kaspazy fazy wykonawczej apoptozy.
10. Kaspazy to proteazy, które inicjują apoptozę i warunkują nieodwracalność tego
procesu:
Proteazy hydrolazy peptydowe, które przecinają wiązanie peptydowe na końcach białek
(egzopeptydazy) lub wewnątrz polipeptydu (endopeptydazy). Endopeptydazy są dzielone
według biorącego udział w katalizie aminokwasu z centrum aktywnego enzymu. Kaspaza jest
proteazą cysteinową, która specyficznie przecina wiązanie peptydowe od strony karbosylowej
reszty kwasu asparaginowego (caspase: cysteine-dependent aspartate specific protease).
11-13. Struktura kaspazy:
Kaspazy są syntetyzowane jako nieaktywne prekursory – zymogeny (prokaskazy). Kaspazy są
aktywowane przez proteolityczne cięcie za specyficznymi resztami kwasu asparaginowego w
wyniku autoproteolizy lub przez inne kaspazy. W wyniku cięcia powstaje duża (p20) i mała
podjednostka (p10), które w wyniku tetrameryzacji tworzą centrum aktywne proteazy.
Kaspazy inicjujące: kaspaza 8, 9 i 10
Kaspazy efektorowe: kaspaza 3, 6 i 7
Kaspazy nieapoptotyczne – aktywatory cytokin: kaspaza 1, 4, 5, 11, 12, 13, 14
Na N-końcu prokaspaz znajduje się prodomena, która jest odcina podczas aktywacji.
Prodomena może być bardzo krótka lub zawierać motywy DED (death effector domain) lub
CARD (caspase recruitment domain), które biorą udział w interakcjach z białkami
adaptorowymi i między prokaspazami, co umożliwia zajście aktywacji prokaspazy.
Mechanizm aktywacji polega na zbliżeniu monomerów przez indukujące apoptozę kofaktory i
utworzenie homodimeru, co indukuje autoproteolizę albo też kofaktory indukują zmiany
konformacyjne w prekursorach kaspaz, co indukuję autokatalizę.
Homologi kaspaz odkryto także u organizmów jednokomórkowych: bakterii, pierwotniaków i
grzybów, ale ich funkcja oraz możliwość wystąpienia u nich samobójczej śmierci jest
dyskusyjna i bardzo kontrowersyjna.
14. Substraty kaspaz:

• Prekursory kaspaz wykonawczych: prokaspaza 3, 6, 7
• Białka proapoptotyczne: Bid
• Białka, które hamują apoptozę: Bcl-2, Bcl-xL, ICAD (inhibitor CAD – nukleaza

aktywowana przez kaspazy)

• Rozkład struktur komórkowych: laminy (prowadzi to do kondensacji chromatyny),

gelzolina (aktywna forma po cięciu rozkłada filamenty aktynowe)

• Inaktywacja białek związanych z naprawą DNA (PARP, DNA-PK), replikacją (RFC),

splicingiem, regulacją cyklu komórkowego i transkrypcji

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki

15. Szlaki sygnalizacyjne apoptozy – szlak zewnętrzny indukowany przez receptory
śmierci:
Receptory śmierci należą do rodziny receptorów czynnika nekrozy TNF; składają się z
zewnątrzkomórkowej domeny bogatej w cysteiny oraz wewnątrzkomórkowej domeny śmierci
(DD – death domain). Przyłączenie do receptora odpowiedniego ligandu indukuje
trimeryzację receptora. Receptory śmierci po trymeryzacji mogą przyłącząć w cytoplazmie
białka adaptorowe: od razu FADD (Fas associated death domain) lub FADD a potem
TRADD (TNFR1-associated death domain) poprzez interakcję między domenami śmierci DD
obecnymi w receptorach i białkach adapterowych, a powstałe kompleksy nazywamy
kompleksami sygnałowymi indukującymi śmierć: DISC (death inducing signaling complex).
FADD zawiera jeszcze inną domenę DED (death effector domain), poprzez którą przyłącza i
aktywuje kaspazy inicjujące (kaspaza 8) zawierające również domenę DED. Zgromadzenie
przy receptorze białek adapterowych umożliwia jednocześnie przyłączenie i zbliżenie do
siebie prokaspazy inicjujących, co indukuje ich autoaktywację. Szlak ten ma znaczenie dla
homeostazy układu immunologicznego, eliminacji komórek zainfekowanych przez wirusy i
komórek nowotworowych.
16. Szlak wewnętrzny – mitochondrialny apoptozy:
Aktywowany jest przez promieniowanie, czynniki uszkadzające DNA, związki
cytotoksyczne, szok termiczny, wzrost stężenia reaktywnych form tlenu oraz przez brak
czynników wzrostu. W wyniku nie do końca poznanego mechanizmu dochodzi do uwolnienia
niezbędnego mitochondrium cytochromu c niezbędnego do utworzenia apoptosomu i
aktywacji inicjującej prokaspazy 9. Oprócz cytochromu c uwalniane są z mitochondrium inne
białka indukujące apoptozę: Smac/Diablo i HtrA2/Omi, które znoszą działanie inhibicyjne w
kierunku kaspaz białka XIAP oraz endonukleaza G i czynnik indukujący apoptozę AIF, które
to kierują się do jądra i w sposób pośredni lub bezpośredni przyczyniają się do degradacji
DNA niezależnie od kaspaz.
17. Tworzenie apoptosomu i aktywacja prokaspazy 9:
Uwolniony cytochrom c z mitochondrium do cytoplazmy przyłącza się do C-końcowej
domeny WD40 białka Apaf-1, co indukuje zmianę konformacji tego białka i odsłonięcie
miejsca przyłączenia dATP w białku Apaf-1. Przyłączenie dATP do Apaf-1 indukuje
oligomeryzację siedmiu cząsteczek białka Apaf-1 poprzez N-końcowe domeny CARD, co w
efekcie daje kompleks apoptosomu. Do apoptosomu poprzez domenę CARD mogą się teraz
przyłączać prokaspazy 9, co inicjuje ich autokatalizę i aktywację.
18. Inne proteazy biorące udział w apotozie niezależnie od kaspaz – szlak ceramidowy:
Aktywacja receptora śmierci TNF-R1 powoduje aktywację sfingomielinazy i ceramidazy; w
wyniku rozpadu sfingomieliny powstaje fosforan choliny i ceramid, z którego powstaje
sfingozyna, która akumuluje się w lizosomach i indukuje ich rozpad, co uwolnia do
cytoplazmy proteazy katepsyny. Katepsyny mogą też być uwolnione po permealizacji błony
lizosomów przez fosfolipazę A2 (PLA2; degraduje fosfolipidy) aktywowaną przez reaktywne
formy tlenu.
19. Współdziałanie szlaku zewnętrznego i wewnętrznego apoptozy:
Indukcja szlaku zewnętrznego za pośrednictwem receptorów śmierci może też zaktywować
szlak wewnętrzny apoptozy zależny od mitochondriów, co dodatkowo wzmacnia apoptozę
indukowaną z zewnątrz. Dzieje się to za pomocą białka Bid (z rodziny Bcl-2), które jest cięte
przez kaspazę 8, a skrócona forma tego białka – tBid indukuje wyciek cytochromu c z
mitochondriów.
20. Negatywna regulacja procesu apoptozy:
Antyapoptotyczne czynniki wzrostu i cytokiny aktywują specyficzne szlaki sygnalne np.
szlak zależny od kinazy Akt, która inhibuje czynniki transkrypcyjne indukujące ekspresję np.
ligandów dla receptorów śmierci; kinaza Akt inhibuje także proapoptotyczne białko Bad

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki

przez jego sekwestrację poprzez białko 14-3-3. Inny mechanizm to aktywacja czynnika
transkrypcyjnego NF-kB, który aktywuje ekspresję białka hamującego apoptozę IAP, które
bezpośrednio przyłącza się do kaspaz 3, 7 i 9, co hamuje ich aktywność. Czynniki wzrostu
mogą też aktywować białko Bcl-2, które jest jednym z głównych antyapoptotycznych
regulatorów w komórce.
21-22. Antyapoptotyczne białko Bcl-2:
W 1986 r. wykryto, że komórki białaczkowe mają często translokację t(14,18), w wyniku
której onkogen Bcl-2 (B-cell leukemia/lymphona) zostaje przeniesiony z chrom. 14 na 18,
gdzie podlega silniejszej aktywacji ekspresji. W 1988 r. stwierdzono, że białko Bcl-2 inhibuje
apoptozę i posiada domenę transbłonową, która lokalizuje to białko w zewnętrznej błonie
mitochondrialnej. W 1993 roku pokazano, że Bcl-2 tworzy heterodimery z białkami z tej
samej rodziny, ale o działaniu pro-apoptotycznym. Antyapoptotyczny mechanizm działania
Bcl-2 polega na: inhibicji białek proapoptotycznych np. Bax, przyłączaniu i inaktywacji
białka Apaf-1, inhibicji syntezy reaktywnych form tlenu oraz hamowaniu wypływu
cytochromu c z mitochondrium do cytoplazmy.
Białko Bcl-2 należy rodziny białek zawierających charakterystyczne domeny BH (Bcl-2
Homology domain). Do tej rodziny należą zarówno białka pro- i antyapoptotyczne.
Wyróżniamy trzy podrodziny w tej grupie: białka proapoptotyczne zawierające tylko jedną
domenę BH i nie zawierające domeny transbłonowej (Bim, Bid, Bad, Puma, Noxa), białka
antyapoptotyczne typu Bcl-2 zawierające cztery domeny BH (Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1) oraz
białka proapoptotyczne podobne do białka Bax (Bax, Bak) posiadające trzy domeny BH.
23. Pozytywna regulacja procesu apoptozy:

• Inhibicja czynnika hamującego apoptozę IAP przez Smac/Diablo (przyłącza i inhibuje

IAP) oraz proteazę serynową Omi/HtrA2 (przyłącza i degraduje IAP)

• Aktywacja proapoptotycznych białek z rodziny Bcl-2 (translokacja do błon

mitochondrialnych, oligomeryzacja i ułatwianie/indukowanie wypływu cytochromu c
z mitochondriów)

• Hamowanie antyapoptotycznych białek Bcl-2/Bcl-xL przez Puma, Noxa i Bid

24. Regulacja apoptozy przez białko p53:
Mechanizm zależny od transkrypcji: w wyniku uszkodzeń DNA białko p53 ulega stabilizacji i
aktywuje ekspresję genów kodujących białka proapoptotyczne Bax, Bid, Puma, Noxa, Apaf-
1, kaspazę 6, receptory śmierci Fas i DR5, ligand dla Fas (TNFSF6), PTEN i FDXR lub
hamowanie ekspresji, np. IAP.
Mechanizm niezależny od transkrypcji: szybka (wcześniej niż aktywacja transkrypcji)
redystrybucja p53 do mitochondriów i promowanie uwolnienia cytochromu c do cytoplazmy
poprzez tworzenie kompleksów z anty-apoptotycznymi białkami Bcl-2 i Bcl-xL oraz poprzez
bezpośrednią aktywację pro-apoptotycznych białek Bax i Bak; p53 w podobny sposób może
też działać w cytoplazmie.
25. Mechanizm wypływu cytochromu c – antagonistyczne działanie białek rodziny Bcl-2:
Zaproponowano kilka hipotez wyjaśniających uwolnienie cytochromu c po indukcji apoptozy:
A: VDAC + Bax = połączenie białka Bax z kanałem anionowym zależnym od napięcia
VDAC tworzy nowy większy por, przez który wychodzi cytochrom c,
B: Zamknięcie kanału VDAC skutkuje zaburzeniem homeostazy ATP/ADP, co powoduje
permealizację błony mitochondrialnej.
C: Interakcje Bax z białkami błony mitochondrialnej indukuje utworzenie megakanału PTP –
permeability transition pore, który składa się kanału anionowego VDAC w błonie
zewnętrznej mitochondrium, białka ANT (translokaza nukleotydów adeninowych w błonie
wewnętrznej), cyklofiliny D z matrix, kinazy kreatyninowej z przestrzeni międzybłonowej
oraz cytosolowej heksokinazy. Według tej hipotezy otwarcie megakanału powoduje spadek
potencjału błony mitochondrialnej, zaburzenie homeostazy jonowej mitochondrium, co

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki

prowadzi do puchnięcia mitochondrium i przerwania ciągłości błony mitochondrialnej i
uwolnienia cytochromu c.
D: W wyniku oligomeryzacji Bax i Bak w błonie mitochondrialnej powstają kanały, przez
które wycieka cytochrom c.
E: Wzrost ilości ROS i jonów wapnia może zaburzać działanie kanału VDAC (permealizacja
błony) i powodować pęcznienie matriks (wyciek cytochromu c). Mechanizm wzrostu ilości
ROS jest nieznany. ROS powodują także peroksydację lipidów, w tym kardiolipiny, z którą
związany jest cytochrom c w błonie wewnętrznej mitochondriów, co wydaje się przyczyniać
do uwolnienia cytochromu c.
26-27. Apoptoza – fakty i mity:

• Mechanizm uwolnienia cytochromu c z mitochondriów jest nieznany, nie wiadomo

jaką drogą jest uwalniany

• Nie wiadomo czy megakanał mitochondrailny PTP w ogóle istnieje
• Zamknięcie a nie otwarcie VDAC sprzyja uwolnieniu cytochromu c
• Wypływ cytochromu c następuje przed otwarciem PTP (permealizacją) i spadkiem

potencjału błonowego mitochondrium

• Wydaję się, że wypływ cytochromu c może być zależny od wcześniejszej aktywacji

kaspaz i tworzenie apoptosomu może być niezbędne tylko do przyspieszenia śmierci;
może to być tylko kolejny marker apoptozy, który nie jest absolutnie niezbędny do
zabicia komórki: brak Apaf-1 u samic, które przeżywają, nie powoduje zaburzeń, a u
samce są niepłodne, większość zwierząt nie przeżywa, ze względu na na zaburzenia
rozwoju mózgu - nadmiar komórek nerwowych; w innych tkankach brak Apaf-1 lub
brak przyłączania cyt. c do Apaf-1 opóźniał, ale nie blokował apoptozy.

Myszy

pozbawione czynnika indukującego apoptozę AIF umierają podczas embriogenezy,
ale bez objawów nadmiaru komórek

• Inne mutanty białka AIF (myszy arlekin) są bardziej wrażliwe na apoptozę niż oporne,

za to są bardzo wrażliwe na stres oksydacyjny – fizjologiczna rola AIF polega na
formowaniu kompleksu I w łańcuchu oddechowym

• Brak endonukleazy G nie powoduje zaburzeń apoptozy
• Wydaje się, że uwolnienie AIF i Endo G jest wydarzeniem późnym, następującym po

aktywacji kaspaz

• Brak ANT czy cyklosporyny A składników PTP nie zaburza apoptozy
• Delecja Smac/Diablo i Omi/HTrA2 nie powodują zaburzeń apoptozy; knockout

Omi/HtrA2 jest nawet bardziej wrażliwy na apoptozę, a ponadto obserwuje się
neuropatie związane z zaburzeniami funkcjonowania mitochondriów; funkcja
fizjologiczna Omi/Htr2A polega na niszczeniu lub naprawianiu białek o złej
konformacji

Wniosek: szlak mitochondrialny apoptozy może tylko wzmacniać i przyspieszać apoptozę i
nie jest jej głównym i absolutnie koniecznym induktorem.

1. Metody wykrywania apoptozy. Apoptoza u drożdży.

2. Metody wykrywania apoptozy:

1. Obserwacja mikroskopowa (kurczenie komórek, tworzenie ciałek apoptotycznych,

rozpad jądra, kondensacja chromatyny)

2. Utrata zdolności do usuwania barwników z komórek (propydylek jodu, trypan blue)
3. Fragmentacja DNA
4. Wykrywanie fosfatydyloseryny na powierzchni komórek
5. Wykrywanie nadprodukcji reaktywnych form tlenu
6. Utrata potencjału błony mitochondrialnej

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki

7. Uwolnienie cytochromu c z mitochondriów do cytoplazmy (analiza Western blot

frakcji mitochondrialnej i cytosolowej)

8. Wykrywanie cięcia prokaspaz (Western blot)
9. Wykrywanie enzymatycznej aktywności kaspaz
10. Wykrywanie cięcia substratów dla kaspaz (PARP, laminy, ICAD)

3. Obserwacja morfologii jądra komórkowego:
DNA jądrowe znakowane jest barwnikiem np. DAPI, który świeci na niebiesko w świetle
UV. W ten sposób można zobaczyć czy jądro stanowi jedną całość czy uległo fragmentacji.
4. Utrata zdolności do usuwania barwników z komórek (propydylek jodu - PI):
Żywe komórki nie akumulują niektórych związków, takich jak propydylek jodu, który świeci
na czerwono w mikroskopie fluorescencyjnym. Tylko martwe komórki – nekrotyczne lub
apoptotyczne z objawami nekrozy świecą na czerwono.
5. Wizualizacja cięcia DNA na fragmenty o różnej długości za pomocą elektroforezy
agarozowej (obraz drabinki DNA):
Po indukcji apoptozy aktywowane są endonukleazy, które tną DNA najpierw na duże
fragmenty o długości 200-300 tys. pz i 20-50 tys. pz, a potem między nukleosomami na
fragmenty o długości DNA nukleosomowego lub ich wielokrotności (180-200 pz). Za
tworzenie tych krótszych fragmentów odpowiedzialna jest endonukleaza CAD/DFF40, która
w normalnych warunkach hamowana jest przez białko ICAD/DFF45, które jest cięte przez
kaspazy wykonawcze. DNA cięte w wyniku apoptozy dają charakterystyczny obraz drabinki
w elektroforezie.
6. Wykrywanie złamań DNA za pomocą metody TUNEL:
TUNEL: Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP Nick-End Labeling.
Metoda ta służy do wykrywania fluorescencyjnie złamań DNA. Końce 3’-OH złamań
wykrywane są przez dodawanie do nich wyznakowanych fluorochromem deoksynukleotydów
(np. dUTP-FITC) za pomocą terminalnej deoksynukleotydylotransferazy (TdT). Sygnał
fluorescencyjny może być wykryty przez cytometrię przepływową lub w mikroskopie
fluorescencyjnym.
7. Wykrywanie fosfatydyloseryny na powierzchni komórek apoptotycznych:
Przemieszczenie fosfatydyloseryny (PS) z wewnętrznej do zewnętrznej warstwy błony
komórkowej (asymetrię błony zapewnia flipaza, która jest inaktywowana przez kaspazy;
jednocześnie aktywowana jest skramblaza/flopaza, która przemieszcza PS na zewnątrz błony
komórkowej). PS jest rozpoznawana przez receptor PSR na makrofagach; dodatkowo
apoptotyczne komórki wydzielają lizofofatydylocholinę, która stanowi chemoatraktant dla
komórek żernych. Do PS łatwo przyłącza się białko aneksyna V, która po wyznakowaniu
fluorochromem służy do wykrycia w mikroskopie lub cytometrii przepływowej wykrycia PS
na powierzchni komórek.
8. Wykrywanie obecności reaktywnych form tlenu (ROS):
Zwiększoną produkcję ROS w komórkach można wykrywać za pomocą dihydrorodaminy
123, która sama nie jest związkiem fluorescencyjnym, ale po utlenieniu przez ROS
przekształca się we fluorescencyjny związek rodaminę 123, która wyznakowuje komórki po
podwyższonym ROS.
9. Utrata potencjału błony mitochondrialnej:
Normalne mitochondria akumulują rodaminę 123, która nadaje komórkom wysoki poziom
fluorescencji. W przypadku obniżenia potencjału błonowego rodamina wypływa do
cytoplazmy i słabo wchodzi do mitochondriów, co powoduje, że rodaminę 123 można łatwo
wypłukać z komórek i obniżyć ich fluorescencję. Zatem komórki apoptotyczne charakteryzują
się obniżoną fluorescencją po inkubacji z rodaminą 123.

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki

10. Wykrywanie cięcia prokaspaz (Western blot):
Autoaktywację kaspaz można wykrywać sprawdzając za pomocą elektroforezy białkowej i
analizy Western, czy pojawią się podjednostki mała i duża kaspaz powstałych w wyniku
cięcia danej prokaspazy.
11-12. Wykrywanie enzymatycznej aktywności kaspaz:
Aktywne kaspazy rozpoznają jako substrat inhibitor w postaci peptydu VAD (walina-alanina-
kwas asparaginowy) połączonego z fluorochromem (FITC) oraz z fluorometyloketonem
(FMK); FMK kowalencyjnie łączy się z cysteiną w centrum aktywnym kaspazy, co trwale
inhibuje jej aktywność enzymatyczną, a jednocześnie wyznakowuje komórki fluoresceiną,
która nie może być teraz wypłukana z komórek, gdyż jest na stałe związana z kaspazami;
ester metylowy reszcie kwasu asparaginowego zapewnia łatwe wnikanie inhibitora do
komórek. Stosując podwójne barwienie z użyciem inhibitorów kaspaz i propydylku jodu
można wyróżnić cztery populacje komórek: populację A – żywe komórki (brak barwienia), B
– wczesne apoptotyczne komórki (wyznakowane tylko FITC), C- późne apoptotyczne
komórki (wyznakowane FILC, ale już martwe w wyniku apoptozy), populacja D- komórki
nekrotyczne (wyznakowane tylko propydylkiem jodu, brak aktywności kaspazowej).
13-15. Apoptoza u drożdży:
U drożdży można zaobserwować śmierć komórki z objawami apoptozy w odpowiedzi na
kilka czynników stresowych:

• szok osmotyczny (1.5 M NaCl)
• prom. UV (90-120 J/m2)
• wysokie stężenie feromonu

• chronologicznie stare komórki i hodowle
• stres oksydacyjny (H2O2)
• obniżenie pH (kwas octowy).

Obserwowanymi objawami apoptozy było: kondensacja chromatyny, fragmentacja jądra,
wykrywanie złamań DNA metodą TUNEL,

utrata asymetrii błony komórkowej (PS po

stronie zewnętrznej) oraz wzrost produkcji ROS.
Jednak obecność programowanej samobójczej śmierci u organizmu jednokomórkowego
wydawała się wątpliwa, gdyż nie ma ani fizjologicznego uzasadnienia dla takiej śmierci, bo
oznacza ona koniec organizmu (apoptoza u ssaków jest tylko elementem homeostazy
organizmu wielokomórkowego), ale także nie były znane żadne homologi znanych białek
pro- czy antyapoptotycznych u drożdży.
16-17. Odkrycie aktywności kaspazy u drożdżowej proteazy Yca1 podobnej do ludzkich
kaspaz:
Przełomowe wydawało się odkrycie homologa kaspazy u drożdży na podstawie
wyrafinowanych metod porównywania sekwencji białkowych. Okazało się, że u wielu
niższych organizmów, w tym u drożdży, zidentyfikowano całą rodzinę białek podobnych do
ssaczych kaspaz, które nazwano metakaspazami. Homologia między tymi białkami była
niewielka, ale absolutnie konserwatywne były reszty aminokwasowe tworzące centrum
aktywne ssaczych kaspaz: cysteina i histydyna.
Potem eksperymentalnie potwierdzono, że drożdżowa metakaspaza Yca1 wydaje się ulegać
aktywacji po indukcji stresem oksydacyjnym i pojawianie się takich markerów apoptozy jak
złamania DNA i produkcja ROS zależało od obecności w komórkach tego enzymu. Ponadto
brak białka Yca1 zwiększało przeżywalność komórek po stresie oksydacyjnym. Do
wykazania aktywności kaspazy Yca1 zastosowano klasyczne metody używane w badaniu
apoptozy u ssaków.

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki

18. Zaproponowany mechanizm apoptozy u drożdży:
Różne czynniki stresowe o niskim natężeniu indukują wzrost ROS, który w nieznany sposób
aktywuje kaspazę Yca1, która indukuje aktywację apoptozy poprzez fragmentowanie DNA,
kondesancję chromatyny, co prowadzi do śmierci.
19-20. Inaktywacja Cdc13p indukuje apoptozę zależną od kinazy Mec1:
Białko Cdc13 u drożdży jest przyłączone do telomerów i w ten sposób chroni je przed
rozpoznawaniem ich jako złamań DNA. Komórki z mutacją punktową cdc13-1 są normalne,
ale po przeniesieniu ich do wyższej temperatury (37°C) dochodzi do odłączenia białka cdc13
od telomerów, co aktywuje szlak sygnalny zależny od kinazy Mec1, który indukuje
zatrzymanie cyklu komórkowego w fazie G2/M, a potem śmierć. Niedawno na podstawie
wzrostu ilości ROS mierzonej barwieniem dihydrorodaminą 123 oraz znakowania inhibitorem
kaspaz FIC-VAD-FMK wysunięto wniosek, że śmierć mutanta cdc13-1 zachodzi drogą
apoptozy. Wykazano jednak później, że wszystkie zastosowane metody produkują
nieprawdziwe wyniki i wcale nie mierzą rzeczywistych procesów apoptotycznych, a same
komórki umierają w zupełnie inny sposób (patrz niżej).
21-22. Dowody na brak roli kaspazy Yca1 w indukowaniu śmierci komórek cdc13-1:
- inhibitor kaspaz FITC-VAD-FMK akumulowany jest zarówno przez pojedyncze mutanty
cdc13-1 jak i podwójne cdc13-1 yca1 mutanty pozbawione metakaspazy Yca1
- delecja genu metakaspazy YCA1 nie hamuje śmierci komórek cdc13-1 w temp. 37°C.
23-26. Dowody na to, że komórki drożdży niespecyficznie przyłączają fluorochromy i
inhibitory kaspaz:
- aktywacja kaspazy w komórkach cdc13-1 nie występuje w komórkach nieprzepuszczalnych
dla PI w temp. 37

C, zatem aktywacja kaspazy nie poprzedza śmierci komórek.

- dodanie inhibitora kaspaz Z-VAD-FMK nie hamowało akumulacji FITC-VAD-FMK w
komórkach cdc13-1, ani nie opóźniało śmierci komórek.
- martwe komórki cdc13-1 niespecyficznie przyłączają inhibitor kaspaz FITC-DEVD, jak
również same fluorochromy FITC czy fluoresceinę.
- komórki drożdży zabite wysoką temperaturą (80°C) akumulują inhibitor kaspaz FITC-VAD-
FMK.
27-31. Rola ROS w uśmiercaniu mutanta cdc13-1:
Stwierdzono, że następuje wzrost ilości ROS w żywych komórkach mutantach cdc13-1, co
poprzedza jego śmierć, ale dodanie antyoksydanta w postaci N-acetylocysteiny (NAC)
zmniejszające produkcję ROS, nie obniżało śmiertelności komórek cdc13-1 w temp. 37

Oznacza to, że komórki cdc13-1 umierają niezależnie od obecności ROS. Ponadto
stwierdzono frakcję komórek martwych o podwyższonej fluorescencji rodaminy 123, które
nie znikało jednak po dodaniu NAC, co wskazywało znowu na niespecyficzne barwienie
komórek martwych, co nie jest związane z aktywną produkcją ROS. Hipoteza ta została
potwierdzono przez barwienie DHR123 komórek martwych. Okazało się, że komórki drożdży
zabite wysoką temperaturą (80°C) wykazują niespecyficzny wzrost zielonej fluorescencji w
obecności DHR123. Kolejny dowód na to, że mutant cdc13-1 nie umiera na skutek apoptozy
indukowanej przez wzrost stężenia reaktywnych form tlenu: ekspresja antyapoptotycznego
białka ssaków Bcl-xL zmniejszała produkcję ROS w komórkach cdc13-1, ale nie wpływało to
na zwiększenie przeżywalności w temp. 37

31-32. Inaktywacja białka Cdc13p prowadzi do śmierci poprzez permanentne
zatrzymanie cyklu komórkowego na granicy faz G2/osmotycznego.
Komórki z dużym pączkiem potomnym stale rosną i stają się z czasem bardzo wrażliwe na
pęknięcie w miejscu złączenia obu pączków. Dodanie osmotycznego stabilizatora zwiększało
przeżywalność mutanta cdc13-1 inkubowanego w niepermisyjnej temperaturze 37

C, co

potwierdza, że te mutanty umierają w wyniku pękania komórek, a nie apoptozy.

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki

33. Komórki drożdży niespecyficznie przyłączają fluorochromy i inhibitory kaspaz nie
mogą być stosowane u drożdży:
Zostało to potwierdzone przez niezależnych badaczy.
34. Alternatywą dla inhibitora kaspaz u drożdży może być D2R (Asp-Rhodamina110-
Asp), ale wykrywamy tylko aktywność proteazową:
Stosując związek D2R można wykrywać aktywność proteazową w komórkach drożdży bez
niespecyficznego znakowania martwych komórek, bowiem D2R staje się związkiem
fluorescencyjnym tylko w żywych komórkach po enzymatycznym odcięciu reszt kwasu
asparaginowego.
36. Metoda TUNEL też produkuje artefakty u drożdży:
Czynniki „apoptotyczne” u drożdży nie indukują dwuniciowych pęknięć DNA. Okazało się,
że metoda TUNEL u drożdży wykrywa pęknięcia pojedynczych nici DNA, a nie podwójnych
tak jak u ssaków.
37. Nowe odkrycia na temat „apoptozy” u drożdży:
Zidentyfikowano drożdżowe homologi ludzkich anty- i proapoptotycznych białek oraz
wykazano ich rolę w apoptozie u drożdży: np. Nma111 (HtrA2/OMI), Ndi1(AIF lub AMID),
Dnm1 (Drp1), Fis1 (odpowiednik funkcjonalny Bcl-2), Bir1 (XIAP), a Bir1 jest substratem
dla Nma111. Podczas apoptozy wywołanej stresem oksydacyjnym indukowana jest
fosforylacja histonu H2B-Ser10, co niezbędne jest do kondensacji chromatyny i być może do
degradacji DNA, ale proces ten jest niezależny od Yca1. Odkryto także regulowaną śmierć w
centrum starej kolonii, ale niezależną od Yca1 i AIF.
38. Apoptoza u drożdży: – fakt? – artefakt? – raczej brak na razie dostatecznych
dowodów na istnienie apoptozy u drożdży:
Apoptoza u drożdży ma na razie charakter czysto opisowy: opisywana jest apoptoza w
różnych warunkach i u różnych mutantów. Brak jest w tej chwili dowodów molekularnych na
istnienie regulowanego/zaprogramowanego szlaku śmierci. Nie wiadomo czy ROS są
induktorem czy regulatorem programowanej śmierci. Nie zaobserwowano na razie
jakiejkolwiek współdziałania między zidentyfikowanymi drożdżowymi homologami ludzkich
białek proapoptotycznych. Nie wiadomo czy drożdżowych białka proapoptotyczne mają inne
ważne funkcje poza apoptozą, a ich udział w apoptozie jest przypadkowy zgodnie z regułą
„złe białko w złym miejscu”. W zdecydowanej większości publikacji metody wykrywania
markerów apoptozy u ssaków zastosowana została bez stosownych kontroli, bez kalibracji,
bez wiedzy, co daną metodą wykrywamy u drożdży. Nie wiadomo, w jaki sposób powstają
markery apoptozy u drożdży i czy one są faktycznym powodem śmierci komórki (na czym
polega faza zniszczenia, czy może cechy te tylko pojawiają podczas pewnych typów śmierci u
drożdży. Nie wyznaczono tzw. „point of no return” dla apoptozy u drożdży i nie wiadomo czy
cechy apoptotyczne są odwracalne. Brak dowodów, że metakaspaza Yca1 jest
odpowiednikiem funkcjonalnym ludzkich kaspaz; nieznane są aktywatory, inhibitory i
substraty dla Yca1, nie udało się wykazać aktywności kaspazowej in vitro, nie jest znana
żadna rola fizjologiczna dla tej proteazy. Trudno zdefiniować rolę fizjologiczną samobójczej
śmierci organizmu jednokomórkowego (usuwanie starych komórek z populacji, altruistyczna
śmierć dla dostarczenia środków odżywczych, usuwanie komórek, które się nie krzyżują). Nie
można wykluczyć regulowanej/programowanej śmierci u mikroorganizmów, ale nie musi ona
zachodzić identycznie jak apoptoza u organizmów wielokomórkowych; lepszą strategią
byłoby poznawanie tych procesów u drożdży bez bezkrytycznego i często na siłę
odwoływania się do apoptozy.

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki

1. Degradacja białek. Lizosomy. Autofagia. Peroksysomy.

2-3. Homeostaza komórki:
Homeostaza komórki jest utrzymywana przez dokładnie regulowany mechanizm
równoważenia syntezy i degradacji składników komórki. Białka o krótkim czasie półtrwania
ulegają w cytoplazmie degradacji za pomocą systemu proteasomowego zależnego od
ubikwityny; proces ten jest selektywny i odbywa się w cytosolu. Drugi mechanizm mniej
selektywny zachodzi w lizosomach, gdzie znajdują się hydrolazy. Białka i inne długotrwałe
składniki oraz całe organelle są trawione na drodze autofagii.
4. Ubikwityna:
Małe, obojętne białko, złożone z 76 aminokwasów o masie 8,6 kDa. Ubikwityna występuje u
wszystkich eukariontów i wykazuje bardzo wysoką konserwatywność sekwencji, np.
drożdżowa i ludzka ubikwityna różnią się tylko trzema aminokwasami. Ubikwityna
zbudowana jest z jednej globularnej domeny, utworzonej z pięciu harmonijek β oraz jednej α-
helisy; rdzeń białka jest silnie hydrofobowy oraz kilka skupień apolarnych aminokwasów na
powierzchni. Z powierzchni cząsteczki wystaje ogon zakończony C-terminalną glicyną, za
pomocą której jest przymocowana do aktywującego enzymu E1, a potem do substratu
białkowego.
5. Funkcje ubikwitynacji:

• Poliubikwitynacja: sygnał do degradacji
• Monoubikwitynacja:
- Endocytoza (włączanie białek do błony komórkowej)
- Sortowanie białek
- Regulacja ekspresji (regulacja lokalizacji czynników transkrypcyjnych między jądrem

a retikulum)

- Naprawa DNA i odpowiedź na uszkodzenia DNA (modyfikacja histonu H2B)

6-7. Trzystopniowa reakcja ubikwitynacji:
E1 – enzym aktywujący ubikwitynę (jeden enzym); najpierw przy udziale ATP powstaje
ubikwitynoadenylan z wydzieleniem PPi, a następnie zaktywowana ubikwityna zostaje
przeniesiona na grupę –SH cysteiny w enzymie E1 z wytworzeniem wiązania tioestrowego i
uwolnieniem AMP.
E2 – enzym przenoszący ubikwitynę na substrat (kilka enzymów, u drożdży 13 białek Ubc);
enzym E2 przejmuje ubikwitynę z enzymu E1 w reakcji transestryfikacji.
E3 – ligaza ubikwitynowa (setki enzymów o różnej specyficzności substratowej); pośredniczy
w przeniesieniu ubikwityny z enzymu E2 na resztę lizyny w substracie; E3 rozpoznaje
substrat jak i odpowiedni enzym E2; enzym E3 spełnia rolę tylko pomostu zbliżając do siebie
substrat i enzym E2-Ub, a w przypadku białek E3 z domeną HECT przejmuje ubikwitynę z
E2, a potem przenosi ją na substrat; na tym etapie dochodzi również do poliubikwitynacji;
wyróżniamy cztery typy ligaz ubikwitynowych E3: rodzina HECT (domena HECT służy do
przyłączenia enzymu E2-Ub, a drugim końcem przyłącza substrat, który jest rozpoznawany
przez sekwencję-sygnał zwany degronem; rodzina RING (nazwa rodziny od
charakterystycznej domenie rozpoznawanej przez enzym E2); oraz rodzin typu kulina i APC
(zobacz wykład o regulacji cyklu komórkowego, gdzie oba kompleksy zostały omówione
szczegółowo).
8. Kompleks proteasomu 26S:
Proteasom składa się z części korowej 20S zbudowanych z czterech pierścieni, każdy złożony
z siedmiu podjednostek. Wnętrze cylindra stanowią domeny, które maja aktywność peptydaz.
Z obu końców część korowa jest zamknięta jednostką regulacyjną 19S, złożoną z podstawy i
wieczka. Rolą tej jednostki jest przyłączenie poliubikwitynowych substratów, odcięcie
cząsteczek ubikwityny, rozwinięcie substratu oraz wciągnięcie do cylindra, gdzie peptyd
ulega degradacji.

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki

9. Rodzina białek ubikwitynowych:

• Ubikwityna
• SUMO (Small Ubiquitin-related MOdifier), odkryte w 1996 r. jako kowalencyjna

modyfikacja RanGEF, o indukuje jądrową lokalizację tego białka; u ssaków 4
izoformy

• Nedd8
• ThiS: prokariotyczne białko przenoszące siarkę na organiczne kofaktory, np. tiaminę
• Atg8 i Atg12 biorą udział w reakcjach podobnych w mechanizmie do ubikwitynacji

(podczas autofagii)

10. Sumoilacja:
Proces dodawania cząsteczki SUMO do białka zachodzi identycznie jako proces
ubikwitynacji z udziałem specjalnych enzymów E1, E2 i E3, ale samo SUMO po syntezie
musi ulec obróbce w postaci odcięcia C-końca, tak aby na końcu znajdowała się reszta
glicyny, która bierze udział we wszystkich reakcjach przyłączania SUMO.
11. Funkcje sumoilacji – inhibicja transkrypcji oraz kierowanie białek do jądra i do
struktur subjądrowych np. do ciałek PML:
SUMO blokuje inne modyfikacje np. ubikwitynację czy acetylację (brak degradacji lub
interakcji z innymi białkami) albo prowadzi do zmian konformacyjnych w białku, co może
też wpływać na jego interakcje z innymi białkami; np. na przykład SUMO może umożliwiać
przyłączanie korepresorów. SUMO może też przyciągać deacetylazy histonowe HDAC, które
przyczyniają się do kondensacji chromatyny i represji transkrypcji; HDAC może też
promować sumoilację czynnika transkrypcyjnego przez usuwanie grupy acetylowej z lizyny
na czynniku transkrypcyjnym; samo HDAC może ulegać aktywacji po sumoilacji.
12. Lizosomy:

• Pęcherzyki o średnicy 0,2-1,0 µm, zbudowane z pojedynczej błony, w liczbie kilkaset

na komórkę, zawierają kwaśne enzymy hydrolityczne w liczbie około 40-stu

• Występują u wszystkich eukariontów; brak u bakterii: kwaśna hydroliza odbywa się w

przestrzeni między ścianą a błoną komórkową

• Wewnątrz lizosomów kwaśne pH 4.5-5,0 dzięki działaniu pomp protonowych

zależnych od ATP: H+-ATPaza

• Funkcja: kontrolowane trawienie substancji odżywczych lub toksycznych

pochodzących z zewnątrz komórki lub jej wnętrza; rozkład białek, wielocukrowców,
lipoprotein, kwasów nukleinowych

• Enzymy: lipaza, sfingomielinaza, nukleazy, fosfatazy, katepsyny, galaktozydazy,

galaktozaminidaza, itd.

• Same enzymy lizosomalne są chronione przed trawieniem przez glikolizację
• Strawione cząstki są wydalane do cytoplazmy
• Wyróżniamy lizosomy pierwotne (zawierające hydrolazy, ale bez substratów) i wtórne

(lizosomy pierwotne po połączeniu z wakuolami autofagowymi lub endosomami i
fagosomami)

13-14. Formowanie lizosomów pierwotnych:

• Synteza nieaktywnych prekursorów enzymów lizosomowych na szorstkim retikulum

endoplazmatycznym

• Nieaktywne enzymy są lokalizowane w świetle retikulum endoplazmatycznym, gdzie

podlegają glikozylacji (dodawane są dwie reszty oraz 8 cząsteczek mannoz, a na
końcu przy udziale fosfotransferazy do jednej z cząsteczek mannoz zostaje dodana
fosfo-N-acetyloglukozoamina)

• Pęcherzyki zawierające enzymy odpączkowują od retikulum i kierują się do aparatu

Golgiego

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki

• Nieaktywne enzymy nabywają sygnał kierujący do lizosomów (N-

acetyloglukozoamina zostaje odcięta przez diesterazę i pozostaje mannowo-6-
fosforan, który jest sygnałem kierującym białka do lizosomów), łączą się z
odpowiednim receptorem w cysternie Trans aparatu Golgiego i odpączkowują kierując
się do lizosomów

• Po dostarczeniu enzymu do lizosomu enzym odłącza się od receptora na skutek

obniżenia pH, a receptor wraca do aparatu Golgiego

15. Formowanie lizosomów wtórnych:
Lizosomy pierwotne przekształcają się w lizosomy wtórne po połączeniu z autofagosomem,
fagosomem lub endosomem, a po strawieniu dostarczonych substratów lizosom przekształca
się w ciałko resztkowe.
16. Choroby związane z dysfunkcją lizosomów:

• Brak specyficznej hydrolazy prowadzi do wypełnienia lizosomów zagęszczonymi

substancjami, co uniemożliwia normalne działanie lizosomów:

- mukopolisacharydozy (choroba Hurleya, deformacja kości)
- choroba wtrętów/inkluzji komórkowych spowodowana jest brakiem wielu hydrolaz w

lizosomach; przyczyną choroby jest brak fosfotransferazy i na enzymach
lizosomalnych w aparacie Golgiego nie powstaje znacznik Man-6-P, który kieruje
wszystkie hydrolazy do lizosomów

- gangliozydaza Taya-Sachsa (brak heksozaminidazy, gangliozydy nagromadzają się w

błonie komórkowej komórek mózgu; prowadzi to znacznych zaburzeń układu
nerwowego: niedorozwój umysłowy, osłabienie mięśniowe, wiśniowa plamka oczna
na siatkówce i postępujące niedowidzenie, śmierć następuje w ciągu 5 lat)

- Zidentyfikowano prawie 40 różnych dziedzicznych chorób związanych z dysfunkcją

lizosomów

17. Autofagia = samotrawienie:

• Jest to proces zależny od lizosomów/wakuoli, które zawierają szereg enzymów

hydrolitycznych, co pozwala na degradację na ich terenie wszystkich składników
komórkowych

• Mechanizm dostarczenia składników i organelli komórkowych do lizosomów w celu

strawienia nazywamy autofagią

• Proces ten jest konserwatywny i występuje u wszystkich komórek eukariotycznych
• Indukowany jest przez:
- stres zewnętrzny: głównie przez brak substancji odżywczych (adaptacja do warunków

głodowych; uzyskanie niezbędnych do przeżycia składników odżywczych) oraz inne
czynniki stresowe (wysoka temperatura, zbyt dużo komórek, niedotlenienie)

- stres wewnętrzny: akumulacja uszkodzonych struktur i organelli (usuwanie

uszkodzonych organelli i struktur zaburzających metabolizm)

- usuwanie wewnątrzkomórkowych patogenów (ograniczenie infekcji)

18. Proces autofagii:
Autofagia rozpoczyna się od tworzenia błonowej struktury preautofagosomalnej (PAS: pre-
autophagosomal structure), której pochodzenie i sposób formowania nie jest znane. Następnie
PAS zaczyna się rozrastać i zawijać zamykając stopniowo fragment cytoplazmy z
zawartością, w tym nawet całe organella, tworząc charakterystyczną strukturę fagoforu.
Dokładny mechanizm tworzenia się fagoforu jest również słabo poznany i może przebiegać
poprzez dołączanie małych pęcherzyków błonowych lub większych cystern do PAS. Kolejne
stadium autofagii to autofagosom zbudowany z pęcherzyka z zamkniętym w środku
fragmentem cytoplazmy. Ostatni etap autofagii to połączenie autofagosomu z lizosomem i
utworzenie autofagolizosomu, w którym następuje trawienie zawartości komórkowej.

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki

19. Funkcje autofagii:

• Organizmy jednokomórkowe: przeżycie warunków głodowych
• Organizmy wielokomórkowe:
- Eliminacja nienormalnych struktur komórkowych
- Regulacja liczby komórek, rola w rozwoju i różnicowaniu
- Typ II programowanej śmierci komórki niezależnej od kaspaz
- Adaptacja do warunków głodowych
- Obrona przed patogenami
- Obrona przed komórkami nowotworowymi
- Umożliwia przeżycie noworodkom w okresie zaraz po urodzeniu, ale zanim

rozpocznie się karmienie (szczególnie wrażliwe jest serce; noworodek mysi
pozbawiony genu ATG5 umiera pierwszego dnia życia)

- Ochrona przed starzeniem (usuwanie uszkodzonych struktur; autofagia jest

aktywowana przez dietę niskokaloryczną)

20. Funkcje autofagii – obrona przed patogenami, czyli ksenofagia:
Ksenofagia to trawienie wewnątrzkomórkowych patogenów (np. Mycobacterium tuberculosis
lub Streptococcus grupyA) na drodze autofagii. Pojawienie się patogenu w cytoplazmie
indukuje tworzenie autofagoforu wokół patogenów, które zostają strawione w później
utworzonym autofagolizosomem. Patogen nie tylko zostaje unicestwiony, ale ksenofagia
dostarcza także antygenów, które stymulują układ odpornościowy. W niektórych przypadkach
zamknięcie patogenu w pęcherzyku autofagosomowym sprzyja namnażaniu bakterii.
21. Autofagia jako mechanizm opóźniający starzenie:
Rośliny pozbawione możliwości autofagii wykazują szybką utratę chlorofilu (chloroza),
przyspieszone obumieranie liści, co wynika z konieczności dostarczenia składników
odżywczych do nasion; w normalnych warunkach jest to znaczne opóźnione dzięki
uzyskiwaniu składników na drodze autofagii.
22. Skutki deregulacji autofagii:

• Choroby mięśni – niektóre dziedziczne miopatie spowodowane nagromadzeniem

autofagowych wakuoli

• Choroby neurodegeneracyjne – brak usuwania agregatów białkowych
• Rozwijanie infekcji bakteryjnych i wirusowych: niektóre patogeny hamują

dojrzewanie autofagosomu, który staje się miejscem namnażania patogenu

• Choroby wątroby spowodowane nadmierną autofagią
• Nowotwory: autofagia może ułatwiać przeżywanie komórek nowotworowych w

warunkach głodowych (przy słabym ukrwieniu guza) i usuwać uszkodzenia
wynikające z chemoterapii – inaktywacja autofagii w późnym stadium guza miałyby
tutaj efekt antynowotworowy; we wczesnym stadium nowotworu autofagia przyczynia
się do redukcji guza.

23. Typy autofagii:

• Makroautofagia – przebiega z utworzeniem autofagosomu
• Mikroautofagia – fragment cytoplazmy ulega sekwestracji bezpośrednio przez

lizosom dzięki inwaginacjom błony lizosomowej

• Autofagia zależna od białek opiekuńczych – białka są dostarczane do lizosomów

przez białka opiekuńcze, które rozpoznają receptory w błonie lizosomowej

• Peksofagia (tylko u drożdży)– autofagia peroksysomów, która może zachodzić na

drodze mikro- (mikropeksofagia) lub makroautofagii (makropeksofagia)

• Mitofagia – autofagia mitochondriów

24. Szlak Cvt u drożdży (cytoplasma to vacuole targeting):
Mechanizm dostarczania aminopeptydazy I do wakuoli: prekursor Ape1 w cytoplazmie
tworzy oligomer, do którego przyłącza się receptor kargo Atg19, a do niego przyłącza się

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki

adaptor Atg11; powstały kompleks Cvt indukuje powstawanie struktury preautofasomalnej
PAS (mechanizm nieznany), a potem łączy się z Atg8 na powierzchni PAS znajdującym się
przy wakuoli, co indukuje przyłączanie innych białek Atg i utworzenie pęcherzyka Cvt, który
potem łączy się z wakuolą. Po indukcji autofagii Atg11 indukuje tworzenie autofagosomu
zamiast indukcji cvt.
25. Indukcja autofagii – powstanie kompleksu ATG13-ATG1-ATG17-ATG11 oraz
fosforylacja fosfatydyloinozytoli w błonie PAS:
W normalnych warunkach kompleks ATG13-ATG1-ATG17-ATG11 nie może powstać, gdyż
ATG13 jest utrzymywany w stanie hiperfosforylowanym, który uniemożliwia utworzenie
tego kompleksu. Aby zmniejszyć ufosforylowanie ATG13, zaktywowana musi być
specyficzna fosfataza, która jest jednak hamowana przez szlak sygnałowy TOR w
normalnych warunkach. Dopiero brak pożywienia hamuje szlak TOR, co uaktywnia fosfatazę
defosforylującą ATG13. Warunki głodowe indukują również związaną z PAS kinazę
fosfatydyloinozytolową, która fosforyluje fosfatydyloinozytole w błonie PAS, co być może
umożliwia przyłączanie białek, tzw. autofagin, warunkujących proces autofagii.
26. Formowanie autofagosomu:
Do utworzenia autofasomu niezbędne jest powstanie kompleksu Atg12-Atg5-Atg16 i
aktywacja białka Atg8, a także ich inkorporacja do PAS. Powstanie kompleksu Atg12-Atg5-
Atg16 jest wieloetapowe i obejmuje reakcje podobne do ubikwitynacji, gdzie Atg12 jest
najpierw aktywowane przez białko Atg7 (odpowiednik enzymu E1), potem Atg12 jest
przeniesiony na białko Atg10 (odpowiednik E2), by w końcu połączyć się z Atg5. Do dimeru
Atg12-Atg5 dołącza się Atg16, który wtedy łączy się z trzema innymi trimerami Atg12-Atg5-
Atg16. Ten wieloskładnikowy kompleks integruje się z błoną PAS. Aktywacja białka Atg8 z
kolei rozpoczyna się od odcięcia C-końca przez proteinazę cysteinową Atg4. Atg8 przez
nową C-końcową resztę glicyny łączy się z Atg7 (odpowiednik enzymu E1), potem Atg8 jest
przeniesione jest na białko Atg3 (odpowiednik E2), by w końcu połączyć się z
fosfatydyloetanolaminą w błonie PAS, prawdopodobnie przy udziale kompleksu Atg12-Atg5-
Atg16. Atg8 może być później odcinany z PAS, by zwiększyć jego pulę w cytoplazmie, co
umożliwia jego wprowadzenie do innych pęcherzyków, które zapewniają rozrost PAS do
autofasomu.
27. Peroksysomy:

• Pęcherzyki o średnicy 0,2-1,0 µm, zbudowane z pojedynczej błony, zawierające

oksydazy tworzące nadtlenek wodoru i katalazę oraz peroksydazę, które nadtlenek
wodoru rozkładają

• Funkcje: β-oksydacja kwasów tłuszczowych, katabolizm puryn, cykl glioksylanowy

roślin (ciąg reakcji, w wyniku których dwuwęglowe reszty kwasu octowego - acetylo-
CoA przekształcają się w czterowęglowy kwas bursztynowy, co umożliwia
przekształcanie tłuszczów w cukrowce; glioksysomy), synteza fosfolipidów eterowych
– plazmalogen (składnik mieliny) i soli kwasów tłuszczowych; utlenianie toksycznych
związków w wątrobie (np. utlenianie etanolu)

• Peroksysomy i glioksysomy nazywamy mikrociałami

28. Enzymy peroksysomów:
Podstawowe enzymy peroksysomów to oksydazy flawoproteinowe, które przy udziale tlenu
utleniają szereg substratów. Produktem ubocznym jest toksyczny nadtlenek wodoru, który jest
rozkładany do wody i tlenu przy udziale katalizy lub do samej wody przez peroksydazę,
czemu towarzyszy utlenienie alkoholu lub aldehydu.
29-30. Biogeneza peroksysomów:
Długo niewyjaśnione pozostawało pochodzenie peroksysomów. Na endosymbiontyczne
pochodzenie peroksysomów wskazywało to, że powstają przez podział istniejących
peroksysomów, a specyficzne białka błony i matriks peroksysomów syntetyzowane są na

Molekularna organizacja komórki – wykład dla III roku mikrobiologii, 2006, Robert Wysocki

wolnych rybosomach i transportowane są następnie do wnętrza peroksysomów. Peroksysomy
mogą też być wytworem retikulum endoplazmatycznego, gdyż są otoczone tylko pojedynczą
błoną, nie posiadają własnego DNA i białka peroksysomowe nie mają specyficznych
presekwencji kierujących i peroksysomowe nie ulegają żadnym cięciom. Ostatnio
udowodniono jak zachodzi biogeneza peroksysomów z retikulum. Do błony retikulum
endoplazmatycznego włącza się białko Pex3, do którego przyłącza się następnie białko
Pex19. Kompleks Pex3-Pex19 umożliwia powstanie pęcherzyka oraz import innych białek
charakterystycznych dla peroksysomów do wnętrza tego pęcherzyka, co w końcu daje w pełni
funkcjonalny peroksysom. Peroksysomy dzielą się przez podział, który polega na wydłużeniu
dużego pęcherzyka i jego fragmentacji na kilka mniejszych, które potem rosną i z czasem
dostarczony zostaje do nich komplet enzymów peroksysomalnych.
31. Dysfunkcja peroksysomów:
Adrenoleukodystrofia związana z chromosomem X: spowodowana akumulacją
długołańcuchowych kwasów tłuszczowych w cytosolu; kwasy te nie są transportowane do
wnętrza peroksysomów, gdzie są rozkładane; mutacja w genie ABCD1 kodującym ABC
transportera, dla którego kwasy tłuszczowe są substratem; choroba charakteryzuje się
degeneracją układu nerwowego.
Choroba Zellwegera spowodowana jest redukcją lub brakiem funkcjonalnych peroksysomów
w komórkach wątroby, nerek i mózgu. Wynika z braku peroksyny Pex2, która bierze udział w
imporcie enzymów peroksysomalnych do pęcherzyków. Choroba objawia się tuż po
urodzeniu zaćmą, torbielowatością rdzenia nerek, wadami serca, nieprawidłową mielinizacją
włókien nerwowych nerwów obwodowych, deformacją czaszki opóźnionym rozwojem
psychoruchowym, złogami wapniowymi w szpiku kostnym. Śmierć następuje w ciągu kilku
tygodni lub miesięcy.

Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Materiał genetyczny, mutacje, systemy naprawy DNA, test Amesa
3 Systemy naprawcze w DNA
Uszkodzenia i naprawa DNA obieralny prof E Pastwa
Materiał genetyczny, mutacje, systemy naprawy DNA,
biologia, NAPRAWA DNA, Mechanizmy naprawy oksydacyjnych uszkodzeń DNA
Naprawa DNA Biotechnologia e biotechnologia
Wpływ poszczególnych?fektów naprawy DNA w nowotworach i starzenia się był przedmiotem?dań
BM4 Mutacje i naprawa DNA
IG.4 - Uszkodzenia i naprawa DNA w komórkach nowotworowych, Genetyka, Inżynieria genetyczna
genetyka, Cwiczenie 8, Wrodzone zaburzenia naprawy DNA predysponujace do wystapienia nowotworów
mutacje i naprawa DNA rozpiska, 08. MEDYCYNA, 1.Analityka medyczna, I rok, Genetyka, mutacje
Mutacje i mechanizmy naprawy DNA
naprawa DNA
naprawa DNA
Mechanizm uszkodzenia i naprawy DNA, Patologia i choroby
Naprawa DNA

więcej podobnych podstron