315 321 id 35098 Nieznany (2)

background image

Postępy Biochemii 59 (3) 2013

315

Anna Ciarkowska

*

Anna Jakubowska

Zakład Biochemii, Wydział Biologii i Ochrony

Środowiska, Uniwersytet Mikołaja Kopernika,

Toruń

*

Zakład Biochemii, Wydział Biologii i Ochrony

Środowiska, Uniwersytet Mikołaja Kopernika,

ul. Lwowska 1, 87-100 Toruń; tel.: (56) 61 14

542, e-mail: annaciar@doktorant.umk.pl

Artykuł otrzymano 7 lutego 2013 r.

Artykuł zaakceptowano 2 kwietnia 2013 r.

Słowa kluczowe: produkcja białek rekombino-

wanych, system ekspresyjny, drożdże metylo-

troficzne, Pichia pastoris

Wykaz skrótów: AOX — oksydaza alkoholo-

wa; DAS — syntaza dihydroksyacetonu; GAP

— dehydrogenaza aldehydu 3-fosfogliceryno-

wego; FLD1 — dehydrogenaza formaldehydu

zależna od glutationu; PEX8 — białko macie-

rzy peroksysomalnej; PHO1 — kwaśna fosfa-

taza; SUC2 — inwertaza; PHA-E — fitohema-

glutynina

Pichia pastoris jako system ekspresyjny do produkcji białek rekombinowanych

STRESZCZENIE

P

ichia pastoris cieszy się coraz większą popularnością jako system ekspresyjny. Niski

koszt hodowli oraz wysoka wydajność czynią ten gatunek drożdży atrakcyjną alternaty-

wą dla systemów wykorzystujących komórki wyższych eukariontów. Wybierając

P. pastoris

omija się też wiele problemów napotykanych w przypadku zastosowania systemów bakte-

ryjnych — nieprawidłowe zwijanie białek oraz brak modyfikacji potranslacyjnych. Dostęp-

ność bardzo silnych promotorów, zwłaszcza promotora

AOX1, a także możliwość sekrecji

rekombinowanego białka do medium hodowlanego również przyczyniają się do ogromnej

popularności

P. pastoris. Wiele zalet tego systemu umożliwia jego zastosowanie nie tylko

do produkcji białek w celach badawczych, ale także na większą skalę do zastosowań prze-

mysłowych.

WPROWADZENIE

W latach 70. XX wieku większość komercyjnie dostępnych białek pozyski-

wana była w tradycyjny sposób poprzez izolację z tkanek roślinnych lub zwie-

rzęcych. Metodą tą nie można było uzyskać dużych ilości białek, stąd też ich

dostępność była niska, a ceny wysokie. Dopiero rozwój inżynierii genetycznej

umożliwił produkcję białek rekombinowanych w znaczących ilościach. Wyko-

rzystuje się w tym celu różnego rodzaju systemy ekspresyjne, do których należą

bakterie, drożdże, grzyby pleśniowe, komórki owadzie oraz komórki ssaków i

roślin [1-3]. Wady i zalety wybranych systemów ekspresyjnych przedstawiono

w tabeli 1.

Tabela 1. Zalety i wady wybranych systemów ekspresyjnych używanych do

produkcji białek rekombinowanych na podstawie [1-3].

Zalety

Wady

Bakterie

niski koszt

łatwość hodowli oraz

manipulacji potranslacyjnych

duża wydajność

hodowla nie jest praco- i

czasochłonna

trudności w pozyskiwaniu

białek zawierających

mostki dwusiarczkowe

brak modyfikacji potranslacyjnych,

w tym glikozylacji

białka wytwarzane w nieaktywnej

formie w postaci ciał inkluzyjnych

możliwe zanieczyszczenia

endotoksynami

Drożdże

niski koszt

mogą być hodowane do

dużych gęstości

łatwość manipulacji genetycznych

przeprowadzają modyfikacje

potranslacyjne

duża wydajność

możliwa sekrecja białka do

medium hodowlanego

prawidłowe zwijanie białek

białka glikozylowane w inny

sposób niż w komórkach ssaczych

Komórki

owadów

przeprowadzają modyfikacje

potranslacyjnych

duża wydajność

możliwa sekrecja białka do

medium hodowlanego

prawidłowe zwijanie białek

jednoczesna ekspresja wielu genów

możliwość odkładania się białka

rekombinowanego w formie

nieaktywnych agregatów

stosunkowo wysoki koszt

Komórki

ssaków

przeprowadzają modyfikacje

potranslacyjne

sposób glikozylacji najbardziej

zbliżony do ludzkiego

prawidłowe zwijanie białek

możliwe zanieczyszczenia

wirusowym i onkogennym DNA

wysoki koszt

długotrwały proces produkcji

niska wydajność

background image

316

www.postepybiochemii.pl

Wyjątkowość drożdży jako systemu ekspresyjnego

polega na tym, że łączą one zalety systemów prokario-

tycznych (niskie koszty, prostota, duża wydajność) i

eukariotycznych (przeprowadzanie modyfikacji potran-

slacyjnych, prawidłowe zwijanie białek) [4]. Największą

popularnością cieszą się obecnie dwa gatunki drożdży:

Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) oraz Pichia pastoris

(P. pastoris) [3,5].

DROŻDŻE METYLOTROFICZNE

W drożdżach metylotroficznych funkcjonuje specyficz-

ny szlak metabolizmu metanolu, pozwalający im wyko-

rzystywać ten związek jako źródło węgla. W pierwszym

etapie przemian metabolicznych metanolu związek ten

jest utleniany w obecności O

2

do formaldehydu z wydzie-

leniem nadtlenku wodoru przez oksydazę alkoholową

(AOX). Powstający w tej reakcji H

2

O

2

jest następnie usu-

wany przez katalazę. Formaldehyd może ulec utlenieniu

(szlak dysymilacji metanolu) lub kondensacji z ksylulozo-

-5-fosforanem (szlak asymilacji) w reakcji katalizowanej

przez syntazę dihydroksyacetonu (DAS). AOX, katalaza

oraz DAS zlokalizowane są w peroksysomach, gdzie za-

chodzi pierwszy etap metabolizmu metanolu. W drugim

etapie produkty reakcji kondensacji katalizowanej przez

DAS: dihydroksyaceton oraz aldehyd 3-fosfoglicerynowy

ulegają dalszym przemianom, które zachodzą w cytopla-

zmie [4].

P. pastoris posiada dwie endogenne kopie genu AOX:

AOX1 oraz AOX2. AOX1 odpowiada za powstawanie około

90% oksydazy alkoholowej w komórce P. pastoris, natomiast

AOX2 posiada słabszy promotor i odpowiada za powstawa-

nie jedynie 10% enzymu. Ekspresja obu genów ulega induk-

cji w obecności metanolu [7].

Wszystkie zidentyfikowane do tej pory szczepy drożdży

metylotroficznych należą do czterech rodzajów: Hansenula,

Pichia, Candida oraz Torulopsis [6].

Ze względu na metabolizm metanolu można wyróżnić

trzy fenotypy P. pastoris:

Mut

+

(ang. methanol utilization plus) — drożdże o tym

fenotypie posiadają w pełni funkcjonalne obie kopie genu

AOX i dzięki temu rosną na metanolu w takim samym tem-

pie jak typ dziki P. pastoris. Najczęściej stosowanym szcze-

pem o takim fenotypie jest GS115 [6,8].

Mut

s

(ang. slow methanol utilization) — szczepy o ta-

kim fenotypie posiadają niefunkcjonalny gen AOX1. Z

tego powodu metabolizm metanolu opiera się jedynie na

AOX2, której gen posiada słabszy promotor i zapewnia

niższy poziom ekspresji. Dlatego też komórki P. pastoris

o fenotypie Mut

s

rosną na metanolu wolniej niż drożdże

o fenotypie Mut

+

. Często konieczne jest wręcz zastosowa-

nie dodatkowych źródeł węgla, takich jak sorbitol, man-

nitol, trehaloza lub alanina — warunkiem jest jednak aby

żadne z dodatkowych źródeł węgla nie powodowało re-

presji promotora AOX. Przykładem szczepu P. pastoris o

fenotypie Mut

s

jest KM71 [6,9].

Mut

-

(ang. methanol utilization minus) — fenotyp ten cha-

rakteryzuje się brakiem funkcjonalnych kopii obu genów

AOX i związaną z tym niemożnością wzrostu na metanolu.

Przykładowym szczepem P. pastoris o fenotypie Mut

-

jest

MC100-3 [6,10].

P. pastoris, jako przedstawiciela drożdży metylotroficz-

nych, charakteryzuje wiele zalet zapewniających przewagę

nad S. cerevisiae, gdy w grę wchodzi wybór systemu eks-

presyjnego do produkcji białek rekombinowanych. Wy-

bierając P. pastoris przede wszystkim omija się problem

hiperglikozylacji białka rekombinowanego, który pojawia

się w tym gatunku zdecydowanie rzadziej w porównaniu

z S. cerevisiae. Istnieją jednak pewne wyjątki, np. nadpro-

dukowana w P. pastoris endoglukanaza II z Trichoderma re-

esei, czy HIV gp 120, które ulegają hiperglikozylacji [11,12].

Glikoproteiny syntetyzowane w tym systemie posiadają

mannozowy łańcuch oligosacharydu złożony z maksymal-

nie 20 jednostek, podczas gdy w przypadku S. cerevisiae

długość łańcucha cukrowego wynosi aż 50–150 jednostek

mannozowych. Ponadto, P. pastoris nie posiada enzymu

α-1,3-mannozylotransferazy, który u S. cerevisiae przyłą-

cza na końcu oligosacharydu mannozę za pośrednictwem

wiązania α-1,3-glikozydowego, co jest niepożądane w przy-

padku białek terapeutycznych, gdyż wywołuje intensywną

odpowiedź immunologiczną u pacjentów, którym podaje

się taką glikoproteinę. P. pastoris zapewnia również dużo

większą niż S. cerevisiae wydajność produkcji białka rekom-

binowanego, jak też umożliwia jego sekrecję do medium ho-

dowlanego. Zdolność P. pastoris do wzrostu na pożywkach

zawierających wysokie, zabójcze dla większości innych mi-

kroorganizmów, stężenia metanolu zapobiega zakażeniu

hodowli [1]. W przeciwieństwie do S. cerevisiae, P. pastoris

preferuje procesy tlenowe niż fermentacyjne, dzięki czemu

w hodowli nie powstają duże ilości etanolu i kwasu octo-

wego, które ze względu na toksyczny wpływ na komórki

powodowałyby zahamowanie wzrostu hodowli [13].

PRODUKCJA BIAŁEK REKOMBINOWANYCH

W

P. PASTORIS

Działania prowadzące do uzyskania białek rekombino-

wanych w P. pastoris, podobnie jak i w innych systemach

ekspresyjnych, możemy podzielić na kilka podstawowych

etapów. Pierwszym krokiem jest wklonowanie transgenu

do wektora ekspresyjnego. Następnie przeprowadzamy

transformację komórek gospodarza oraz selekcję transfor-

mantów, do których udało się wprowadzić wektor ekspre-

syjny. Transformowane komórki hoduje się w określonych

warunkach, po czym izoluje się z nich i oczyszcza białko

rekombinowane [14].

P. pastoris transformuje się stosując fuzję sferoplastów,

elektroporację bądź koprecypitację z chlorkiem litu,

chlorkiem wapnia lub glikolem polietylenowym [15]. W

przeciwieństwie do S. cerevisiae, które można transformo-

wać za pomocą wektorów integracyjnych i episomalnych,

do transformacji P. pastoris stosuje się prawie wyłącznie

wektory integracyjne. Wynika to z faktu, że w komór-

kach P. pastoris nie udało się zidentyfikować naturalnie

występujących plazmidów episomalnych, takich jak 2μ w

background image

Postępy Biochemii 59 (3) 2013

317

S.

cerevisiae [16]. Ponadto, wszystkie stosowane wektory

ekspresyjne zaliczają się do wektorów wahadłowych —

mogą namnażać się nie tylko w komórkach P. pastoris, ale

również w E. coli [17]. Typowe elementy wchodzące w

skład takiego wektora to: promotor, polilinker umożli-

wiający wklonowanie transgenu, sygnał terminacji trans-

krypcji, bakteryjne miejsce inicjacji replikacji, markery

selekcyjne dla P. pastoris i E. coli oraz opcjonalnie sygnał

sekrecyjny [15,18].

Genetycznie stabilne transformanty P. pastoris uzyskuje

się w wyniku integracji kasety ekspresyjnej do chromoso-

mu w specyficznym locus [19]. Może do niej dojść w wyniku

rekombinacji homologicznej poprzez wstawienie lub zastą-

pienie genu. W tym drugim przypadku często doprowadza

się do zastąpienia genu AOX1 transgenem wykorzystując w

tym celu plazmidy zawierające promotor AOX1 oraz frag-

ment sekwencji 3’-końcowej genu AOX1, uzyskane w ten

sposób transformanty charakteryzują się fenotypem Mut

S

.

Transformanty powstałe w wyniku zastąpienia genu są

zwykle bardziej stabilne genetycznie, ale również jednoko-

pijne [10]. Liczba kopii wprowadzonego genu wpływa na

wydajność produkcji rekombinowanego białka, zwykle im

większa ilość kopii tym więcej białka powstaje [6]. Ze wzglę-

du na brak stabilnych wektorów episomalnych dla P. pasto-

ris rzadko przeprowadza się transformację tych drożdży za

ich pomocą. Plazmidy episomalne replikują niezależnie od

chromosomu i mogą zostać utracone przez komórki w wy-

niku kolejnych podziałów. Z tego powodu transformanty

niosące plazmidy episomalne muszą być poddawane sta-

łej selekcji, co umożliwia wyeliminowanie komórek, które

utraciły transgen razem z wektorem, a zachowanie jedynie

transformowanej populacji. Ponadto plazmidy episomalne

występują zwykle w niewielkiej ilości kopii, a jak już wcze-

śniej wspomniano, niewielka ilość wprowadzonych kopii

transgenu może prowadzić do niskiej wydajności produkcji

białka [10,15].

Optymalne warunki hodowli P. pastoris w dużym stop-

niu zależą od wybranego szczepu oraz od właściwości wy-

twarzanego białka. Różnego rodzaju stres środowiskowy

lub metaboliczny może wpływać na produkcję białek re-

kombinowanych [20,21]. Czynniki środowiskowe takie jak

temperatura, niskie pH, wysoka osmotyczność oraz stres

oksydacyjny mogą powodować spadek wydajności wy-

twarzania białka rekombinowanego poprzez negatywny

wpływ na proces zwijania się białek oraz ich sekrecję [20].

Optymalna temperatura dla hodowli P. pastoris w celu

produkcji białka rekombinowanego wynosi 30°C. Przy

temperaturze powyżej 32°C obserwuje się zahamowanie

produkcji białka oraz gwałtowny spadek tempa wzrostu

hodowli [22]. Natomiast obniżenie temperatury hodowli do

20–25°C wpływa korzystnie na proces zwijania się białka

i poprawia wydajność jego produkcji [20]. W wielu przy-

padkach niższa temperatura hodowli prowadzi również do

zmniejszenia stresu oksydacyjnego wywołanego wzrostem

w obecności wysokich stężeń metanolu. Stres oksydacyjny

można również redukować poprzez stosowanie antyoksy-

dantów, np. kwasu askorbinowego lub równoległą ekspre-

sję enzymów antyoksydacyjnych, takich jak dysmutaza po-

nadtlenkowa [23,24].

P. pastoris jest zdolna do wzrostu w szerokim zakresie

pH (3,0–7,0), jednak hodowle zwykle prowadzi się w pH o

wartości 5,0–6,0 [22]. Przy zbyt niskim pH medium hodow-

lanego P. pastoris musi zużywać więcej energii na utrzyma-

nie stałego fizjologicznego poziomu pH wewnątrz komórki.

Prowadzi to do spowolnienia wzrostu hodowli oraz spadku

wydajności sekrecji w wyniku wzmocnienia bariery stano-

wionej przez ścianę komórkową [20].

Istotną zaletą P. pastoris jako systemu ekspresyjnego jest

łatwość modyfikacji skali hodowli. Chociaż P. pastoris jest

w stanie w sposób wydajny wytwarzać białka w hodowli

stacjonarnej, w przypadku hodowli w fermentorze uzy-

skuje się zwykle dużo lepsze rezultaty. Wynika to przede

wszystkim z tego, że fermentor umożliwia bardzo dokładną

kontrolę pH pożywki, natlenienia oraz tempa dostarczania

substratu, dzięki czemu P. pastoris może rosnąć do bardzo

dużych gęstości. System ten jest więc idealny do produkcji

białek na skalę przemysłową [17].

PROMOTORY

Wysoki poziom ekspresji obcego genu powoduje duże

obciążenie metaboliczne komórek. Zdarza się również, że

nagromadzenie produkowanego białka może wywierać

toksyczny wpływ na komórki gospodarza. Z tych powo-

dów zwykle stosuje się promotory indukowane, dzięki któ-

rym możemy rozpocząć syntezę białka rekombinowanego

dopiero wówczas, gdy hodowla osiągnie odpowiednią gę-

stość i w ten sposób zwiększyć wydajność produkcji [14].

Przykładem promotora indukowanego metanolem jest pro-

motor genu AOX1 z P. pastoris. Oksydaza alkoholowa utle-

nia metanol do formaldehydu wykorzystując do tego tlen

cząsteczkowy. Enzym ten wykazuje jednak niskie powino-

wactwo względem tlenu. Komórki P. pastoris kompensują to

wytwarzaniem bardzo dużych ilości AOX1 (do 30% całko-

witego białka komórki) w wyniku indukcji metanolem [25].

Ze względu na dużą siłę oraz ścisłą regulację promotora

AOX1 jest on bardzo często wykorzystywany do produkcji

białek rekombinowanych w P. pastoris [6].

Glukoza, etanol oraz glicerol są silnymi represorami pro-

motora AOX1 [4]. W pierwszym etapie hodowli P. pastoris

stosuje się pożywki, które jako źródło węgla zawierają je-

den z represorów promotora AOX1: glukozę lub glicerol.

Umożliwia to nagromadzenie biomasy przed rozpoczęciem

indukcji komórek do produkcji białka rekombinowanego.

Częściej stosuje się glicerol, ponieważ w przeciwieństwie

do glukozy nie jest on substratem do procesów fermenta-

cyjnych. Aby doprowadzić do indukcji promotora AOX1

konieczne jest zastąpienie pierwotnego źródła węgla me-

tanolem. Zmiana pożywki na zawierającą metanol jako je-

dyne źródło węgla powoduje ponad 1000-krotną indukcję

promotora AOX1 [13]. W przypadku białek wewnątrzko-

mórkowych ich najwyższy poziom obserwuje się w ciągu

24 godzin od indukcji metanolem, natomiast w przypadku

białek ulegających sekrecji, w ciągu 24–100 godzin od in-

dukcji [17].

Do produkcji białek z zastosowaniem promotora AOX1

można wykorzystywać szczepy P. pastoris o wszystkich

background image

318

www.postepybiochemii.pl

trzech typach metabolizmu metanolu. Często jednak ko-

rzystniejsze okazuje się wybranie szczepu Mut

-

lub Mut

S

, co

zapewnia mniejsze zużycie metanolu. W tych przypadkach

w czasie indukcji stosuje się pożywki zawierające dodatko-

we źródło węgla nie będące represorem promotora AOX1:

sorbitol, mannitol, trehalozę lub alaninę [19,26].

Z wykorzystaniem promotora AOX1 wiąże się kilka

istotnych problemów wynikających z konieczności stoso-

wania dużych ilości metanolu. Zbyt wysokie stężenie meta-

nolu może toksycznie wpływać na komórki P. pastoris, dla-

tego też konieczne jest stałe monitorowanie jego poziomu w

hodowli. Innym problemem utrudniającym wykorzystanie

tego promotora do produkcji białek rekombinowanych na

skalę przemysłową jest to, że metanol jest substancją łatwo-

palną i przechowywanie jego dużych ilości prowadzi do

zagrożenia pożarowego. Ponadto, wymagane jest wykorzy-

stanie dwóch różnych źródeł węgla, których wymiana musi

nastąpić w ściśle określonym momencie, a w przypadku

hodowli na skalę laboratoryjną, bez wykorzystania fermen-

tora, bardzo trudne jest dokładne kontrolowanie warunków

indukcji [6,17].

Ze względu na wyżej wymienione trudności związane

ze stosowaniem promotora AOX1 poszukiwano alterna-

tywnych promotorów, które umożliwiłyby równie wy-

dajną produkcję białek rekombinowanych w P. pastoris.

Wykorzystanie promotora genu dehydrogenazy aldehydu

3-fosfoglicerynowego (GAP) z P. pastoris zapewnia wysoki

konstytutywny poziom ekspresji transgenu. W niektórych

przypadkach, np. dla β-laktamazy, promotor GAP umożli-

wia uzyskanie większej ilości białka rekombinowanego niż

promotor AOX1. Ponieważ promotor GAP jest promotorem

konstytutywnym, nie nadaje się do produkcji białek wywie-

rających toksyczny wpływ na komórkę [27].

Promotor genu dehydrogenazy formaldehydu zależnej

od glutationu (FLD1) z P. pastoris zapewnia podobny po-

ziom ekspresji, co promotor AOX1. Indukcję promotora

FLD1 można przeprowadzać na dwa sposoby: metanolem

lub metyloaminą [28,29].

Bardzo wysoki poziom ekspresji zapewniany przez pro-

motory AOX1, FLD1 i GAP może wywierać toksyczny efekt

na komórki P. pastoris, a także powodować nadmierne ob-

ciążenie metaboliczne komórki, przez co duże ilości białka

rekombinowanego nie posiadają odpowiednich modyfika-

cji potranslacyjnych i są nieprawidłowo sfałdowane [14]. Z

tego powodu konieczne było znalezienie promotorów po-

wodujących niższy poziom ekspresji.

Promotor genu białka macierzy peroksysomalnej PEX8

zapewnia konstytutywną ekspresję transgenu na bardzo ni-

skim poziomie przy zastosowaniu glukozy jako źródła wę-

gla oraz umiarkowaną indukcję w wyniku dodania metano-

lu. Z kolei promotor genu YPT1 kodującego zaangażowaną

w wydzielanie GTPazę umożliwia konstytutywną ekspresję

transgenu na niskim poziomie przy hodowli na pożywkach

zawierających jako źródło węgla glukozę, metanol lub man-

nitol [30].

Poznanie sekwencji genomowej P.pastoris umożliwiło

identyfikację wszystkich genów zaangażowanych w meta-

bolizm metanolu oraz ich promotorów, które w przyszłości

mogą znaleźć zastosowanie przy produkcji białek rekombi-

nowanych [31].

MARKERY SELEKCYJNE

Geny markerowe można podzielić na dwie grupy: mar-

kery auksotroficzne oraz nadające oporność na antybiotyk

[32]. Większość szczepów ekspresyjnych P. pastoris jest de-

fektywna w zakresie jednego lub kilku genów odpowie-

dzialnych za biosyntezę określonych związków. Szczepy

te nie są w stanie rosnąć na pożywkach bez suplementa-

cji danym związkiem, chyba że zostaną transformowane

wektorem niosącym funkcjonalny gen szlaku biosyntezy.

Do najpowszechniej stosowanych genów markerowych

z tej grupy należą geny szlaków syntezy aminokwasów i

nukleotydów: HIS4, ARG4, ADE1 oraz URA3 [13,16]. Kilka

lat temu udało się skonstruować auksotroficzne szczepy P.

pastoris, umożliwiające selekcję transformantów na pod-

stawie obecności genów ARG1, ARG2, ARG3, HIS1, HIS2,

HIS5 lub HIS6 [33]. Poza markerami auksotroficznymi

stosuje się również geny oporności na antybiotyki: gen Sh

ble ze Streptoalloteichus hindustanus nadający oporność na

zeocynę oraz gen oporności na G418 [34]. W celu selekcji

transformantów wielokopijnych często stosuje się kombi-

nację dwóch genów markerowych: wstępnej selekcji do-

konuje się na podstawie obecności genu HIS4, a następnie

wyodrębnia się transformaty oporne na wysokie stężenia

G418 [10].

SEKRECJA BIAŁEK REKOMBINOWANYCH

Dołączenie sygnału sekrecji do białka rekombinowanego

prowadzi do jego wydzielania z komórki, co w znacznym

stopniu ułatwia jego oczyszczanie. Bardzo ważną zaletą

P. pastoris jest to, że niewielka ilość jej natywnych białek

ulega sekrecji, są to głównie białka pełniące funkcje poza-

komórkowe lub wchodzące w skład ściany komórkowej

[6,35]. Dzięki temu białko rekombinowane może stanowić

nawet ponad 80% całkowitego białka w medium hodowla-

nym [15].

Najczęściej stosowanym sygnałem sekrecyjnym jest se-

kwencja liderowa czynnika koniugacyjnego α-MF z S. ce-

revisiae [17]. Wykorzystuje się również sekwencje sygnalne

kwaśnej fosfatazy z P. pastoris (PHO1), inwertazy (SUC2), fi-

tohemaglutyniny (PHA-E) z Phaseolus vulgaris, 128kDa biał-

ka pGKL oraz białka PIR1 z P. pastoris [15,36-38]. Możliwe

jest również zastosowanie natywnego sygnału sekrecji biał-

ka rekombinowanego, jeżeli posiada ono taką sekwencję.

Wydajność sekrecji zależy nie tylko od zastosowanego

peptydu sygnalnego, ale również od struktury produko-

wanego białka [13]. Białka, które naturalnie nie posiadają

sygnału sekrecyjnego lepiej jest wytwarzać wewnątrzko-

mórkowo, aby uniknąć nieprawidłowej glikozylacji i braku

pewnych modyfikacji potranslacyjnych [10].

background image

Postępy Biochemii 59 (3) 2013

319

TRUDNOŚCI ZWIĄZANE Z PRODUKCJĄ BIAŁEK

REKOMBINOWANYCH W

P. PASTORIS

Białka rekombinowane wydzielane z komórki mogą ule-

gać w medium hodowlanym degradacji proteolitycznej w

wyniku aktywności proteaz zewnątrzkomórkowych oraz

uwolnionych w wyniku lizy komórek proteaz wewnątrzko-

mórkowych. Proteoliza powoduje zmniejszenie wydajności

produkcji białka rekombinowanego z powodu jego degra-

dacji. Może również prowadzić do spadku aktywności wy-

twarzanego białka w wyniku jego skrócenia [6].

Istnieje kilka metod zmniejszania stopnia proteolizy biał-

ka rekombinowanego. Obniżenie temperatury hodowli lub

stosowanie pożywek o pH w zakresie 3,0–6,0 powoduje

spadek aktywności enzymów proteolitycznych [17,39]. Sta-

bilność białka rekombinowanego można również zwiększyć

dodając do pożywki suplementy bogate w aminokwasy

(np. pepton), które pełnią rolę alternatywnych substratów

dla proteaz oraz hamują ich indukcję powodowaną ogra-

niczonym dostępem azotu [6]. W celu zmniejszenia stopnia

proteolizy produkowanego białka stosuje się także szczepy

P. pastoris pozbawione niektórych proteaz. Gen PEP4 ko-

duje wakuolarną proteinazę A, która odpowiedzialna jest

za aktywację innych proteaz wakuolarnych, w tym karbok-

sypeptydazy Y oraz proteinazy B (kodowanej przez gen

PRB1). Mutanty pep4 (szczep SMD1168) wykazują wyraź-

ny spadek lub całkowity brak aktywności proteinazy A i

karboksypeptydazy Y oraz częściową redukcję aktywności

proteinazy B. Mutanty prb1 (szczep SMD1165) nie wyka-

zują aktywności proteinazy B, natomiast mutanty pep4prb1

(szczep SMD1163) charakteryzują się wyraźnym spadkiem

lub brakiem aktywności wszystkich trzech proteaz. Szcze-

py te są jednak mało żywotne, rosną powoli i trudno się je

transformuje, dlatego też należy je stosować jedynie wtedy,

gdy inne sposoby ograniczenia proteolizy okażą się mało

skuteczne [7,17].

Drożdże, podobnie jak komórki ssacze, przeprowadza-

ją dwa rodzaje glikozylacji białek: N- oraz O-glikozylację.

Może się jednak zdarzyć, że białka będą O-glikozylowane w

różnych miejscach, w zależności od organizmu,

w którym są produkowane. Przykładowo, ludz-

ka

midkina (czynnik wzrostu wiążący heparynę)

oraz czynnik IGF1 (insulinopodobny czynnik

wzrostu 1) nie są naturalnie

glikozylowane, jed-

nak rekombinowane białka uzyskane w P. pasto-

ris podlegały O-glikozylacji [10].

Wysokomannozowy typ N-glikozylacji białek

charakterystyczny dla drożdży powoduje, że pro-

dukowane w nich białka rekombinowane wywo-

łują u ludzi odpowiedź immunologiczną. Sposób

glikozylacji wpływa ponadto na okres półtrwania

białka oraz jego potencjał terapeutyczny. Z tego

powodu utrudnione jest zastosowanie białek re-

kombinowanych produkowanych w P. pastoris

do celów terapeutycznych. Rozwiązaniem tego

problemu jest konstruowanie szczepów P. pasto-

ris przeprowadzających glikozylację w sposób

charakterystyczny dla komórek ssaczych [40-42].

Szczepy takie muszą zostać pozbawione niektó-

rych enzymów, np. α-1,6-mannozylotransferazy,

wprowadza się do nich natomiast geny odpowiedzialne za

glikozylację typu ludzkiego [40]. Stosując szczep P. pastoris

o zmodyfikowanym typie glikozylacji udało się wyprodu-

kować funkcjonalną erytropoetynę szczura. Dalsze prace

nad modyfikacją szlaków glikozylacji P. pastoris mogą w

przyszłości umożliwić wytwarzanie białek terapeutycz-

nych w tym systemie ekspresyjnym zamiast w komórkach

ssaczych, co pozwoli zredukować koszty oraz czas trwania

produkcji, a także wyeliminować zanieczyszczenia wiruso-

we z preparatów [42].

PODSUMOWANIE

P. pastoris jest obecnie najczęściej używanym gatunkiem

drożdży do produkcji białek rekombinowanych [31]. Za

pomocą tego systemu otrzymuje się białka prokariotycz-

ne, między innymi toksyny bakteryjne wykorzystywane

do wytwarzania szczepionek, a także białka eukariotyczne

[25,32]. W P. pastoris produkuje się również białka błonowe,

ponad połowa wyprodukowanych do tej pory białek błono-

wych pochodzenia ssaczego została wytworzona przez P.

pastoris lub S. cerevisiae [5].

W tabeli 2 przedstawiono przykłady białek uzyskiwa-

nych w systemie ekspresyjnym P. pastoris. Pełna lista, pro-

wadzona przez laboratorium Jamesa Cregg’a dostępna jest

na stronie internetowej http://www.kgi.edu/documents/

faculty/James_Cregg/heterologous_proteins_expressed_

in_pichia_pastoris.pdf.

PIŚMIENNICTWO

1. Demain AL, Vaishnav P (2009) Production of recombinant proteins by

microbes and higher organisms. Biotechnol Adv 27: 297-306

2. Houdebine L-M (2009) Production of pharmaceutical proteins by

transgenic animals. Comp Immun Microbiol Infect Dis 32: 107-121

3. Nuc P, Nuc K (2006) Produkcja rekombinowanych białek w Escherichia

coli. Postepy Biochem 52: 448-456

4. Hartner FS, Glieder A (2006) Regulation of methanol utilization path-

way genes in yeast. Microb Cell Fact

5: 39-59

Tabela 2. Przykłady białek rekombinowanych produkowanych w P. pastoris

Białko

Pochodzenie

Piśmiennictwo

Botulina

Clostridium botulinum

[25]

Neurotoksyna tężcowa

Clostridium teteani

[25]

Dysmutaza ponadtlenkowa

Saccharomyces cerevisiae

[24]

Lipaza B

Candida antarctica

[43]

Fitaza

Aspergillus niger

[44]

Oksydaza heksozowa

Chondrus crispus

[45]

Hirudyna

Hirudo medicinalis

[23]

GFP

Aqueora victoria

[32]

Apiraza

Solanum tuberosum

[46]

Aglutynina

Galanthus nivalis

[36]

α-amylaza

mysz

[37]

Erytropoetyna

szczur

[42]

Antytrombina III

człowiek

[47]

Chitynaza

człowiek

[48]

Cystatyna C

człowiek

[49]

Kolagen typu I

człowiek

[50]

background image

320

www.postepybiochemii.pl

5. Bawa Z, Bland CE, Bonander N, Bora N, Cartwright SP, Clare M, Con-

ner MT, Darby RAJ, Dilworth MV, Holmes WJ, Jamshad M, Routledge

SJ, Gross SR, Bill RM (2011) Understanding the yeast host cell response

to recombinant membrane protein production. Biochem Soc Trans 39:

719-723

6. Macauley-Patrick S, Fazenda ML, McNeil B, Harvey LM (2005) Het-

erologous protein production using the Pichia pastoris expression sys-

tem. Yeast 22: 249-270

7. Darby RAJ, Cartwright SP, Dilworth MV, Bill RM (2012) Which yeast

species shall I choose? Saccharomyces cerevisiae versus Pichia pastoris.

Methods Mol Biol 866: 11-23

8. Cregg JM, Cereghino JL, Shi J, Higgins DR (2000) Recombinant protein

expression in Pichia pastoris. Mol Biotechnol 16: 23-52

9. Inan M, Meagher MM (2001) Non-repressing carbon sources for al-

cohol oxidase (AOX1) promoter of Pichia pastoris. J Biosci Bioeng 92:

585-589

10. Daly R, Hearn MTW (2005) Expression of heterologous proteins in

Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and

production. J Mol Recognit 18: 119-138

11. Samanta S, Basu A, Halder UC, Sen SK (2012) Characterization of

Trichoderma reesei endoglucanase II expressed heterologously in Pichia

pastoris for better biofinishing and biostoning. J Microbiol 50: 518-525

12. Scorer CA, Buckholz RG, Clare JJ, Romanes MA (1997) The intracellu-

lar production and secretion of HIV-1 envelope protein in the methy-

lotrophic yeast Pichia pastoris. Gene 136: 111-119

13. Cereghino GPL, Cereghino JL, Ilgen C, Cregg JM (2002) Production of

recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris.

Curr Opin Biotechnol 13: 329-332

14. Cereghino GPL, Cregg JM (1999) Applications of yeast in biotechnol-

ogy: protein production and genetic analysis. Curr Opin Biotechnol

10: 422-427

15. Li P, Anumanthan A, Gao X-G, Ilangovan K, Suzara VV, Düzgüneş N,

Renugopalakrishnan V (2007) Expression of recombinant proteins in

Pichia pastoris. Appl Biochem Biotechnol 142: 105-124

16. Hahn-Hägerdal B, Karhumaa K, Larsson CU, Gorwa-Grauslund M,

Görgens J, van Zyl WH (2005) Role of cultivation media in the devel-

opment of yeast strains for large scale industrial use. Microb Cell Fact

4: 31-46

17. Cereghino JL, Cregg JM (2000) Heterologous protein expression in the

methylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS Microbiol Rev 24: 45-66

18. Cereghino GPL, Sunga AJ, Cereghino JL, Cregg JM (2001) Expression

of foreign genes in the yeast Pichia pastoris. Genet Eng 23: 157-169

19. Sreekrishna K, Brankamp RG, Kropp KE, Blankenship DT, Tsay J-T,

Smith PL, Wierschke JD, Subramaniam A, Birkenberger LA (1997)

Strategies for optimal synthesis and secretion of heterologous proteins

in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Gene 190: 55-62

20. Gasser B, Saloheimo M, Rinas U, Dragosits M, Rodríguez-Carmona E,

Baumann K, Giuliani M, Parrilli E, Branduardi P, Lang C, Porro D, Fer-

rer P, Tutino ML, Mattanovich D, Villaverde A (2008) Protein folding

and conformational stress in microbial cells producing recombinant

proteins: a host comparative overview. Microb Cell Fact 7: 11-28

21. Mattanovich D, Gasser B, Hohenblum H, Sauer M (2004) Stress in re-

combinant protein producing yeasts. J Biotechnol 113: 121-135

22. Cos O, Ramón R, Montesinos JL, Valero F (2006) Operational strate-

gies, monitoring and control of heterologous protein production in

the methylotrophic yeast Pichia pastoris under different promoters: a

review. Microb Cell Fact 5: 17-36

23. Xiao A, Zhou X, Zhou L, Zhang Y (2006) Improvement of cell viability

and hirudin production by ascorbic acid in Pichia pastoris fermenta-

tion. Appl Microbiol Biotechnol 72: 837-844

24. Li J-R, Yu P (2007) Expression of Cu, Zn-superoxide dismutase gene

from Saccharomyces cerevisiae in Pichia pastoris and its resistance to oxi-

dative stress. Appl Biochem Biotechnol 136: 127-139

25. Gurkan C, Ellar DJ (2005) Recombinant production of bacterial toxins

and their derivatives in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Mi-

crob Cell Fact 4: 33-40

26. Inan M, Meagher MM (2001) The effect of ethanol and acetate on pro-

tein expression in Pichia pastoris. J Biosci Bioeng 92: 337-341

27. Waterham HR, Digan ME, Koutz PJ, Lair SV, Cregg JM (1997) Isola-

tion of the Pichia pastoris glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

gene and regulation and use of its promoter. Gene 186: 37-44

28. Shen S, Sulter G, Jeffries TW, Cregg JM (1998) A strong nitrogen sour-

ce-regulated promoter for controlled expression of foreign genes in the

yeast Pichia pastoris. Gene 216: 93-102

29. Resina D, Serrano A, Valero F, Ferrer P (2004) Expression of a Rhizo-

pus oryzae lipase in Pichia pastoris under control of the nitrogen source-

-regulated formaldehyde dehydrogenase promoter. J Biotechnol 109:

103-113

30. Sears IB, O’Connor J, Rossanese OW, Glick BS (1998) A versatile set of

vectors for constitutive and regulated gene expression in Pichia pasto-

ris. Yeast 14: 783-790

31. De Schutter K, Lin Y-C, Tiels P, Van Hecke A, Glinka S, Weber-Leh-

mann J, Rouzé P, Van der Peer Y, Callewaert N (2009) Genome sequ-

ence of the recombinant protein production host Pichia pastoris. Nat

Biotechnol 27: 561-566

32. Papakonstantinou T, Harris S, Hearn MTW (2009) Expression of GFP

using Pichia pastoris vectors with zeocin or G-418 sulphate as the pri-

mary selectable marker. Yeast 26: 311-321

33. Nett JH, Hodel N, Raush S, Wildt S (2005) Cloning and disruption of

the Pichia pastoris ARG1, ARG2, ARG3, HIS1, HIS2, HIS5, HIS6 genes

and their use as auxotrophic markers. Yeast 22: 295-304

34. Agaphonov M, Romanova N, Choi E-S, Ter-Avanesyan M (2010) A

novel kanamycin/G418 resistance marker for direct selection of trans-

formants in Escherichia coli and different yeast species. Yeast 27: 189-

195

35. Mattanovich D, Graf A, Stadlmann J, Dragosits M, Redl A, Maurer M,

Kleinheinz M, Sauer M, Altmann F, Gasser B (2009) Genome, secre-

tome and glucose transport highlight unique features of the protein

production host Pichia pastoris. Microb Cell Fact 8: 29-41

36. Raemaekers RJM, de Muro L, Gatehouse JA, Fordham-Skelton AP

(1999) Functional phytohemagglutinin (PHA) and Galanthus niva-

lis agglutinin (GNA) expressed in Pichia pastoris Correct N-terminal

processing and secretion of heterologous proteins expressed using the

PHA-E signal peptide. Eur J Biochem 265: 394-403

37. Kato S, Ishibashi M, Daisuke T, Tokunaga H, Tokunaga M (2001) Ef-

ficient expression, purification and characterization of mouse salivary

α-amylase secreted from methylotrophic yeast, Pichia pastoris. Yeast

18: 643-655

38. Khasa YP, Conrad S, Sengul M, Plautz S, Meagher MM, Inan M (2011)

Isolation of Pichia pastoris PIR genes and their utilization for cell surfa-

ce display and recombinant protein secretion. Yeast 28: 213-226

39. Jahic M, Gustavsson M, Jansen A-K, Martinelle M, Enfors S-O (2003)

Analysis and control of proteolysis of a fusion protein in Pichia pastoris

fed-batch processes. J Biotechnol 102: 45-53

40. Choi B-K, Bobrowicz P, Davidson RC, Hamilton SH, Kung DH, Li H,

Miele RG, Nett JH, Wildt S, Gerngross TU (2003) Use of combinatorial

genetic libraries to humanize N-linked glycosylation in the yeast Pichia

pastoris. Proc Natl Acad Sci USA 100: 5022-5027

41. Hamilton SR, Bobrowicz P, Bobrowicz B, Davidson RC, Li H, Mitchell

T, Nett JH, Rausch S, Stadheim TA, Wischnewski H, Wildt S, Gern-

gross TU (2003) Production of complex human glycoproteins in yeast.

Science 301: 1244-1246

42. Hamilton SR, Davidson RC, Sethuraman N, Nett JH, Jiang Y, Rios S,

Bobrowicz P, Stadheim TA, Li H, Choi B-K, Hopkins D, Wischnewski

H, Roser J, Mitchell T, Strawbridge RR, Hoopes J, Wildt S, Gerngross

TU (2006) Humanization of yeast to produce complex terminally sia-

lylated glycoproteins. Science 313: 1441-1443

43. Rotticci-Mulder JC, Gustavsson M, Holmquist M, Hult K, Martinelle

M (2001) Expression in Pichia pastoris of Candida antarctica lipase B and

lipase B fused to a cellulose-binding domain. Protein Expression Purif

21: 386-392

44. Xiong A-S, Yao Q-H, Peng R-H, Han P-L, Cheng Z-M, Li Y (2005) High

level expression of a recombinant acid phytase gene in Pichia pastoris. J

Appl Microbiol 98: 418-428

background image

Postępy Biochemii 59 (3) 2013

321

Pichia pastoris as an expression system for recombinant protein production

Anna Ciarkowska

*

, Anna Jakubowska

Department of Biochemistry, Nicolaus Copernicus University, 1 Lwowska St., 87-100 Toruń, Poland

*

e-mail: annaciar@doktorant.umk.pl

Key words: recombinant protein production, expression system, methylotrophic yeast, Pichia pastoris

ABSTRACT

Pichia pastoris has become increasingly popular as a host for recombinant protein production in recent years. P. pastoris is more cost effec-

tive and allows achieving higher expression levels than insect and mammalian cells. It also offers some significant advantages over

E. coli

expression systems, such as avoiding problems with proper protein folding. Also,

P. pastoris as an eukaryotic organism can carry out post-

translational modifications of produced proteins. Additionally,

P. pastoris can produce high levels of recombinant proteins in extracellular

medium which simplifies protein purification. Having many advantages over other expression systems makes

P. pastoris an organism of

choice for industrial protein production.

45. Wolff AM, Hansen OC, Poulsen U, Madrid S, Stougaard P (2001) Opti-

mization of the production of Chondrus crispus hexose oxidase in Pichia

pastoris. Protein Expression Purif 22: 189-199

46. Nourizad N, Ehn M, Gharizadeh B, Hober S, Nyrén P (2003) Methy-

lotrophic yeast Pichia pastoris as a host for production of ATP-dipho-

sphohydrolase (apyrase) from potato tubers (Solanum tuberosum). Pro-

tein Expression Purif 27: 229-237

47. Mochizuki S, Hamato N, Hirose M, Miyano K, Ohtani W, Kameyama

S, Kuwae S, Tokuyama T, Ohi H (2001) Expression and characteriza-

tion of recombinant human antithrombin III in Pichia pastoris. Protein

Expression Purif 23: 55-65

48. Goodrick JC, Xu M, Finnegan R, Schilling BM, Schiavi S, Hoppe H,

Wan NC (2001) High-level expression and stabilization of recombi-

nant human chitinase produced in a continuous constitutive Pichia

pastoris expression system. Biotechnol Bioeng 74: 492-497

49. Files D, Ogawa M, Scaman CH, Baldwin SA (2001) A Pichia pastoris fer-

mentation process for producing high-levels of recombinant human

cystatin-C. Enzyme Microb Technol 29: 335-340

50. Nokelainen M, Tu H, Vuorela A, Notbohm H, Kivirikko KI, Myllyhar-

ju J (2001) High-level production of human type I collagen in the yeast

Pichia pastoris. Yeast 18: 797-806


Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
320 321 id 35283 Nieznany
314 315 id 35089 Nieznany
315 id 35095 Nieznany (2)
Abolicja podatkowa id 50334 Nieznany (2)
4 LIDER MENEDZER id 37733 Nieznany (2)
katechezy MB id 233498 Nieznany
metro sciaga id 296943 Nieznany
perf id 354744 Nieznany
interbase id 92028 Nieznany
Mbaku id 289860 Nieznany
Probiotyki antybiotyki id 66316 Nieznany
miedziowanie cz 2 id 113259 Nieznany
LTC1729 id 273494 Nieznany
D11B7AOver0400 id 130434 Nieznany
analiza ryzyka bio id 61320 Nieznany
pedagogika ogolna id 353595 Nieznany
Misc3 id 302777 Nieznany

więcej podobnych podstron