IMMUNOLOGIA

TRANSPLANTACYJN

A

NOMENKLATURA HLA

Podwójna nomenklatura

serologiczna

genetyczna

zatwierdzona przez Komitet

Nomenklatury HLA przy WHO

Nomenklatura
serologiczna

• Konieczne jest określenie układu

genetycznego, czyli HLA, dodanie myślnika i
locus, a następnie numeryczne oznaczenie
antygenu, np. HLA-B16, HLA-B39

• Jeśli w danym locus wykryto dwa antygeny, to

ich oznaczenia numeryczne oddziela się
przecinkami, a jeśli badano więcej niż jedno
locus, to kolejne loci należy dopisywać po
średniku. Na końcu zapisu fenotypu osoby
badanej należy postawić kropkę, np.:
HLA-A1, 2; b7, 13; Cw7.

Zapis ten oznacza, że metodą serologiczną

wykonano typowanie loci A, B i Cw, w których wykryto
odpowiednie antygeny, przy czym w locus Cw wykryto
tylko jeden antygen.

Nomenklatura
genetyczna

• Zapis rozpoczyna się od nazwy układu genetycznego,

tj. „HLA” (którą można ominąć, jeśli nie ma

wątpliwości, że opisujemy gen HLA).

• Następnie wpisujemy myślnik, oznaczenie locus

gwiazdkę oraz cyfrowe lub cyfrowo-literowe

oznaczenie allelu.

• Dwie pierwsze cyfry po gwiazdce (np. A*02) oznaczają

grupę alleli najczęściej odpowiadającą antygenowi

serologicznemu o tym samym numerze (A2). Zapis

dwucyfrowy dotyczy wyniku genotypowania o

niskiej rozdzielczości.

• Cyfry trzecia i czwarta po * oznaczają numer

konkretnego allelu w tej samej grupie (np. A*0201,

A*0205).

• Zapis czterocyfrowy jest możliwy po otrzymaniu

wyniku genotypowania o wysokiej rozdzielczości.

• Piątą i szósta cyfra oznacza substytucję nukleotydu w

genie, która prowadzi do zmiany sekwencji

aminokwasów w cząsteczce antygenu HLA (tzw.

sybstytucja synonimowa).

Czynniki wpływające na

wynik transplantacji:

• Stopień zgodności HLA biorcy i

dawcy

• Rozpoznanie choroby i jej faza
• Wiek pacjenta (do niedawna górna

granica to 40 lat)

• Przebyte zakażenia, głównie CMV
• Różnice w grupach krwi
• Przygotowanie chorych do

transplantacji

• Przygotowanie przeszczepu

Źródła komórek

krwiotwórczych do

przeszczepiania:

Dawcą klasycznym jest całkowicie

zgodny brat lub siostra.

Dawcy alternatywni to:
1. Całkowicie zgodni pod względem HLA

– rodzice, dzieci, dalsi krewni, krew
pępowinowa od zgodnego rodzeństwa
oraz dawcy niespokrewnieni.

2. Częściowo niezgodni – członkowie

rodziny, krew pępowinowa i dorośli
dawcy niespokrewnieni oraz dawcy
haploidentyczni.

Dobór dawcy rodzinnego

spośród

rodzeństwa

Dotyczy 4 lub 5 loci HLA : A, B, Cw, DRB1 i

ewentualnie DQB1.

Dobór obejmuje następujące etapy:

1. Wstępne oznaczenie HLA w zakresie A, B, (Cw) met.

Serologiczną lub A, B, DRB1 met. Genetyczną na

poziomie niskiej rozdzielczości u chorego i jego

rodzeństwa, a także rodziców lub dzieci.

2. Wybór potencjalnego dawcy (a raczej wszystkich

dostępnych całkowicie zgodnych dawców).

3. Typowanie potwierdzające z nowych próbek, tj.

uzupełnienie i potwierdzenie wyników oznaczania HLA

osób zgodnych (dawcy/dawców i biorców) metodą

genetyczną w zakresie A, B, Cw, DRB1 (DQB1).

4. Analiza haplotypów wszystkich dostępnych członków

najbliższej rodziny i wydanie opinii dotyczącej

całkowicie zgodnych potencjalnych dawców w rodzinie

chorego.

Poszukiwanie rodzeństwa

zgodnego w HLA,

analiza haplotypów

RODZICE




Haplotyp

MATKA
A*01-B*08-Cw*07-DRB1*15

(a)
A*02-B*1501-Cw*03-
DRB1*13 (b)
OJCIEC
A*01-B*08-Cw07-DRB1*03
(c)
A*02-B*27-Cw*01-DRB1*01
(d)

DZIECI

Haplotyp

Chory
A*01-B*08-Cw*07-DRB1*15 (a)
A*01-B*08-Cw07-DRB1*03 (c)
Brat 1
A*02-B*1501-Cw*03-DRB1*13 (b)
A*02-B*27-Cw*01-DRB1*01 (d)
Brat 2
A*01-B*08-Cw*07-DRB1*15 (a)
A*02-B*27-Cw*01-DRB1*01 (d)
Siostra 1
A*02-B*1501-Cw*03-DRB1*15
(b+a)
A*01-B*08-Cw07-DRB1*03 (c)
Siostra 2
A*01-B*08-Cw*07-DRB1*15 (a)
A*01-B*08-Cw07-DRB1*03 (c)

• Szczególnym przypadkiem

transplantacji od rodzeństwa jest
wykorzystanie rodzinnej krwi
pępowinowej

• Istnieje Bank Krwi Pępowinowej

Bank Komórek
Macierzystych

• Bardzo skuteczny sposób

transplantacji

•

Prawdopodobieństwo zgodności
krzyżowej kolejnego dziecka z
dzieckiem chorym wynosi 25%

Dobór dawcy komórek

krwiotwórczych spośród

krewnych I stopnia

(rodziców lub dzieci)

• Może być przeprowadzony równolegle ze wstępną

analizą przydatności rodzeństwa.

• Wstępne typowanie 2 lub 3 loci udaje się

najczęściej stwierdzić, czy ktoś z krewnych I

stopnia może być dalej rozważany jako

potencjalny dawca.

• Wstępne typowanie rodziców lub potomstwa może

wykazać częściową zgodność.

• Osoby z niezgodnym drugim haplotypem są

przeważnie dyskwalifikowane jako dawcy, a w

przypadku wysokiej zgodności drugiego

haplotypu (2-4 sposród 5 loci) rozważa się

wykonanie przeszczepiania haploidentycznego.

• Podczas doboru istotny jest również wiek chorego

i dawcy, rozpoznanie i faza choroby, techniczna

możliwość eliminacji limfocytów T z przeszczepu

lub przeprowadzenie tzw. minitransplantacji ).

Dobór dawcy komórek

krwiotwórczych

spośród dawców

niespokrewnionych

• Celem jest znalezienie w zakresie 5

loci: HLA-A, B, Cw, DRB1, DQB1 na
poziomie alleli.

• Dopuszczalna jest niezgodność

jednego allelu większa ich liczba
lub niezgodności antygenowe
powinny być rozważone przez
transplantologów.

Etapy doboru dawcy

niespokrewnionego:

1. Potwierdzające typowanie pacjenta (na podstawie

innej próbki niż próbka użyta do badania

wstępnego, metodą o wysokiej rozdzielczości w

zakresie 5 loci).

2. Przegląd bazy BMDW (światowa baza dawców

szpiku) i analiza możliwości znalezienia zgodnego

dawcy.

3. Wybór rejestru i prośba o jego wstępne

przeszukiwanie

4. Wybór potencjalnie najlepszego dawcy na podstawie

wstępnych informacji otrzymanych bezpośrednio z

rejestrów.

5. Sprowadzenie próbki dawcy na typowanie

potwierdzające.

6. Wykonanie potwierdzającego typowania dawcy (w

nowej próbce, metodą o wysokiej rozdzielczości w

zakresie 5 loci ).

7. Raport do ośrodka transplantacji szpiku o dobraniu

zgodnego dawcy.

8. Rezerwacja dawcy w macierzystym rejestrze po jego

wstępnej akceptacji przez ośrodek transplantacji

szpiku.

Dawca w szerokiej

rodzinie chorego

• Brak w pełni zgodnych niespokrewnionych

dawców przed rozpoczęciem poszukiwania
dawcy częściowo niezgodnego, zasadne jest
przeanalizowanie szerokiej rodziny chorego, w
celu znalezienia wśród jej członków całkowicie
zgodnego dawcy.

• Wykorzystanie częstego haplotypu u chorego

wymaga zbadania dużej liczby krewnych, a
rezultat jest niepewny.

• Wykrycie pokrewieństwa małżeństw i istnienia

„obustronnych” krewnych chorego jest znacznie
łatwiejsze- przeprowadzamy wywiad rodzinny.

Testy serologiczne

Test mikrocytotoksyczny

(mikrolimfocytotoksyczny)
(met. zależna od p/ciał
limfocytotoksycznych)

• Jeżeli na limfocytach, które są komórkami

docelowymi występuje Ag zgodny z

odpowiednio zastosowanymi p/ciałami

dochodzi do powstania kompleksu.

Następnie dodawany jest dopełniacz, przy

wystarczającej ilości p/ciał, uaktywniony

dopełniacz uszkadza błonę komórkową i

zwiększa jej przepuszczalność wywołując

lizę komórki.

• Martwe komórki wykrywane są przez

dodanie barwnika (eozyna/błękit trypanu) i

wykorzystanie faktu, że żywe komórki są

oporne na jego działanie.

Test

limfocytotoksyczny

wg

Terasakiego

w modyfikacji

NIH

1. Izolacja żywych limfocytów.
2. Przygotowanie zestawu testowych surowic

o znanych swoistościach HLA i surowic

kontrolnych.

3. Wprowadzenie limfocytów do wszystkich

dołków na płytce Terasakiego z surowicami

diagnostycznymi i inkubacja.

4. Dodanie surowicy króliczej zawierającej

składniki dopełniacza i inkubacja.

5. Dodanie barwnika (eozyna).
6. Zablokowanie

reakcji

cytotoksycznej

(dodanie formaliny).

7. Odczyt reakcji w mikroskopie inwersyjnym

i analiza wyników.

limfocyt

in vitro

p/ciała anty-HLA
w surowicy badanej

Test mikrocytotoksyczny

Test mikrocytotoksyczny

Ag HLA

dopełniacz

eozyna

Metody komórkowe

Test mieszanej hodowli leukocytów (MLC/MLR):

-Limfocyty dwóch osób są hodowane razem, co

pozwala na wzajemne oddziaływanie Ag

powierzchniowych

.

Jeżeli Ag HLA-DR i –DQ nie są całkowicie

identyczne, limfocyty ulegają stymulacji,

powiększają się i proliferują w ciągu 5 dni.

Przebieg transformacji blastycznej i syntezę

DNA mierzy się przez dodanie tymidyny

znakowanej trytem- zużycie odczynnika

znakowanego izotopem jest proporcjonalne

do syntezy DNA podczas dzielenia się

komórek.

Im słabsza odpowiedź, tym większa szansa na

utrzymanie się przeszczepu.

Metody genetyczne

• Pozwalają na wykrycie wielu polimorficznych

genów, których nie można zdefiniować

konwencjonalnymi metodami

serologicznymi.

• Techniki z zastosowaniem:
- p/ciał monoklonalnych
- sond oligonukleotydowych
- reakcji łańcuchowej polimerazy
- badanie polimorfizmu metodą

analizy długości fragmentów

restrykcyjnych

Metody badania HLA

na

poziomie DNA

SSP – etapy

genotypowania HLA

metodą swoistych

primerów

1. Izolacja DNA.
2. Amplifikacja DNA, która jest swoista wskutek

reakcji wielu par primerów, będących krótkimi

fragmentami DNA. Primery obejmują tylko

polimorficzne miejsca eksonu, właściwe dla

jednego lub kilku określonych swoistości

allelicznych.

3. Elektroforeza wielu produktów PCR.
4. Odczyt wzrokowy lub archiwizacja fotograficzna.
5. Analiza komputerowa zbioru wszystkich

dodatnich i ujemnych wyników

PCR.

6. Interpretacja immunogenetyczna.

SSOP – etapy

genotypowania HLA

metodą swoistych sond

oligonukleotydowych

1. Izolacja DNA.
2. Amplifikacja DNA, która jest swoista, gdyż opiera

się zwykle tylko na jednej parze primerów, łączącej

się z eksonem poza obszarem polimorficznym i

obejmującej cały ekson.

3. Hybrydyzacja swoista produktu amplifikacji z

użyciem wielu sond swoistych dla kilku określonych

alleli, utrwalonych na pasku nitrocelulozy.

4. Barwienie produktów hybrydyzacji.
5. Odczyt wzrokowy lub automatyczny.
6. Komputerowa analiza komputerowa allelicznych

swoistości sond, które hybrydyzowały z badanym

DNA, wraz z eliminacją swoistośći allelicznych tych

sond, które nie hybrydyzowały.

7. Interpretacja immunogenetyczna.

SBT – etapy

sekwencjonowania

genów HLA

1. Izolacja DNA.
2. Amplifikacja obejmująca najczęściej fragmenty

jednego lub dwóch eksonów z wykorzystaniem

znakowania tzw. Nukleotydami kończącymi. W

wyniku tak zmodyfikowanego procesu amplifikacji

powstają fragmenty DNA różniące się do siebie

długością dokładnie o jeden nukleotyd, a ostatni

przyłączony nukleotyd jest znakowany jeden z

czterech barwników fluorescencyjnych.

3. Elektroforeza porządkująca fragmenty DNA pod

względem ich długości.

4. Detekcja laserowa, która wykrywa znakowane

nukleotydy kończące fragmentów DNA. Dzięki

elektroforezie fragmenty te ułożone są zgodnie z ich

długością, co umożliwia określenie jaki nukleotyd

kończył każdy z kolejnych coraz dłuższych

fragmentów sekwencjonowanego genu.

5. Analiza porównawcza bibliotek sekwencji alleli HLA.
6. Interpretacja immunogenetyczna.