Mutacje i mechanizmy naprawy DNA
Mutacja- Zmiana dziedziczna powstająca wskutek zmiany genu w jego nowy allel
(mutacja genowa), zmiany struktury chromosomu (mut. Chromosomowa
strukturalna), zmiany liczby chromosomów (mut. liczbowa), bądź zwielokrotnienie
haploidalnego zestawu chromosomów (mut. genomowa).
1.
Mutacje genowe
•
Mutacją genową nazywamy zmianę sekwencji nukleotydów w obrębie
genu na inną od sekwencji nukleotydów genu wyjściowego.
Najprostszym przykładem mutacji genowej jest
mutacja punktowa, czyli
obejmująca 1 parę zasad:
•
Tranzycja: zmiana jednej zasady purynowej na inną purynową
(pirymidynowej na pirymidynową)
•
Transwersja:
zmiana
zasady
purynowej
na
pirymidynową
lub odwrotnie
•
Delecja: wypadnięcie jednej lub większej liczby par nukleotydów
z danego genu
•
Insercja: wstawienie pojedynczej lub większej liczby par
nukleotydów do danego genu.
Mutacje genowe mogą doprowadzać do różnych, mniej lub bardziej
poważnych następstw:
•
Zmiany sekwencji aminokwasów w polipeptydzie kodowanym przez
zmutowany gen. Takie zjawisko nazywamy
mutacją zmiany sensu
•
Przerwania syntezy łańcucha polipeptydowego jeśli powstanie triplet
nonsensowny (kodon STOP);
mutacja nonsensowna
•
Do mutacji niemej, jeśli powstanie triplet synonimiczny
W wyniku delecji lub insercji pewnej liczby nukleotydów, innej
niż wielokrotność trzech następuje
zmiana ramki odczytu i powstający
produkt ma zmienioną sekwencję aminokwasów od miejsca wystąpienia
mutacji do C- końca.
Skutkiem mutacji nonsensownych są takie choroby jak: mukowiscydoza,
fenyloketonuria, alkaptonuria, retinoblastoma.
2.
Mutacje (aberracje) chromosomowe
Wszelkie zmiany w strukturze i liczbie chromosomów. Mogą powstawać zarówno
w komórkach somatycznych, jak i w gametach. Mogą być dziedziczne lub
powstawać de novo.
Aberracje strukturalne: mogą dotyczyć pojedynczej lub obydwu chromatyd.
Ich przyczyną jest przerwanie ciągłości chromatydy lub chromosomu. Mogą
prowadzić do:
•
Delecji (usunięcia/ deficjencji) fragmentu chromosomu. Gdy dotyczy
odcinka końcowego mówimy o
delecji terminalnej, jeśli z kolei chodzi
o fragmenty ze środka chromosomu stosujemy termin
Delecja
interstycjalna. Delecja dotyczyć może nawet bardzo dużych
fragmentów chromosomu. Niektóre chromosomy posiadają odcinki
wykazujące szczególną podatność na złamania (kruche miejsca genomu).
Miejsca takie u człowieka występują m.in. na chromosomie 2, 6, 9 12, 20
oraz X (jego złamanie skutkuje upośledzeniem umysłowym u mężczyzn,
u kobiet bezobjawowe nosicielstwo). Delecje dużych fragmentów są
z reguły letalne.
•
Inwersji: odwrócenia odcinka chromosomu o 180
o
co powoduję zmianę
pozycji genów, mogącą mieć wpływ na zmianę ich ekspresji. Jeśli
inwersja dotyczy fragmentu chromosomu wraz z centromerem
nazywamy ją
eucentryczną, jeśli zaś inwertowany fragment nie zawiera
centromeru używamy terminu
acentryczna.
•
Translokacji: przeniesienia części chromosomu na inny. Translokacje
polegające
na
wymianie
odcinków
między
chromosomami
niehomologicznymi nazywamy
translokacją wzajemną. W takim
przypadku nie zmienia się liczba chromosomów, lecz zmianie ulega ich
budowa. Innym typem translokacji są
translokacje robertsonowskie
(u człowieka dot. tylko chromosomów akrocentrycznych). Polega ona
na łączeniu się całych lub prawie całych ramion długich dwóch różnych
chromosomów (połączenie centryczne). Miejscem połączenia jest rejon
centromeru. Dochodzi do utraty funkcjonalnie nieistotnej części mat.
Genetycznego (ramion krótkich). W konsekwencji translokacji
zrównoważonych nie zmienia się ilość mat. Genetycznego, ale następuje
zmiana
jego
lokalizacji
(45
chromosomów
metafazowych).
W translokacji niezrównoważonej następuje powiększenie ilości mat.
Genetycznego o dodatkową kopię translokowanego chromosomu (dwa
homologiczne chromosomy teocentryczne mogą koniugować z jednym
metacentrycznym wskutek czego powstaje triwalent), chociaż liczba
chromosomów wynosi 46. w takim przypadku zawsze dochodzi do
ujawnienia się choroby.
•
Duplikacji: podwojenia fragmentu chromosomu, co może mieć istotne
znaczenie ewolucyjne (duplikacja sekwencji hemoglobiny). Duplikowane
kopie genów mogą występować jako bezpośrednie powtórzenia
(tandemowe) lub jako odwrócone względem siebie
•
Utworzenia
chromosomu kolistego (wskutek tworzenia się lepkich
końców w miejscach pęknięć chromosomów. Na końcach prawidłowych
chromosomów znajdują się telomery zabezpieczające przed ich
wzajemnym
łączeniem
się
),
dwucentromerowego
lub
izochromosomu (postaje wskutek poprzecznego podziału centromeru
chromosomu metafazowego i składa się z połączonych ramion krótkich
lub długich; jego powstanie skutkuje ubytkiem genów zawartych na
utraconych ramionach i podwojenie liczby w ramionach, które go
utworzyły
). U człowieka chromosom kolisty najczęściej powstaje
z chromosomów 4, 13, 18 oraz X. powodują liczne zaburzenia rozwojowe,
najczęściej jednak nie tworzą zdefiniowanych zespołów chorobowych.
Aberracje
liczbowe
chromosomów
powstają
najczęściej
wskutek
nondysjunkcji par chromosomów homologicznych podczas podziałów.
Wyróżniamy dwie ich kategorie:
•
Aneuploidie: powstają w wyniku zwiększenia lub zmniejszenia 2n
liczby chromosomów o pojedyncze chromosomy. Najczęściej wskutek
nondysjunkcji. Nondysjunkcji może wystąpić zarówno w oogenezie jak
i spermatogenezie. Skutkuje powstaniem gamet
disomicznych lub
nullisomicznych. Do aneuploidii zalicza się aberracje liczbowe
zarówno chromosomów homologicznych, jak i płciowych. Może
skutkować powstaniem
disomii uniparentalnej; występowaniem
w organizmie pary chromosomów pochodzących od jednego rodzica
(patrz zespół Angelmana i PW)
•
Euploidiy mają zwielokrotniony cały zestaw chromosomów. Wyróżnia
się
2
typy
poliploidii;
autopoliploidia
i
allopoliploidia.
W autopoliploidiach garnitur chromosomów jest zwielokrotniony o ten
sam zestaw chromosomów, są one z reguły letalne. Allopoliploidy mają
z kolei 2 lub więcej niehomologicznych zespołów chromosomów, nie
występują u człowieka.
3.
Czynniki mutagenne
Czynniki mutagenne dzielimy na
•
Fizyczne
1.
promienie X
2.
promienie alfa beta i gamma
3.
protony i neutrony emitowane przy rozpadzie promieniotwórczym
4.
promieniowanie kosmiczne
5.
promieniowanie niejonizujące (UVA i UVB)
•
Chemiczne
1.
kwas azotowy III
2.
hydroksylamina
3.
związki alkilujące (sulfonian dietylowy, iperyt azotawy)
4.
analogi zasad azotowych (2-aminopuryna 5-bromouracyl)
5.
barwniki akrydynowe (proflawina)
6.
wolne rodniki tlenowe
7.
nadtlenki
8.
policykliczne węglowodory aromatyczne
9.
cytostatyki (busulfan, cyklofosfamid, aminopteryna winkrystyna)
10.
niektóre
antybiotyki
o
właściwościach
cytostatycznych
(aktynomycyna, daunomycyna)
11.
produkty pirolizy aminokwasów
•
Biologiczne
1.
wirusy (Herpes virus, Papilloma virus)
Mutagenne działanie związków chemicznych. Zmiana w budowie
chemicznej zasad azotowych prowadzi do zmiany par zasad w łańcuchu DNA.
Np. dezaminacja Adeniny prowadzi do powstania hipoksantyny posiadającej
3 wiązania wodorowe, co prowadzi do zamiany pary AT na CG w dwóch
kolejnych cyklach replikacyjnych. Hydroksyloamina reaguje z cytozyną
zmieniając ją w uracyl, co prowadzi do Tranzycja C->T. Związki alkilujące
wprowadzają w różnych miejscach zasad azotowych grupy metylowe. Alkilacja
Guaniny w pozycji N7 powoduje osłabienie wiązania z pentozą co z kolei
skutkuje depurynizacją DNA. W pustym miejscu może dojść do tranzycji lub
transwersji.
Barwniki akrydynowe wnikają między pary zasad powodując ich rozsunięcie,
co może prowadzić do błędów replikacji wskutek delecji lub insercji
pojedynczych nukleotydów, co skutkować może zmianą ramki odczytu.
Wolne rodniki pochodzenia tlenowego powodują uszkodzenia zasad
azotowych, reszt cukrowych i rozerwanie wiązań fosfodiestrowych i utworzenie
wiązań poprzecznych DNA-białka chromatyny. Uszkodzenie rodnikami
indukuje powstawanie autoprzeciwciał, co ma znaczenie w chorobach
autoimmunologicznych. Mogą także wywoływać pęknięcia łańcucha (patrz
aberracje chromosomowe)
Produkty pirolizy aminokwasów powstają np. wskutek smażenia mięs
w temperaturze powyżej 150
o
C. powstają z połączenia kreatyniny cukru
i aminokwasu (najczęściej Gly Trp Phe Glu). Mają działanie kancero-
i teratogenne
Mykotoksyny (np. aflatotoksyna) produkowane przez niektóre grzyby
(aspergillus, fusarium) które rozwijają się na nieprawidłowo przechowywanej
żywności.
Mutagenne działanie czynników fizycznych
Promienie jonizujące zwiększają częstość występowania uszkodzeń DNA.
Wybija ono elektrony z atomów i cząsteczek, co prowadzi do powstania jonów
i wolnych
rodników
inicjujących
różne
reakcje
chemiczne.
Efekt
promieniowania jonizującego zależy od stężenia tlenu w środowisku (wraz z
jego wzrostem wzrasta częstość mutacji). Powoduje ono: zerwanie w.
fosfodiestrowych, modyfikacje zasad, uszkodzenie pentozy, powstanie w.
krzyżowych DNA (sieciowanie). Szczególnie narażone na nie są komórki szybko
dzielące się.
Promieniowanie UV jest mniej przenikliwe niż jonizujące, ale intensywnie
pochłaniane przez DNA. Prowadzi do wytwarzania wiązań kowalencyjnych
między leżącymi obok siebie pirymidynami, powodując transwersje, tranzycje,
rzadko zmiany ramki odczytu.
4.
Mechanizmy naprawy uszkodzeń DNA
Pozwalają przywrócić pierwotny stan materiału genetycznego. Do najważniejszych
enzymów biorących udział w naprawie DNA należą:
•
Polimerazy DNA jądrowe (α, β, δ, ε) i mitochondrialna γ
•
Ligazy DNA
•
Glikozydazy DNA
•
Endonukleazy purynowe/pirymidynowe 5’-AP i 3’-AP
•
Białka pomocnicze
•
Fotolizy DNA
•
Metylotransferaza-O
6
-metyloguanina (MGMT)
Naprawa DNA w komórce może być kompletna lub niekompletna, co prowadzi
do mutacji i aberracji chromosomowych. Jeżeli enzymy naprawcze nie zdołają
naprawić uszkodzeń, to komórka może przejść na szlak apoptozy.
Procesy naprawy DNA zachodzą w okresie przedreplikacyjnym, podczas replikacji
DNA lub w okresie poreplikacyjnym. Duży wpływ na nie ma struktura chromatyny.
Nić DNA łącząca chromosomy jest naprawiana szybciej niż nić nawinięta (DNA
rdzeniowy). Szybkość naprawy euchromatyny jest większa niż heterochromatyny.
Naprawa
DNA
przez
bezpośrednią
rewersję
uszkodzenia.
Polega
na odwróceniu reakcji, w wyniku której doszło do uszkodzenia. Biorą w niej udział
metylotransferaza MGMT oraz fotoliazy DNA.
Metylotransferaza MGMT naprawie błędną metylację. Katalizuje przeniesienie
grupy alkilowej z atomu O
6
Guaniny na cysteinę, w wyniku czego następuje
inaktywacja MGMT. Ekspresję MGMT w różnych tkankach cechuje zróżnicowany
poziom. U ludzi najwyższy w komórkach wątroby, zaś najniższy w szpiku
(w komórkach nowotworowych ulega zmniejszeniu o 20-30%). Reakcja ta jest
kosztowna dla komórki, gdyż naprawa każdej metyzacji pociąga za sobą utratę
jednej cząsteczki enzymu. MGMT występuje u
wszystkich żywych organizmów.
Fotoliaza to enzym odpowiedzialny za fotoreaktywację, czyli rozłączanie dimerów
pirymidynowych przy udziale fal elektromagnetycznych o długości 300-600 nm.
Proces ten nazywamy również naprawą na świetle. Każda fotoliaza zawiera
dwa chromofory, odpowiedzialne za absorpcję fotonów: FADH
-
oraz metynylo-
tetrahydrofolian (MTHF) lub 8-hydroksy-deazoflawina (8-HDF). MTHF lub 8-HDF
absorbują energię świetlną, którą przekazują potem do FADH
-
. energia ta jest
używana do rozdzielania dimerów.
Innym przykładem rewersji uszkodzenia jest działanie
ligazy, która łączy pęknięcia
w łańcuchu DNA. Jej aktywność ogranicza się jedynie do pęknięć pomiędzy grupą
5’fosforanową a 3’hydroksylową.
Usuwanie błędnie sparowanej zasady (missmatch repair- MMR). Dotyczy
usuwania błędów replikacyjnych nie naprawionych przez Polimerazy, wywołanych
przez czynniki chemiczne oraz błędy w parowaniu zasad powstałe przy
rekombinacji DNA. Istotne jest rozpoznanie, która z dwóch nici DNA została
prawidłowo zsyntetyzowana, a która zawiera błąd. Badania na E. Coli wykazują,
że dużą rolę w tym zakresie odgrywa stopień metylacji DNA. W sekwencjach GATC
E. Coli etylowana jest adenina, ale metylacja nie zachodzi bezpośrednio po
replikacji, lecz jakiś czas później. Dzięki temu możliwa jest identyfikacja nowej nici
(niezmetylowana adenina). U Eucaryota nić potomna jest rozpoznawana dzięki
przerwom między fragmentami Okazaki nici opóźnionej. Białka uczestniczące
w rozpoznawaniu i naprawie uszkodzenia kodowane są przez zespół genów
zwanych
mutatorowymi.
Przebieg procesu u E. Coli
1.
Rozpoznanie i przyłączenie się do miejsca pomyłki białka
MutS
(zdolnego rozpoznać nie tylko błędnie sparowane zasady, ale także
insercje i delecje obejmujące do 4nukleotydów).
2.
stabilizacja
kompleksu
MutS-DNA
przez
białko
MutL
(odpowiedzialnego także za połączenie z białkiem MutH)
3.
białko MutH przyłącza się naprzeciw najbliższej metylowanej adeniny
w nici rodzicielskiej i nacina nić potomną.
4.
Wycięcie nieprawidłowej nici i dosyntetyzowanie nowej przy udziale:
•
UvrD (helikaza II; rozkręca nić DNA od miejsca nacięcia przez
MutH do miejsca pomyłki
)
•
Egzonukleaza o odpowiedniej polarności wycinająca błędnie
sparowany fragment
•
Polimeraza DNA III dosyntetyzowująca odpowiednią
sekwencję zasad
•
Ligaza DNA łącząca nowo powstały fragment z nicią
macierzystą
U eucaryota ten mechanizm naprawy nie został całkowicie poznany, ale
przypuszczalnie jest on bardzo podobny do tego u E. Coli.
W organizmach eukariotycznych brakuje homologów MutH i UvrD, ale jest wiele
homologów MutS i MutL.
Zaburzenie funkcji genów mutatorowych jest przyczyną powstania między innymi raka
jelita grubego.
Naprawa przez wycinanie zasad azotowych. (Base excision repair- BER )
Jest to mechanizm stosowany głównie do usuwania uracylu lub alkilowanych zasad. W
procesie tym wyróżniamy 3 etapy:
1.
usunięcie nieprawidłowej zasady przez specyficzną N-glikozylazę i
wytworzenie miejsca purynowego/pirymidynowego (AP)
2.
nacięcie przez Endonukleazy AP wiązania fosfodiestrowego powyżej AP
3.
wypełnienie miejsca AP przez polimerazę DNA
Naprawa przez wycinanie nukleotydów: bierze udział w usuwaniu większości
uszkodzeń DNA. U każdego organizm przebiega według identycznego schematu:
1.
rozpoznanie uszkodzenia
2.
przyłączenie kompleksu białkowego w miejscu uszkodzenia
3.
podwójne nacięcie uszkodzonej nici w pewnej odległości od uszkodzenia
4.
usunięcie zawierającego uszkodzenie oligonukleotydu
5.
uzupełnienie luki przez polimerazę DNA
6.
połączenie wolnych końców przy udziale ligazy DNA
Naprawa rekombinacyjna bierze udział w naprawie pęknięć dwuniciowych. System
ten jest dokładnie poznany i opisany u bakterii. U eucaryota wyróżnia się trzy szlaki
naprawy: rekombinacja homologiczna, dopasowanie pojedynczej nici oraz
rekombinacja niehomologiczna. U ssaków różne mechanizmy dominują w zależności
od pozycji w cyklu komórkowym:
•
podczas fazy G1 i wczesnej S rekombinacja niehomologiczna
•
podczas późnej S i G2 rekombinacja homologiczna
W
rekombinacji homologicznej do odtworzenia struktury chromosomu
wykorzystywany jest jego nieuszkodzony homolog. W pierwszym etapie system
naprawczy rozpoznaje powstały wskutek pęknięcia dwuniciowego fragment DNA.
Jedna z jego nici zostaje strawiona przez egzonukleazy. Pozostała nić z wolnym
końcem 3’ łączona jest z nieuszkodzonym odcinkiem homologicznym. Na podstawie
informacji z nieuszkodzonego DNA zostaje odtworzony przebieg naprawionej
cząsteczki. W mechanizmie dopasowania nici DNA białka wykorzystują sekwencje
powtórzone w najbliższym sąsiedztwie pęknięcia.
W
rekombinacji niehomologicznej największy udział ma kinaza białkowa zależna
od DNA (DNA-pk). Dokładny przebieg procesu nie został jeszcze poznany.
Odpowiedź SOS dotyczy komórek bakteryjnych i uruchamiana jest przypadkach, gdy
w DNA nastąpiły liczne mutacje lub zatrzymana została replikacja. Bierze w niej udział
ok. 20 różnych genów, spośród których liczne kodują enzymy naprawy DNA.
W odróżnieniu od innych metod naprawczych, system SOS może pozostawiać liczne
błędy (system mutagenny). Jest on próbą uratowania komórki za cenę ewentualnej
mutacji. Uruchamiany jest przy uszkodzeniach zbyt rozległych, by mogły je naprawić
poprzednie mechanizmy. Jego uruchomienie powoduje zahamowanie podziału, co daje
dodatkowy czas na naprawę. Uszkodzenia DNA indukują aktywność proteazową białka
RecA, które rozkłada represorowe białka LexA i lambda, blokujące geny enzymów
naprawy DNA, dzięki czemu wzrasta transkrypcja tych genów. Do mutacji dochodzi,
ponieważ produkty genów UmuDC umożliwiają elongację łańcucha tuż za miejscem
uszkodzenia lub pomimo błędnie wbudowanej zasady (naprawa ze skłonnością
do błędu). Po dokonaniu naprawy poziom białka RecA obniża się, zwiększając syntezę
LexA i lambda, które ponownie blokują ekspresję genów mechanizmu SOS.
Naprawa DNA jest niezwykle ważnym dla komórki i organizmu procesem. Istnieją
choroby związane z obniżeniem aktywności lub zupełnym brakiem jednego
z enzymów naprawczych takie jak:
•
Xeroderma pigmentosum
•
Zespół Blooma
•
Anemia Fanconiego
•
Atalia teleangiectasia
Obniżenie zdolności naprawy zwiększa także ryzyko zachorowania na nowotwory,
oraz przyspiesza starzenie. Naprawa uszkodzeń jest też niezwykle istotna w układzie
nerwowym a jej upośledzenie obserwuje się między innymi w chorobie Alzheimera
i Huntingtona.
Naprawę DNA spowalnia hipertermia, spadek poziomu ATP, palenie tytoniu, picie
alkoholu oraz teofilina.
Mutacje niestabilne (dynamiczne)- ekspansja tripletów. Ekspresja takich mutacji
zmienia się w kolejnych pokoleniach. W ich wyniku powstają takie choroby jak:
•
Zespół łamliwego chromosomu X
•
Dystrofia miotoniczna
•
Choroba Huntingtona
Mutacje dynamiczne powstają w wyniku wydłużania lub skracania sekwencji DNA.
Prawdopodobieństwo wystąpienia takiej mutacji zależy od długości niestabilnej
sekwencji DNA. W przypadku wymienionych trójek, w zależności od liczby powtórzeń
wyróżnia się osoby zdrowe, nosicieli i chorych. Najczęściej są to powtórzenia
zwielokrotnionych trójek nukleotydów. Gdy liczba powtórzeń wzrasta, wzrasta też
ryzyko zachorowania. Np. w pląsawicy Huntingtona liczba powtórzeń fragmentu CAG
w ramieniu krótkim 4 chromosomu u zdrowych waha się między 4-35. u chorych
wynosi od 36 (wystąpienie objawów w wieku średnim), powyżej 50 (choroba w młodym
wieku). W chorobie Huntingtona liczba trójek u potomstwa zwiększa się tylko, gdy
mutacja zostanie przekazana przez ojca. Zjawisko pojawiania się objawów w coraz
młodszym wieku u kolejnych pokoleń wskutek zwielokrotnienia trójek nukleotydów
nazywamy
antycypacją. W przypadku zespołu łamliwego chromosomu X
prawdopodobieństwo choroby u rodzeństwa nosiciela jest mniejsze niż wśród jego
wnuków (paradoks Shermana)
Mutacje letalne występujące w układzie homozygotycznym powodują śmierć
organizmu, natomiast w układzie heterozygotycznym mogą być utrzymywane
w populacji przez wiele pokoleń, wskutek czego w populacjach gromadzą się liczne
geny letalne.