Wyznaczanie masy

cząsteczkowej białek

metodą SDS-PAGE

• SDS- anionowy detergent soli

sodowej kwasu dodecylosiarkowego

• Przed i w trakcie elektroforezy białka

ulegają dysocjacji i denaturacji w
obecności SDS, który łączy się z
białkami specyficznie w stosunku
masowym 4,1:1. Zapewnia to
przejęcie przez białko ujemnego
ładunku elektrycznego.

• Dla całkowitego rozwinięcia

polipeptydu, zapewnienia mu
pierwszorzędowej struktury,
niezbędne jest dodatkowo
zniszczenie mostków
dwusiarczkowych.

• Opłaszczenie białka przez SDS oraz

redukcja mostków dwusiarczkowych
pozwala na separację białek w żelu
poliakrylamidowym ze względu na
ich wielkość, a zatem pośrednio
masę cząsteczkową.

• Dzięki możliwości rozdziału białek na

podstawie ich wielkości możemy
oznaczyć masę cząsteczkową
nieznanego białka, porównując jego
położenie w żelu w stosunku do
innych białek (tzw. białek
wzorcowych) po zakończonej migracji
i wybarwieniu.

Etapy rozdziału

• Próbki nanosimy na żel, po ogrzaniu w buforze

denaturującym.

• Dodajemy sacharozę aby ułatwić umieszczenie

próbki w studzience.

• Białka ulegają denaturacji w obecności SDS i

czynnika redukującego wiązania dwusiarczkowe.

• Początkowo rozdział prowadzimy przy małym

napięciu (60 V), aby białka jak najlepiej weszły
w pory żelu. Następnie zwiększamy napięcie (do
120 V), przyspieszając przepływ białek.

• Rozdział prowadzimy w buforze glicynowym.
• Zagęszczamy próbkę poprzez dobranie

odpowiedniego napięcia i użycia żelu o
mniejszym stężeniu akrylamidów w stosunku do
żelu dolnego.

• Efekt taki uzyskujemy dzięki glicynie i jonom

chlorkowym zawartym w buforze elektrodowym.

• Górny żel ma pH 6.8 przez to glicyna przyjmuje

ładunek lekko ujemny. Jest to ładunek znikomy
w porównaniu do ładunku białek i chlorków.

• Glicyna wędruje najwolniej ku anodzie.

Przed nią przemieszczają się białka
poprzedzone przez jony chlorkowe, które
charakteryzują się dużą ruchliwością.

• Dzięki temu naniesione białka wchodzą

równocześnie w żel dolny. Przejście
białek z żelu górnego do dolnego
rozpoczyna proces ich właściwego
rozdziału.

• Żel dolny, poza stężeniem

akrylamidów, a co się z tym wiąże
wielkością porów, różni się od żelu
górnego również pH, które wynosi
8.8.

• Takie pH jest znacznie wyższe od pI

glicyny, co powoduje, że jej
wypadkowy ładunek staje się bardziej
ujemny.

• Zmiana ładunku glicyny jest

przyczyną zmiany opisanej wcześniej
kolejności migracji. Białka wędrują za
jonami chlorkowymi i glicyną,
ulegając rozdziałowi pod względem
masy cząsteczkowej.  

• Wybarwaimy preparat i porównujemy

do białek wzorcowych.