SDS-PAGE

1. odczynniki używane podczas preparacji żeli i samej elektroforezy
2. zasady rozdziału podczas SDS-PAGE

Najczęściej stosuje się elektroforezę w tzw. żelu nieciągłym, w którym próbkę nanosi się na żel
zagęszczający (o dużych porach) spolimeryzowany na wierzchu żelu rozdzielającego (o małych porach).
W tej technice bufor używany jako bufor elektrodowy oraz bufory wchodzące w skład obu żeli różnią się
składem i pH. Zaletą tego systemu jest koncentracja białek podczas wędrówki przez żel zagęszczający,
co powoduje, że niezależnie od objętości próbki białka wchodzą w żel rozdzielający w postaci wąskiego,
zatężonego pasma.

Użycie anionowego detergentu soli sodowej kwasu dodecylosiarkowego (SDS – ang. Sodium Dodecyl
Sulfate) pozwala na rozdział elektroforetytczny białek zgodnie z ich masą cząsteczkową. Przed i w
trakcie elektroforezy białka ulegają dysocjacji i denaturacji w obecności SDS, który łączy się z białkami
specyficznie w stosunku masowym 1 g białka - 1,4 g SDS. Zapewnia to przejęcie przez białko ujemnego
ładunku elektrycznego netto o stałej gęstości bez względu na jego długość. Dla całkowitego rozwinięcia
polipeptydu, zapewnienia mu pierwszorzędowej struktury, niezbędne jest dodatkowo zniszczenie
mostków dwusiarczkowych (β-merkaptoetanol lub ditiotretiol). Opłaszczenie białka przez SDS oraz
redukcja mostków dwusiarczkowych pozwala na separację białek w żelu poliakrylamidowym ze względu
na ich wielkość, a zatem pośrednio masę cząsteczkową. Szybkość migracji w SDS-PAGE nie jest
determinowana przez ładunek elektryczny białka zależny od pH i jego konformację ale przez masę białka.

W obecności SDS i czynnika redukującego wiązania dwusiarczkowe (β-merkaptoetanolu) białka ulegają
denaturacji (rozdzielają się na podjednostki) a ich wiązania niekowalencyjne ulegają rozkładowi.
Początkowo rozdział prowadzi się przy małym napięciu (60 V), aby białka jak najlepiej weszły w pory
żelu. Następnie zwiększa się napięcie (do 120 V), przyspieszając przepływ białek. Rozdział prowadzi się
w buforze glicynowym. Odpowiednie napięcie wraz z użyciem żelu o mniejszym stężeniu akrylamidów
w stosunku do żelu dolnego pozwala na zagęszczenie próbek. Efekt taki uzyskujemy dzięki glicynie i
jonom chlorkowym zawartym w buforze elektrodowym. Glicyna w pH 6.8 górnego żelu (wyższym od jej
punktu izoelektrycznego pI 6.3) przyjmuje ładunek lekko ujemny. W porównaniu z silnym ładunkiem
ujemnym jonów chlorkowych i białka (dzięki obecności SDS) jest to ładunek znikomy. Glicyna jako
cząsteczka o najmniejszym ładunku wypadkowym ujemnym wędruje więc najwolniej ku anodzie. Przed
nią przemieszczają się białka poprzedzone przez jony chlorkowe, charakteryzujące się dużą ruchliwością
elektroforetyczną. Takie rozmieszczenie w żelu migrujących cząsteczek powoduje zagęszczenie próbki.
Dzięki temu naniesione białka wchodzą równocześnie w żel dolny. Przejście białek z żelu górnego do
dolnego rozpoczyna proces ich właściwego rozdziału. Żel dolny, poza stężeniem akrylamidów, a co się
z tym wiąże wielkością porów, różni się od żelu górnego również pH, które wynosi 8.8. Takie pH jest
znacznie wyższe od pI glicyny, co powoduje, że wypadkowy ładunek aminokwasu staje się bardziej
ujemny (wraz ze zmniejszeniem liczby jonów H+ zwiększa się ilość cząsteczek glicyny ze zjonizowanymi
grupami karboksylowymi). Zmiana ładunku glicyny jest przyczyną zmiany opisanej wcześniej kolejności
migracji. Białka wędrują za jonami chlorkowymi i glicyną, ulegając rozdziałowi pod względem masy
cząsteczkowej.

Białka w żelu można wybarwić następującymi metodami:
1. Barwienie w roztworze Coomassie Brilliant Blue R-250.
2. Barwienie srebrem
3. Barwienie roztworem czerni amidowej