SDS-PAGE

L

AEMMLI ELEKTROFOREZA

Wyciąg z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych
• Akrylamid/bisakrylamid – T
• Temed – C, F
• SDS – Xn
• APS – O, Xn
• EDTA – Xi
• Merkaptoetanol – T, N

Wylewanie żeli

O

DCZYNNIKI

:

- AA: 30% akrylamid, 0.8% bisakrylamid

- bufor do żelu rozdzielającego: 1 M Tris-HCl, pH 8.8

- bufor do żelu zagęszczającego: 1 M Tris-HCl, pH 6.8

- 20% siarczan dodecylu sodu (SDS)

- 1% SDS

- 10% nadsiarczan amonu (APS)

- N,N,N’,N’- tetrametyloetylenodiamina (Temed)

- bufor do próbek (2x stężony): 132 mM Tris-HCl pH 6.8, 20% glicerol, 10% 2-merkapto-
etanol, 4% SDS, 2 mM EDTA

- bufor do naczyń elektrodowych: 25 mM Tris, 192 mM glicyna, 0.1% SDS, pH 8.3

- 0,02% błękit bromofenolowy

- zestaw wysokomasowych białek wzorcowych do elektroforezy (HMW) zawierający:

miozynę (205 kDa), -galaktozydazę (116 kDa), fosforylazę b (97,4 kDa), albuminę
surowicy wołu (66 kDa), albuminę jaja kurzego (45 kDa), anhydrazę węglanową (29 kDa)

W

CELU PRZYGOTOWANIA

12

ML

8%

ŻELU ROZDZIELAJĄCEGO ODPIPETOWAĆ

:

roztwór AA

3.20 ml

1 M Tris-HCl, pH 8.8

4.50 ml

20% SDS

60 l

H

2

O dejonizowana

4.25 ml

Temed

24 l

10% APS

60 l

W

CELU PRZYGOTOWANIA

4

ML

4.5%

ŻELU ZAGĘSZCZAJĄCEGO ODPIPETOWAĆ

:

roztwór AA

0.60 ml

1 M Tris-HCl, pH 6.8

0.49 ml

20% SDS

20 l

H

2

O dejonizowana

2.88 ml

Temed

10 l

10% APS

24 l

Przygotowanie próbek

Oznaczyć stężenia białka w próbce (lizat komórkowy) metodą Bradford. Z próbki
odpipetować 15 g białka do osobnego eppendorfa, dodać odpowiednią objętość 2x
stężonego buforu do próbek oraz 0.5 l roztworu błękitu bromofenolowego, zwirować i
gotować 8-10 min w temperaturze 100 C. Po gotowaniu próbkę zwirować i przenieść do
studzienki w żelu zagęszczającym przy użyciu strzykawki Hamilton.

W

ARUNKI PRĄDOWE

: 100 V na wejście próbki w żel zagęszczający (ok. 10 min)

180 V na rozdział (ok. 60 min)

Elektroforezę prowadzić do wyjścia błękitu bromofenolowego z żelu rozdzielającego.

Barwienie żelu po elektroforezie

Żel zanurzyć w wybarwiaczu (10% kwas octowy, 25% metanol, 65% woda 3 x dest. 0.1%
CBBG-250) i pozostawić na 30 min na wytrząsarce kołyskowej. Następnie usunąć
wybarwiacz i żel zalać odbarwiaczem (10% kwas octowy, 25% metanol, 65% woda 3 x
dest.). Całość pozostawić na wytrząsarce, aż do uzyskania bezbarwnego tła.

Opracowanie wyników

W

YZNACZANIE WZGLĘDNYCH MAS CZĄSTECZKOWYCH BIAŁEK

:

- wykreślić krzywą kalibracyjną zależności log m.cz. białek standardowych od współczynnika

R

f

tj. względnej ruchliwości elektroforetycznej wyznaczonej ze stosunku drogi przebytej

przez dane białko do drogi przebytej przez błękit bromofenolowy.

- obliczyć wartości R

f

dla białek badanych i z wykresu kalibracyjnego odczytać względne

masy cząsteczkowe tych białek.

Krzywa kalibracyjna

Białka standardowe:

M.cz. (kDa)

log M.cz.

R

f

miozyna

205

-galaktozydaza

116

fosforylaza b

97,4

albumina surowicy wołu

66

albumina jaja kurzego

45

anhydraza węglanowa

29

Elektroforetyczne wyznaczanie względnych mas cząsteczkowych

Nr prążka M.cz. (kDa)

log M.cz.

R

f

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Literatura:
1. „Techniki badań fizjologicznych” (red. A. Lityńska, M.H. Lewandowski), str. 102 - 106