92 Â

WIAT

N

AUKI

Sierpieƒ 1997

W

komórkach wszystkich orga-
nizmów wy˝szych majàcych
jàdro komórkowe materia∏

dziedziczny jest podzielony na chromo-
somy. W tych, jak dawniej je nazywa-
no, w∏óknach jàdrowych niç DNA nie
jest naga, ale owini´ta wokó∏ bia∏ek.
Oprócz genów chromosomy zawierajà
kilka charakterystycznych elementów.
Nale˝à do nich telomery (szczególne na-
turalne sekwencje ochronne na obu ich
koƒcach), miejsca startu replikacji, od
których zaczyna si´ podwajanie DNA
podczas podzia∏u komórkowego, oraz
sekwencje centromerowe, odpowie-
dzialne za uporzàdkowany rozdzia∏ ma-
teria∏u genetycznego do dwóch potom-
nych komórek.

JeÊli elementy te wyizoluje si´ z ge-

nomu dro˝d˝y i w odpowiedni sposób
po∏àczy z odcinkami DNA innego or-
ganizmu, taki twór mo˝na wprowadziç
do komórek dro˝d˝y jako sztuczny
chromosom. Skonstruowanie sztucz-
nych chromosomów dro˝d˝y, tzw.
YAC-ów (yeast artificial chromosomes),
uda∏o si´ po raz pierwszy ju˝ oko∏o 15
lat temu. Zachowujà si´ one jak natu-
ralne chromosomy i sà wiernie przeka-
zywane kolejnym pokoleniom komó-
rek. Jednak odcinek DNA zawarty

mi´dzy dwoma ochraniajàcymi koƒca-
mi musi mieç pewnà minimalnà d∏u-
goÊç, bo tylko wtedy wbudowana
sekwencja centromerowa zapewnia
równomierny rozdzia∏ materia∏u gene-
tycznego podczas podzia∏u komórki.

Sztuczne chromo-

somy dro˝d˝y du˝o
wnios∏y do badaƒ ge-
nomu ludzkiego, po-
niewa˝ dzi´ki nim
daje si´ klonowaç (a
póêniej analizowaç)
znacznie d∏u˝sze od-
cinki DNA ni˝ inny-
mi metodami. Z wie-
lu wzgl´dów dro˝d˝e
stanowià prosty mo-
del komórek wszyst-
kich wy˝szych orga-
nizmów, próbowa-
no zatem w ten sam
sposób skonstruowaç
sztuczne chromoso-
my ludzkie. Mog∏yby
one otworzyç ca∏ko-
wicie nowe perspek-
tywy przed terapià
genowà.

Jednak˝e wszystkie

dotychczasowe pró-

by nie powiod∏y si´, i to g∏ównie z
dwóch powodów. Pierwszy to wielkoÊç
i stopieƒ z∏o˝onoÊci centromeru ludz-
kiego, szacowanego na kilka milionów
par zasad zamiast oko∏o dwustu jak
w przypadku dro˝d˝y. G∏ównà jego

Sztuczny ludzki

mikrochromosom

Ta liniowa struktura, stabilnie dziedziczona
w komórkach ludzkich, jeszcze si´ nie nadaje
do stosowania w terapii genowej

Inge Hoefer

SZTUCZNY MIKROCHROMOSOM ludzki (strza∏ka) na obu
tych zdj´ciach z mikroskopu fluorescencyjnego jest 5–10 ra-
zy krótszy od normalnego chromosomu, ale tak jak on ma na
swych koƒcach ochronne sekwencje telomerowe (czerwony
u góry). Ponadto zawiera okreÊlone sekwencje centromerowe
(na dole zaznaczone na czerwono), pochodzàce z chromoso-
mu 17. Sà one funkcjonalne, poniewa˝ w ich obszarze groma-
dzà si´ charakterystyczne (zaznaczone tu na zielono) bia∏ka
pomocnicze (na∏o˝enie zielonego i czerwonego sygna∏u daje
w rezultacie ˝ó∏ty). W przedstawionym stadium region cen-
tromerowy jest podwójny, poniewa˝ chromosomy podwoi∏y si´
ju˝ przed podzia∏em komórkowym na pozostajàce wcià˝ razem
cz´Êci. Do centromeru przy∏àczone sà w∏ókna wrzeciona odcià-
gajàce od siebie dwa potomne chromosomy i kierujàce je do
dwóch biegunów komórki – przysz∏ych komórek potomnych.
Na dolnym zdj´ciu mikrochromosom nie jest ju˝ widoczny.

SPEKTRUM DER WISSENSCHAFT

SPEKTRUM DER WISSENSCHAFT

Â

WIAT

N

AUKI

Sierpieƒ 1997 93

cz´Êcià jest element z rodziny tzw. alfa-
-satelitarnego DNA o d∏ugoÊci 171 par
zasad, powtórzony tandemowo wiele
razy. Do tego dochodzà inne sekwencje
powtarzajàce si´ oraz sekwencje unikal-
ne, odmienne w ró˝nych chromoso-
mach. Najkrótszy naturalny ciàg se-
kwencji z serii alfa ma d∏ugoÊç 230 tys.
par zasad, jednak, co wykazano ekspe-
rymentalnie, wystarczy jego po∏owa, by
zapewniç przynajmniej pewne funkcje
centromeru.

Drugi problem wynika z nieznajomo-

Êci miejsc startu replikacji DNA cz∏owie-
ka. Sà to najprawdopodobniej specyficz-
ne, jeszcze nie znane sekwencje roz-
mieszczone w pewnych odleg∏oÊciach
na chromosomach ludzkich (podwaja-
nie chromosomu zaczyna si´ bowiem
jednoczeÊnie w wielu punktach). Nie-
wykluczone te˝, ˝e odgrywa tu rol´
okreÊlona struktura przestrzenna, two-
rzona spontanicznie przez te odcinki
DNA i s∏u˝àca nast´pnie jako miejsce
startu replikacji.

Obecnie grupie naukowców z Case

Western Reserve University i z firmy
Athersys w Cleveland (Ohio) uda∏o si´
pokonaç lub przynajmniej obejÊç te dwie
przeszkody i po raz pierwszy uzyskaç
sztuczny ludzki chromosom z syntetycz-
nym centromerem, przekazywany w nie
zmienionej formie i w sta∏ej liczbie pod-
czas wielu podzia∏ów komórkowych.

Do konstrukcji centromeru naukow-

cy wykorzystali w du˝ej cz´Êci natural-
ne sekwencje alfa-satelitarnego DNA
i w skomplikowanej procedurze ∏àczy-
li je ze sobà, dopóki nie powsta∏a niç
DNA o d∏ugoÊci oko∏o 1 mln par zasad
– znacznie d∏u˝sza ni˝ zak∏adane kry-
tyczne minimum. W tym celu najpierw
kolejno podwajali d∏ugoÊç wyjÊciowych
odcinków DNA w specjalnym plazmi-
dzie (kolistej strukturze stosowanej ja-
ko wektor do klonowania materia∏u ge-
netycznego w bakteriach). Gdy odcinki
DNA osiàgn´∏y w ten sposób d∏ugoÊç
kilkuset tysi´cy par zasad, ∏àczono je
enzymatycznie in vitro w d∏u˝sze
odcinki.

By obejÊç problem z nieznanym miej-

scem replikacji, naukowcy zastosowali
pewnà sztuczk´. Zmieszali po prostu ze
sobà cz´Êç ludzkiego DNA (który na-
mno˝ono metodà enzymatycznà w ∏aƒ-
cuchowej reakcji polimerazy – PCR)
z syntetycznym centromerem i telome-
rowym DNA, a nast´pnie wprowadzili
t´ mieszanin´ do hodowanych komó-
rek ludzkiej linii nowotworowej, liczàc
dalej na maszyneri´ biochemicznà ko-
mórek i przypadek. Mieli nadziej´, ˝e
trzy wymagane sk∏adniki same po∏àczà
si´ w chromosomy i zapewnià nie tylko
miejsce startu replikacji, ale utworzà

te˝ odcinki o wymaganej minimalnej
d∏ugoÊci.

Istotnie, ich przewidywania si´

sprawdzi∏y, choç tylko w jednym przy-
padku otrzymano oczekiwany mikro-
chromosom, który jak si´ wydaje, po-
wsta∏ z wprowadzonych sk∏adników
[ilustracja obok], stabilnie namna˝ajàcy
si´ przez wiele pokoleƒ komórek.
Wszystkie komórki potomne tej jednej
wyjÊciowej podwaja∏y i przekazywa∏y
sztuczny chromosom nast´pnym poko-
leniom tak samo regularnie jak swoje
w∏asne chromosmy – przynajmniej
w wi´kszoÊci przypadków.

Do ostatecznego celu, czyli chromo-

somu o zaplanowanej z góry budowie,
jest jeszcze daleko. Ostatecznie ten,
który otrzymano obecnie, wype∏niajà ja-
kieÊ nieokreÊlone cz´Êci materia∏u ge-
netycznego innych komórek ludzkich.
Jeszcze wi´kszych problemów przy-
sparza fakt, ˝e sk∏adniki mieszaniny nie-
rzadko powodowa∏y zaburzenia i p´k-
ni´cia materia∏u genetycznego komórek,
do których jà wprowadzono. Cz´sto do-
chodzi∏o do „amputacji” ramion chro-
mosomów, w kilku przypadkach po-
wstawa∏y nawet mikrochromosomy
z∏o˝one nie tylko z wprowadzonych
sekwencji.

DoÊwiadczenia te sà wi´c dopiero

pierwszym etapem w konstruowaniu
prawdziwych HAC-ów (human artifi-
cial chromosomes – sztucznych chro-
mosomów ludzkich) w sposób zaplano-
wany. Poniewa˝ obecnie stosowana
metoda powoduje cz´ste zmiany we
w∏asnych chromosomach komórki, nie
mo˝na jej jeszcze wykorzystaç w tera-
pii genowej. Pozwala jednak ona na
przyk∏ad na dok∏adniejszà analiz´ ob-
szaru centromeru naturalnych chromo-
somów ludzkich.

¸àczàc ze sobà sekwencje alfa-sateli-

tarnego DNA, naukowcy uzyskali cen-
tromery, dzi´ki czemu okreÊlili ich sek-
wencj´ nukleotydowà. Poniewa˝ przed
po∏àczeniem z innymi jednostkami
mo˝na spowodowaç w nich zmiany,
zbudowanie sztucznych zmodyfikowa-
nych centromerów jest ju˝ sprawà re-
alnà. Naukowcy dysponujà wi´c ju˝ no-
wà metodà badania funkcji tych wa˝-
nych elementów chromosomów –
szczególnie tego, jak oddzia∏ujà one
z bia∏kami i jak zapewniajà równomier-
ny rozdzia∏ materia∏u genetycznego do
komórek potomnych.

T∏umaczy∏a

Ewa Bartnik

INGE HOEFER jest cz∏onkiem zespo∏u
redakcyjnego Spektrum der Wissenschaft
– niemieckiej wersji Scientific American,
z której pochodzi ten artyku∏.

RAPORT SPECJALNY

RAPORT SPECJALNY

Literatura uzupe∏niajàca

do

RAPORTU SPECJALNEGO

TRUDNOÂCI W LECZENIU GENAMI

GENE THERAPY FOR HUMAN GENETIC DISEASE.

The-

odore Friedman i Richard Roblin, Science,
vol. 175, ss. 949-955, 3 III 1972.

HUMAN SOMATIC GENE THERAPY: PROGRESS AND

PROBLEMS

. M. K. Brenner, Journal of Internal

Medicine, vol. 237, nr 3, ss. 229-239, III/1995.

RECOMBINANT DNA RESEARCH.

National Institu-

tes of Health, Federal Register, vol. 61, nr 131,
ss. 35774-3577, 8 VII 1996.

NIEWIRUSOWE STRATEGIE

DOSTARCZANIA GENÓW

DIRECT GENE TRANSFER INTO MOUSE MUSCLE IN VI-

VO

. Jon A. Wolff, Robert W. Malone, Phillip

Williams, Wang Chong, Gyula Acsadi,
Agnes Jani i Philip L. Felgner, Science,
vol. 247, ss. 1465-1468, 23 III 1990.

DIRECT GENE TRANSFER FOR IMMUNOTHERAPY. G.

J. NABEL I P. L. FELGNER, w:

Trends in Biotech-

nology, vol. 11, nr 5, ss. 211-215, V/1993.

DNA VACCINES

. J. J. Donnelly, J. B. Ulmer, J. W.

Shiver i M. A. Liu, Annual Review of Immuno-
logy, vol. 15, ss. 617-648, 1997.

LIPIDIC VECTOR SYSTEMS FOR GENE TRANSFER

. R.

J. Lee i L. Huang, Critical Reviews in Thera-
peutic Drug Carrier Systems, vol. 14, nr 2,
ss. 173-206, 1997.

TERAPIA GENOWA

NOWOTWORÓW I AIDS

GENE TRANSFER AS CANCER THERAPY

. Glenn Dra-

noff i Richard C. Mulligan, Advances in Im-
munology, vol. 58, ss. 417-454, 1995.

STEPS TOWARD GENE THERAPY, 2: CANCER AND

AIDS

. R. M. Blaese, Hospital Practice, vol. 30,

nr 12, ss. 37-45, 15 XII 1995.

GENE THERAPY STRATEGIES FOR NOVEL CANCER

THERAPEUTICS

. Maryland E. Rosenfeld i Da-

vid T. Curiel, Current Opinion in Oncology,
vol. 8, nr 1, ss. 72-77, I/1996.

TERAPIA GENOWA

UK¸ADU NERWOWEGO

LONG-TERM BEHAVIORAL RECOVERY IN PARKINSO-

NIAN RATS BY AN HSV VECTOR EXPRESSING TYRO-
SINE HYDROXYLASE

. M. J. During i in., Science,

vol. 266, ss. 1399-1403, 25 XI 1994.

USE OF HERPES SIMPLEX VIRUS VECTORS FOR PRO-

TECTION FROM NECROTIC NEURON DEATH

. D. Y.

Ho i in., w: Viral Vectors: Gene Therapy and
Neuroscience Applications. Red. M. Kaplitt i A.
Loewy; Academic Press, 1995.

GENE TRANSFER TO NEURONS USING HERPES SIM-

PLEX VIRUS-BASED VECTORS

. D. J. Fink, N. A.

DeLuca, W. F. Goins i J. C. Glorioso, Annu-
al Review of Neuroscience, vol. 19, ss. 245-287,
1996.

SZTUCZNY

LUDZKI MIKROCHROMOSOM

FORMATION OF DE NOVO CENTROMERES AND CON-

STRUCTION OF FIRST-GENERATION HUMAN ARTI-
FICIAL MICROCHROMOSOMES

. John J. Harring-

ton, Gil Van Bokkelen, Robert W. Mays,
Karen Gustashaw i Huntington F. Wil-
lard, Nature Genetics, vol. 15, ss. 345-355,
15 IV 1997.