Postępy Biochemii 59 (3) 2013
315
Anna Ciarkowska
*
Anna Jakubowska
Zakład Biochemii, Wydział Biologii i Ochrony
Środowiska, Uniwersytet Mikołaja Kopernika,
Toruń
*
Zakład Biochemii, Wydział Biologii i Ochrony
Środowiska, Uniwersytet Mikołaja Kopernika,
ul. Lwowska 1, 87-100 Toruń; tel.: (56) 61 14
542, e-mail: annaciar@doktorant.umk.pl
Artykuł otrzymano 7 lutego 2013 r.
Artykuł zaakceptowano 2 kwietnia 2013 r.
Słowa kluczowe: produkcja białek rekombino-
wanych, system ekspresyjny, drożdże metylo-
troficzne, Pichia pastoris
Wykaz skrótów: AOX — oksydaza alkoholo-
wa; DAS — syntaza dihydroksyacetonu; GAP
— dehydrogenaza aldehydu 3-fosfogliceryno-
wego; FLD1 — dehydrogenaza formaldehydu
zależna od glutationu; PEX8 — białko macie-
rzy peroksysomalnej; PHO1 — kwaśna fosfa-
taza; SUC2 — inwertaza; PHA-E — fitohema-
glutynina
Pichia pastoris jako system ekspresyjny do produkcji białek rekombinowanych
STRESZCZENIE
P
ichia pastoris cieszy się coraz większą popularnością jako system ekspresyjny. Niski
koszt hodowli oraz wysoka wydajność czynią ten gatunek drożdży atrakcyjną alternaty-
wą dla systemów wykorzystujących komórki wyższych eukariontów. Wybierając
P. pastoris
omija się też wiele problemów napotykanych w przypadku zastosowania systemów bakte-
ryjnych — nieprawidłowe zwijanie białek oraz brak modyfikacji potranslacyjnych. Dostęp-
ność bardzo silnych promotorów, zwłaszcza promotora
AOX1, a także możliwość sekrecji
rekombinowanego białka do medium hodowlanego również przyczyniają się do ogromnej
popularności
P. pastoris. Wiele zalet tego systemu umożliwia jego zastosowanie nie tylko
do produkcji białek w celach badawczych, ale także na większą skalę do zastosowań prze-
mysłowych.
WPROWADZENIE
W latach 70. XX wieku większość komercyjnie dostępnych białek pozyski-
wana była w tradycyjny sposób poprzez izolację z tkanek roślinnych lub zwie-
rzęcych. Metodą tą nie można było uzyskać dużych ilości białek, stąd też ich
dostępność była niska, a ceny wysokie. Dopiero rozwój inżynierii genetycznej
umożliwił produkcję białek rekombinowanych w znaczących ilościach. Wyko-
rzystuje się w tym celu różnego rodzaju systemy ekspresyjne, do których należą
bakterie, drożdże, grzyby pleśniowe, komórki owadzie oraz komórki ssaków i
roślin [1-3]. Wady i zalety wybranych systemów ekspresyjnych przedstawiono
w tabeli 1.
Tabela 1. Zalety i wady wybranych systemów ekspresyjnych używanych do
produkcji białek rekombinowanych na podstawie [1-3].
Zalety
Wady
Bakterie
niski koszt
łatwość hodowli oraz
manipulacji potranslacyjnych
duża wydajność
hodowla nie jest praco- i
czasochłonna
trudności w pozyskiwaniu
białek zawierających
mostki dwusiarczkowe
brak modyfikacji potranslacyjnych,
w tym glikozylacji
białka wytwarzane w nieaktywnej
formie w postaci ciał inkluzyjnych
możliwe zanieczyszczenia
endotoksynami
Drożdże
niski koszt
mogą być hodowane do
dużych gęstości
łatwość manipulacji genetycznych
przeprowadzają modyfikacje
potranslacyjne
duża wydajność
możliwa sekrecja białka do
medium hodowlanego
prawidłowe zwijanie białek
białka glikozylowane w inny
sposób niż w komórkach ssaczych
Komórki
owadów
przeprowadzają modyfikacje
potranslacyjnych
duża wydajność
możliwa sekrecja białka do
medium hodowlanego
prawidłowe zwijanie białek
jednoczesna ekspresja wielu genów
możliwość odkładania się białka
rekombinowanego w formie
nieaktywnych agregatów
stosunkowo wysoki koszt
Komórki
ssaków
przeprowadzają modyfikacje
potranslacyjne
sposób glikozylacji najbardziej
zbliżony do ludzkiego
prawidłowe zwijanie białek
możliwe zanieczyszczenia
wirusowym i onkogennym DNA
wysoki koszt
długotrwały proces produkcji
niska wydajność
316
www.postepybiochemii.pl
Wyjątkowość drożdży jako systemu ekspresyjnego
polega na tym, że łączą one zalety systemów prokario-
tycznych (niskie koszty, prostota, duża wydajność) i
eukariotycznych (przeprowadzanie modyfikacji potran-
slacyjnych, prawidłowe zwijanie białek) [4]. Największą
popularnością cieszą się obecnie dwa gatunki drożdży:
Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) oraz Pichia pastoris
(P. pastoris) [3,5].
DROŻDŻE METYLOTROFICZNE
W drożdżach metylotroficznych funkcjonuje specyficz-
ny szlak metabolizmu metanolu, pozwalający im wyko-
rzystywać ten związek jako źródło węgla. W pierwszym
etapie przemian metabolicznych metanolu związek ten
jest utleniany w obecności O
2
do formaldehydu z wydzie-
leniem nadtlenku wodoru przez oksydazę alkoholową
(AOX). Powstający w tej reakcji H
2
O
2
jest następnie usu-
wany przez katalazę. Formaldehyd może ulec utlenieniu
(szlak dysymilacji metanolu) lub kondensacji z ksylulozo-
-5-fosforanem (szlak asymilacji) w reakcji katalizowanej
przez syntazę dihydroksyacetonu (DAS). AOX, katalaza
oraz DAS zlokalizowane są w peroksysomach, gdzie za-
chodzi pierwszy etap metabolizmu metanolu. W drugim
etapie produkty reakcji kondensacji katalizowanej przez
DAS: dihydroksyaceton oraz aldehyd 3-fosfoglicerynowy
ulegają dalszym przemianom, które zachodzą w cytopla-
zmie [4].
P. pastoris posiada dwie endogenne kopie genu AOX:
AOX1 oraz AOX2. AOX1 odpowiada za powstawanie około
90% oksydazy alkoholowej w komórce P. pastoris, natomiast
AOX2 posiada słabszy promotor i odpowiada za powstawa-
nie jedynie 10% enzymu. Ekspresja obu genów ulega induk-
cji w obecności metanolu [7].
Wszystkie zidentyfikowane do tej pory szczepy drożdży
metylotroficznych należą do czterech rodzajów: Hansenula,
Pichia, Candida oraz Torulopsis [6].
Ze względu na metabolizm metanolu można wyróżnić
trzy fenotypy P. pastoris:
Mut
+
(ang. methanol utilization plus) — drożdże o tym
fenotypie posiadają w pełni funkcjonalne obie kopie genu
AOX i dzięki temu rosną na metanolu w takim samym tem-
pie jak typ dziki P. pastoris. Najczęściej stosowanym szcze-
pem o takim fenotypie jest GS115 [6,8].
Mut
s
(ang. slow methanol utilization) — szczepy o ta-
kim fenotypie posiadają niefunkcjonalny gen AOX1. Z
tego powodu metabolizm metanolu opiera się jedynie na
AOX2, której gen posiada słabszy promotor i zapewnia
niższy poziom ekspresji. Dlatego też komórki P. pastoris
o fenotypie Mut
s
rosną na metanolu wolniej niż drożdże
o fenotypie Mut
+
. Często konieczne jest wręcz zastosowa-
nie dodatkowych źródeł węgla, takich jak sorbitol, man-
nitol, trehaloza lub alanina — warunkiem jest jednak aby
żadne z dodatkowych źródeł węgla nie powodowało re-
presji promotora AOX. Przykładem szczepu P. pastoris o
fenotypie Mut
s
jest KM71 [6,9].
Mut
-
(ang. methanol utilization minus) — fenotyp ten cha-
rakteryzuje się brakiem funkcjonalnych kopii obu genów
AOX i związaną z tym niemożnością wzrostu na metanolu.
Przykładowym szczepem P. pastoris o fenotypie Mut
-
jest
MC100-3 [6,10].
P. pastoris, jako przedstawiciela drożdży metylotroficz-
nych, charakteryzuje wiele zalet zapewniających przewagę
nad S. cerevisiae, gdy w grę wchodzi wybór systemu eks-
presyjnego do produkcji białek rekombinowanych. Wy-
bierając P. pastoris przede wszystkim omija się problem
hiperglikozylacji białka rekombinowanego, który pojawia
się w tym gatunku zdecydowanie rzadziej w porównaniu
z S. cerevisiae. Istnieją jednak pewne wyjątki, np. nadpro-
dukowana w P. pastoris endoglukanaza II z Trichoderma re-
esei, czy HIV gp 120, które ulegają hiperglikozylacji [11,12].
Glikoproteiny syntetyzowane w tym systemie posiadają
mannozowy łańcuch oligosacharydu złożony z maksymal-
nie 20 jednostek, podczas gdy w przypadku S. cerevisiae
długość łańcucha cukrowego wynosi aż 50–150 jednostek
mannozowych. Ponadto, P. pastoris nie posiada enzymu
α-1,3-mannozylotransferazy, który u S. cerevisiae przyłą-
cza na końcu oligosacharydu mannozę za pośrednictwem
wiązania α-1,3-glikozydowego, co jest niepożądane w przy-
padku białek terapeutycznych, gdyż wywołuje intensywną
odpowiedź immunologiczną u pacjentów, którym podaje
się taką glikoproteinę. P. pastoris zapewnia również dużo
większą niż S. cerevisiae wydajność produkcji białka rekom-
binowanego, jak też umożliwia jego sekrecję do medium ho-
dowlanego. Zdolność P. pastoris do wzrostu na pożywkach
zawierających wysokie, zabójcze dla większości innych mi-
kroorganizmów, stężenia metanolu zapobiega zakażeniu
hodowli [1]. W przeciwieństwie do S. cerevisiae, P. pastoris
preferuje procesy tlenowe niż fermentacyjne, dzięki czemu
w hodowli nie powstają duże ilości etanolu i kwasu octo-
wego, które ze względu na toksyczny wpływ na komórki
powodowałyby zahamowanie wzrostu hodowli [13].
PRODUKCJA BIAŁEK REKOMBINOWANYCH
W
P. PASTORIS
Działania prowadzące do uzyskania białek rekombino-
wanych w P. pastoris, podobnie jak i w innych systemach
ekspresyjnych, możemy podzielić na kilka podstawowych
etapów. Pierwszym krokiem jest wklonowanie transgenu
do wektora ekspresyjnego. Następnie przeprowadzamy
transformację komórek gospodarza oraz selekcję transfor-
mantów, do których udało się wprowadzić wektor ekspre-
syjny. Transformowane komórki hoduje się w określonych
warunkach, po czym izoluje się z nich i oczyszcza białko
rekombinowane [14].
P. pastoris transformuje się stosując fuzję sferoplastów,
elektroporację bądź koprecypitację z chlorkiem litu,
chlorkiem wapnia lub glikolem polietylenowym [15]. W
przeciwieństwie do S. cerevisiae, które można transformo-
wać za pomocą wektorów integracyjnych i episomalnych,
do transformacji P. pastoris stosuje się prawie wyłącznie
wektory integracyjne. Wynika to z faktu, że w komór-
kach P. pastoris nie udało się zidentyfikować naturalnie
występujących plazmidów episomalnych, takich jak 2μ w
Postępy Biochemii 59 (3) 2013
317
S.
cerevisiae [16]. Ponadto, wszystkie stosowane wektory
ekspresyjne zaliczają się do wektorów wahadłowych —
mogą namnażać się nie tylko w komórkach P. pastoris, ale
również w E. coli [17]. Typowe elementy wchodzące w
skład takiego wektora to: promotor, polilinker umożli-
wiający wklonowanie transgenu, sygnał terminacji trans-
krypcji, bakteryjne miejsce inicjacji replikacji, markery
selekcyjne dla P. pastoris i E. coli oraz opcjonalnie sygnał
sekrecyjny [15,18].
Genetycznie stabilne transformanty P. pastoris uzyskuje
się w wyniku integracji kasety ekspresyjnej do chromoso-
mu w specyficznym locus [19]. Może do niej dojść w wyniku
rekombinacji homologicznej poprzez wstawienie lub zastą-
pienie genu. W tym drugim przypadku często doprowadza
się do zastąpienia genu AOX1 transgenem wykorzystując w
tym celu plazmidy zawierające promotor AOX1 oraz frag-
ment sekwencji 3’-końcowej genu AOX1, uzyskane w ten
sposób transformanty charakteryzują się fenotypem Mut
S
.
Transformanty powstałe w wyniku zastąpienia genu są
zwykle bardziej stabilne genetycznie, ale również jednoko-
pijne [10]. Liczba kopii wprowadzonego genu wpływa na
wydajność produkcji rekombinowanego białka, zwykle im
większa ilość kopii tym więcej białka powstaje [6]. Ze wzglę-
du na brak stabilnych wektorów episomalnych dla P. pasto-
ris rzadko przeprowadza się transformację tych drożdży za
ich pomocą. Plazmidy episomalne replikują niezależnie od
chromosomu i mogą zostać utracone przez komórki w wy-
niku kolejnych podziałów. Z tego powodu transformanty
niosące plazmidy episomalne muszą być poddawane sta-
łej selekcji, co umożliwia wyeliminowanie komórek, które
utraciły transgen razem z wektorem, a zachowanie jedynie
transformowanej populacji. Ponadto plazmidy episomalne
występują zwykle w niewielkiej ilości kopii, a jak już wcze-
śniej wspomniano, niewielka ilość wprowadzonych kopii
transgenu może prowadzić do niskiej wydajności produkcji
białka [10,15].
Optymalne warunki hodowli P. pastoris w dużym stop-
niu zależą od wybranego szczepu oraz od właściwości wy-
twarzanego białka. Różnego rodzaju stres środowiskowy
lub metaboliczny może wpływać na produkcję białek re-
kombinowanych [20,21]. Czynniki środowiskowe takie jak
temperatura, niskie pH, wysoka osmotyczność oraz stres
oksydacyjny mogą powodować spadek wydajności wy-
twarzania białka rekombinowanego poprzez negatywny
wpływ na proces zwijania się białek oraz ich sekrecję [20].
Optymalna temperatura dla hodowli P. pastoris w celu
produkcji białka rekombinowanego wynosi 30°C. Przy
temperaturze powyżej 32°C obserwuje się zahamowanie
produkcji białka oraz gwałtowny spadek tempa wzrostu
hodowli [22]. Natomiast obniżenie temperatury hodowli do
20–25°C wpływa korzystnie na proces zwijania się białka
i poprawia wydajność jego produkcji [20]. W wielu przy-
padkach niższa temperatura hodowli prowadzi również do
zmniejszenia stresu oksydacyjnego wywołanego wzrostem
w obecności wysokich stężeń metanolu. Stres oksydacyjny
można również redukować poprzez stosowanie antyoksy-
dantów, np. kwasu askorbinowego lub równoległą ekspre-
sję enzymów antyoksydacyjnych, takich jak dysmutaza po-
nadtlenkowa [23,24].
P. pastoris jest zdolna do wzrostu w szerokim zakresie
pH (3,0–7,0), jednak hodowle zwykle prowadzi się w pH o
wartości 5,0–6,0 [22]. Przy zbyt niskim pH medium hodow-
lanego P. pastoris musi zużywać więcej energii na utrzyma-
nie stałego fizjologicznego poziomu pH wewnątrz komórki.
Prowadzi to do spowolnienia wzrostu hodowli oraz spadku
wydajności sekrecji w wyniku wzmocnienia bariery stano-
wionej przez ścianę komórkową [20].
Istotną zaletą P. pastoris jako systemu ekspresyjnego jest
łatwość modyfikacji skali hodowli. Chociaż P. pastoris jest
w stanie w sposób wydajny wytwarzać białka w hodowli
stacjonarnej, w przypadku hodowli w fermentorze uzy-
skuje się zwykle dużo lepsze rezultaty. Wynika to przede
wszystkim z tego, że fermentor umożliwia bardzo dokładną
kontrolę pH pożywki, natlenienia oraz tempa dostarczania
substratu, dzięki czemu P. pastoris może rosnąć do bardzo
dużych gęstości. System ten jest więc idealny do produkcji
białek na skalę przemysłową [17].
PROMOTORY
Wysoki poziom ekspresji obcego genu powoduje duże
obciążenie metaboliczne komórek. Zdarza się również, że
nagromadzenie produkowanego białka może wywierać
toksyczny wpływ na komórki gospodarza. Z tych powo-
dów zwykle stosuje się promotory indukowane, dzięki któ-
rym możemy rozpocząć syntezę białka rekombinowanego
dopiero wówczas, gdy hodowla osiągnie odpowiednią gę-
stość i w ten sposób zwiększyć wydajność produkcji [14].
Przykładem promotora indukowanego metanolem jest pro-
motor genu AOX1 z P. pastoris. Oksydaza alkoholowa utle-
nia metanol do formaldehydu wykorzystując do tego tlen
cząsteczkowy. Enzym ten wykazuje jednak niskie powino-
wactwo względem tlenu. Komórki P. pastoris kompensują to
wytwarzaniem bardzo dużych ilości AOX1 (do 30% całko-
witego białka komórki) w wyniku indukcji metanolem [25].
Ze względu na dużą siłę oraz ścisłą regulację promotora
AOX1 jest on bardzo często wykorzystywany do produkcji
białek rekombinowanych w P. pastoris [6].
Glukoza, etanol oraz glicerol są silnymi represorami pro-
motora AOX1 [4]. W pierwszym etapie hodowli P. pastoris
stosuje się pożywki, które jako źródło węgla zawierają je-
den z represorów promotora AOX1: glukozę lub glicerol.
Umożliwia to nagromadzenie biomasy przed rozpoczęciem
indukcji komórek do produkcji białka rekombinowanego.
Częściej stosuje się glicerol, ponieważ w przeciwieństwie
do glukozy nie jest on substratem do procesów fermenta-
cyjnych. Aby doprowadzić do indukcji promotora AOX1
konieczne jest zastąpienie pierwotnego źródła węgla me-
tanolem. Zmiana pożywki na zawierającą metanol jako je-
dyne źródło węgla powoduje ponad 1000-krotną indukcję
promotora AOX1 [13]. W przypadku białek wewnątrzko-
mórkowych ich najwyższy poziom obserwuje się w ciągu
24 godzin od indukcji metanolem, natomiast w przypadku
białek ulegających sekrecji, w ciągu 24–100 godzin od in-
dukcji [17].
Do produkcji białek z zastosowaniem promotora AOX1
można wykorzystywać szczepy P. pastoris o wszystkich
318
www.postepybiochemii.pl
trzech typach metabolizmu metanolu. Często jednak ko-
rzystniejsze okazuje się wybranie szczepu Mut
-
lub Mut
S
, co
zapewnia mniejsze zużycie metanolu. W tych przypadkach
w czasie indukcji stosuje się pożywki zawierające dodatko-
we źródło węgla nie będące represorem promotora AOX1:
sorbitol, mannitol, trehalozę lub alaninę [19,26].
Z wykorzystaniem promotora AOX1 wiąże się kilka
istotnych problemów wynikających z konieczności stoso-
wania dużych ilości metanolu. Zbyt wysokie stężenie meta-
nolu może toksycznie wpływać na komórki P. pastoris, dla-
tego też konieczne jest stałe monitorowanie jego poziomu w
hodowli. Innym problemem utrudniającym wykorzystanie
tego promotora do produkcji białek rekombinowanych na
skalę przemysłową jest to, że metanol jest substancją łatwo-
palną i przechowywanie jego dużych ilości prowadzi do
zagrożenia pożarowego. Ponadto, wymagane jest wykorzy-
stanie dwóch różnych źródeł węgla, których wymiana musi
nastąpić w ściśle określonym momencie, a w przypadku
hodowli na skalę laboratoryjną, bez wykorzystania fermen-
tora, bardzo trudne jest dokładne kontrolowanie warunków
indukcji [6,17].
Ze względu na wyżej wymienione trudności związane
ze stosowaniem promotora AOX1 poszukiwano alterna-
tywnych promotorów, które umożliwiłyby równie wy-
dajną produkcję białek rekombinowanych w P. pastoris.
Wykorzystanie promotora genu dehydrogenazy aldehydu
3-fosfoglicerynowego (GAP) z P. pastoris zapewnia wysoki
konstytutywny poziom ekspresji transgenu. W niektórych
przypadkach, np. dla β-laktamazy, promotor GAP umożli-
wia uzyskanie większej ilości białka rekombinowanego niż
promotor AOX1. Ponieważ promotor GAP jest promotorem
konstytutywnym, nie nadaje się do produkcji białek wywie-
rających toksyczny wpływ na komórkę [27].
Promotor genu dehydrogenazy formaldehydu zależnej
od glutationu (FLD1) z P. pastoris zapewnia podobny po-
ziom ekspresji, co promotor AOX1. Indukcję promotora
FLD1 można przeprowadzać na dwa sposoby: metanolem
lub metyloaminą [28,29].
Bardzo wysoki poziom ekspresji zapewniany przez pro-
motory AOX1, FLD1 i GAP może wywierać toksyczny efekt
na komórki P. pastoris, a także powodować nadmierne ob-
ciążenie metaboliczne komórki, przez co duże ilości białka
rekombinowanego nie posiadają odpowiednich modyfika-
cji potranslacyjnych i są nieprawidłowo sfałdowane [14]. Z
tego powodu konieczne było znalezienie promotorów po-
wodujących niższy poziom ekspresji.
Promotor genu białka macierzy peroksysomalnej PEX8
zapewnia konstytutywną ekspresję transgenu na bardzo ni-
skim poziomie przy zastosowaniu glukozy jako źródła wę-
gla oraz umiarkowaną indukcję w wyniku dodania metano-
lu. Z kolei promotor genu YPT1 kodującego zaangażowaną
w wydzielanie GTPazę umożliwia konstytutywną ekspresję
transgenu na niskim poziomie przy hodowli na pożywkach
zawierających jako źródło węgla glukozę, metanol lub man-
nitol [30].
Poznanie sekwencji genomowej P.pastoris umożliwiło
identyfikację wszystkich genów zaangażowanych w meta-
bolizm metanolu oraz ich promotorów, które w przyszłości
mogą znaleźć zastosowanie przy produkcji białek rekombi-
nowanych [31].
MARKERY SELEKCYJNE
Geny markerowe można podzielić na dwie grupy: mar-
kery auksotroficzne oraz nadające oporność na antybiotyk
[32]. Większość szczepów ekspresyjnych P. pastoris jest de-
fektywna w zakresie jednego lub kilku genów odpowie-
dzialnych za biosyntezę określonych związków. Szczepy
te nie są w stanie rosnąć na pożywkach bez suplementa-
cji danym związkiem, chyba że zostaną transformowane
wektorem niosącym funkcjonalny gen szlaku biosyntezy.
Do najpowszechniej stosowanych genów markerowych
z tej grupy należą geny szlaków syntezy aminokwasów i
nukleotydów: HIS4, ARG4, ADE1 oraz URA3 [13,16]. Kilka
lat temu udało się skonstruować auksotroficzne szczepy P.
pastoris, umożliwiające selekcję transformantów na pod-
stawie obecności genów ARG1, ARG2, ARG3, HIS1, HIS2,
HIS5 lub HIS6 [33]. Poza markerami auksotroficznymi
stosuje się również geny oporności na antybiotyki: gen Sh
ble ze Streptoalloteichus hindustanus nadający oporność na
zeocynę oraz gen oporności na G418 [34]. W celu selekcji
transformantów wielokopijnych często stosuje się kombi-
nację dwóch genów markerowych: wstępnej selekcji do-
konuje się na podstawie obecności genu HIS4, a następnie
wyodrębnia się transformaty oporne na wysokie stężenia
G418 [10].
SEKRECJA BIAŁEK REKOMBINOWANYCH
Dołączenie sygnału sekrecji do białka rekombinowanego
prowadzi do jego wydzielania z komórki, co w znacznym
stopniu ułatwia jego oczyszczanie. Bardzo ważną zaletą
P. pastoris jest to, że niewielka ilość jej natywnych białek
ulega sekrecji, są to głównie białka pełniące funkcje poza-
komórkowe lub wchodzące w skład ściany komórkowej
[6,35]. Dzięki temu białko rekombinowane może stanowić
nawet ponad 80% całkowitego białka w medium hodowla-
nym [15].
Najczęściej stosowanym sygnałem sekrecyjnym jest se-
kwencja liderowa czynnika koniugacyjnego α-MF z S. ce-
revisiae [17]. Wykorzystuje się również sekwencje sygnalne
kwaśnej fosfatazy z P. pastoris (PHO1), inwertazy (SUC2), fi-
tohemaglutyniny (PHA-E) z Phaseolus vulgaris, 128kDa biał-
ka pGKL oraz białka PIR1 z P. pastoris [15,36-38]. Możliwe
jest również zastosowanie natywnego sygnału sekrecji biał-
ka rekombinowanego, jeżeli posiada ono taką sekwencję.
Wydajność sekrecji zależy nie tylko od zastosowanego
peptydu sygnalnego, ale również od struktury produko-
wanego białka [13]. Białka, które naturalnie nie posiadają
sygnału sekrecyjnego lepiej jest wytwarzać wewnątrzko-
mórkowo, aby uniknąć nieprawidłowej glikozylacji i braku
pewnych modyfikacji potranslacyjnych [10].
Postępy Biochemii 59 (3) 2013
319
TRUDNOŚCI ZWIĄZANE Z PRODUKCJĄ BIAŁEK
REKOMBINOWANYCH W
P. PASTORIS
Białka rekombinowane wydzielane z komórki mogą ule-
gać w medium hodowlanym degradacji proteolitycznej w
wyniku aktywności proteaz zewnątrzkomórkowych oraz
uwolnionych w wyniku lizy komórek proteaz wewnątrzko-
mórkowych. Proteoliza powoduje zmniejszenie wydajności
produkcji białka rekombinowanego z powodu jego degra-
dacji. Może również prowadzić do spadku aktywności wy-
twarzanego białka w wyniku jego skrócenia [6].
Istnieje kilka metod zmniejszania stopnia proteolizy biał-
ka rekombinowanego. Obniżenie temperatury hodowli lub
stosowanie pożywek o pH w zakresie 3,0–6,0 powoduje
spadek aktywności enzymów proteolitycznych [17,39]. Sta-
bilność białka rekombinowanego można również zwiększyć
dodając do pożywki suplementy bogate w aminokwasy
(np. pepton), które pełnią rolę alternatywnych substratów
dla proteaz oraz hamują ich indukcję powodowaną ogra-
niczonym dostępem azotu [6]. W celu zmniejszenia stopnia
proteolizy produkowanego białka stosuje się także szczepy
P. pastoris pozbawione niektórych proteaz. Gen PEP4 ko-
duje wakuolarną proteinazę A, która odpowiedzialna jest
za aktywację innych proteaz wakuolarnych, w tym karbok-
sypeptydazy Y oraz proteinazy B (kodowanej przez gen
PRB1). Mutanty pep4 (szczep SMD1168) wykazują wyraź-
ny spadek lub całkowity brak aktywności proteinazy A i
karboksypeptydazy Y oraz częściową redukcję aktywności
proteinazy B. Mutanty prb1 (szczep SMD1165) nie wyka-
zują aktywności proteinazy B, natomiast mutanty pep4prb1
(szczep SMD1163) charakteryzują się wyraźnym spadkiem
lub brakiem aktywności wszystkich trzech proteaz. Szcze-
py te są jednak mało żywotne, rosną powoli i trudno się je
transformuje, dlatego też należy je stosować jedynie wtedy,
gdy inne sposoby ograniczenia proteolizy okażą się mało
skuteczne [7,17].
Drożdże, podobnie jak komórki ssacze, przeprowadza-
ją dwa rodzaje glikozylacji białek: N- oraz O-glikozylację.
Może się jednak zdarzyć, że białka będą O-glikozylowane w
różnych miejscach, w zależności od organizmu,
w którym są produkowane. Przykładowo, ludz-
ka
midkina (czynnik wzrostu wiążący heparynę)
oraz czynnik IGF1 (insulinopodobny czynnik
wzrostu 1) nie są naturalnie
glikozylowane, jed-
nak rekombinowane białka uzyskane w P. pasto-
ris podlegały O-glikozylacji [10].
Wysokomannozowy typ N-glikozylacji białek
charakterystyczny dla drożdży powoduje, że pro-
dukowane w nich białka rekombinowane wywo-
łują u ludzi odpowiedź immunologiczną. Sposób
glikozylacji wpływa ponadto na okres półtrwania
białka oraz jego potencjał terapeutyczny. Z tego
powodu utrudnione jest zastosowanie białek re-
kombinowanych produkowanych w P. pastoris
do celów terapeutycznych. Rozwiązaniem tego
problemu jest konstruowanie szczepów P. pasto-
ris przeprowadzających glikozylację w sposób
charakterystyczny dla komórek ssaczych [40-42].
Szczepy takie muszą zostać pozbawione niektó-
rych enzymów, np. α-1,6-mannozylotransferazy,
wprowadza się do nich natomiast geny odpowiedzialne za
glikozylację typu ludzkiego [40]. Stosując szczep P. pastoris
o zmodyfikowanym typie glikozylacji udało się wyprodu-
kować funkcjonalną erytropoetynę szczura. Dalsze prace
nad modyfikacją szlaków glikozylacji P. pastoris mogą w
przyszłości umożliwić wytwarzanie białek terapeutycz-
nych w tym systemie ekspresyjnym zamiast w komórkach
ssaczych, co pozwoli zredukować koszty oraz czas trwania
produkcji, a także wyeliminować zanieczyszczenia wiruso-
we z preparatów [42].
PODSUMOWANIE
P. pastoris jest obecnie najczęściej używanym gatunkiem
drożdży do produkcji białek rekombinowanych [31]. Za
pomocą tego systemu otrzymuje się białka prokariotycz-
ne, między innymi toksyny bakteryjne wykorzystywane
do wytwarzania szczepionek, a także białka eukariotyczne
[25,32]. W P. pastoris produkuje się również białka błonowe,
ponad połowa wyprodukowanych do tej pory białek błono-
wych pochodzenia ssaczego została wytworzona przez P.
pastoris lub S. cerevisiae [5].
W tabeli 2 przedstawiono przykłady białek uzyskiwa-
nych w systemie ekspresyjnym P. pastoris. Pełna lista, pro-
wadzona przez laboratorium Jamesa Cregg’a dostępna jest
na stronie internetowej http://www.kgi.edu/documents/
faculty/James_Cregg/heterologous_proteins_expressed_
in_pichia_pastoris.pdf.
PIŚMIENNICTWO
1. Demain AL, Vaishnav P (2009) Production of recombinant proteins by
microbes and higher organisms. Biotechnol Adv 27: 297-306
2. Houdebine L-M (2009) Production of pharmaceutical proteins by
transgenic animals. Comp Immun Microbiol Infect Dis 32: 107-121
3. Nuc P, Nuc K (2006) Produkcja rekombinowanych białek w Escherichia
coli. Postepy Biochem 52: 448-456
4. Hartner FS, Glieder A (2006) Regulation of methanol utilization path-
way genes in yeast. Microb Cell Fact
5: 39-59
Tabela 2. Przykłady białek rekombinowanych produkowanych w P. pastoris
Białko
Pochodzenie
Piśmiennictwo
Botulina
Clostridium botulinum
[25]
Neurotoksyna tężcowa
Clostridium teteani
[25]
Dysmutaza ponadtlenkowa
Saccharomyces cerevisiae
[24]
Lipaza B
Candida antarctica
[43]
Fitaza
Aspergillus niger
[44]
Oksydaza heksozowa
Chondrus crispus
[45]
Hirudyna
Hirudo medicinalis
[23]
GFP
Aqueora victoria
[32]
Apiraza
Solanum tuberosum
[46]
Aglutynina
Galanthus nivalis
[36]
α-amylaza
mysz
[37]
Erytropoetyna
szczur
[42]
Antytrombina III
człowiek
[47]
Chitynaza
człowiek
[48]
Cystatyna C
człowiek
[49]
Kolagen typu I
człowiek
[50]
320
www.postepybiochemii.pl
5. Bawa Z, Bland CE, Bonander N, Bora N, Cartwright SP, Clare M, Con-
ner MT, Darby RAJ, Dilworth MV, Holmes WJ, Jamshad M, Routledge
SJ, Gross SR, Bill RM (2011) Understanding the yeast host cell response
to recombinant membrane protein production. Biochem Soc Trans 39:
719-723
6. Macauley-Patrick S, Fazenda ML, McNeil B, Harvey LM (2005) Het-
erologous protein production using the Pichia pastoris expression sys-
tem. Yeast 22: 249-270
7. Darby RAJ, Cartwright SP, Dilworth MV, Bill RM (2012) Which yeast
species shall I choose? Saccharomyces cerevisiae versus Pichia pastoris.
Methods Mol Biol 866: 11-23
8. Cregg JM, Cereghino JL, Shi J, Higgins DR (2000) Recombinant protein
expression in Pichia pastoris. Mol Biotechnol 16: 23-52
9. Inan M, Meagher MM (2001) Non-repressing carbon sources for al-
cohol oxidase (AOX1) promoter of Pichia pastoris. J Biosci Bioeng 92:
585-589
10. Daly R, Hearn MTW (2005) Expression of heterologous proteins in
Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and
production. J Mol Recognit 18: 119-138
11. Samanta S, Basu A, Halder UC, Sen SK (2012) Characterization of
Trichoderma reesei endoglucanase II expressed heterologously in Pichia
pastoris for better biofinishing and biostoning. J Microbiol 50: 518-525
12. Scorer CA, Buckholz RG, Clare JJ, Romanes MA (1997) The intracellu-
lar production and secretion of HIV-1 envelope protein in the methy-
lotrophic yeast Pichia pastoris. Gene 136: 111-119
13. Cereghino GPL, Cereghino JL, Ilgen C, Cregg JM (2002) Production of
recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris.
Curr Opin Biotechnol 13: 329-332
14. Cereghino GPL, Cregg JM (1999) Applications of yeast in biotechnol-
ogy: protein production and genetic analysis. Curr Opin Biotechnol
10: 422-427
15. Li P, Anumanthan A, Gao X-G, Ilangovan K, Suzara VV, Düzgüneş N,
Renugopalakrishnan V (2007) Expression of recombinant proteins in
Pichia pastoris. Appl Biochem Biotechnol 142: 105-124
16. Hahn-Hägerdal B, Karhumaa K, Larsson CU, Gorwa-Grauslund M,
Görgens J, van Zyl WH (2005) Role of cultivation media in the devel-
opment of yeast strains for large scale industrial use. Microb Cell Fact
4: 31-46
17. Cereghino JL, Cregg JM (2000) Heterologous protein expression in the
methylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS Microbiol Rev 24: 45-66
18. Cereghino GPL, Sunga AJ, Cereghino JL, Cregg JM (2001) Expression
of foreign genes in the yeast Pichia pastoris. Genet Eng 23: 157-169
19. Sreekrishna K, Brankamp RG, Kropp KE, Blankenship DT, Tsay J-T,
Smith PL, Wierschke JD, Subramaniam A, Birkenberger LA (1997)
Strategies for optimal synthesis and secretion of heterologous proteins
in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Gene 190: 55-62
20. Gasser B, Saloheimo M, Rinas U, Dragosits M, Rodríguez-Carmona E,
Baumann K, Giuliani M, Parrilli E, Branduardi P, Lang C, Porro D, Fer-
rer P, Tutino ML, Mattanovich D, Villaverde A (2008) Protein folding
and conformational stress in microbial cells producing recombinant
proteins: a host comparative overview. Microb Cell Fact 7: 11-28
21. Mattanovich D, Gasser B, Hohenblum H, Sauer M (2004) Stress in re-
combinant protein producing yeasts. J Biotechnol 113: 121-135
22. Cos O, Ramón R, Montesinos JL, Valero F (2006) Operational strate-
gies, monitoring and control of heterologous protein production in
the methylotrophic yeast Pichia pastoris under different promoters: a
review. Microb Cell Fact 5: 17-36
23. Xiao A, Zhou X, Zhou L, Zhang Y (2006) Improvement of cell viability
and hirudin production by ascorbic acid in Pichia pastoris fermenta-
tion. Appl Microbiol Biotechnol 72: 837-844
24. Li J-R, Yu P (2007) Expression of Cu, Zn-superoxide dismutase gene
from Saccharomyces cerevisiae in Pichia pastoris and its resistance to oxi-
dative stress. Appl Biochem Biotechnol 136: 127-139
25. Gurkan C, Ellar DJ (2005) Recombinant production of bacterial toxins
and their derivatives in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Mi-
crob Cell Fact 4: 33-40
26. Inan M, Meagher MM (2001) The effect of ethanol and acetate on pro-
tein expression in Pichia pastoris. J Biosci Bioeng 92: 337-341
27. Waterham HR, Digan ME, Koutz PJ, Lair SV, Cregg JM (1997) Isola-
tion of the Pichia pastoris glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
gene and regulation and use of its promoter. Gene 186: 37-44
28. Shen S, Sulter G, Jeffries TW, Cregg JM (1998) A strong nitrogen sour-
ce-regulated promoter for controlled expression of foreign genes in the
yeast Pichia pastoris. Gene 216: 93-102
29. Resina D, Serrano A, Valero F, Ferrer P (2004) Expression of a Rhizo-
pus oryzae lipase in Pichia pastoris under control of the nitrogen source-
-regulated formaldehyde dehydrogenase promoter. J Biotechnol 109:
103-113
30. Sears IB, O’Connor J, Rossanese OW, Glick BS (1998) A versatile set of
vectors for constitutive and regulated gene expression in Pichia pasto-
ris. Yeast 14: 783-790
31. De Schutter K, Lin Y-C, Tiels P, Van Hecke A, Glinka S, Weber-Leh-
mann J, Rouzé P, Van der Peer Y, Callewaert N (2009) Genome sequ-
ence of the recombinant protein production host Pichia pastoris. Nat
Biotechnol 27: 561-566
32. Papakonstantinou T, Harris S, Hearn MTW (2009) Expression of GFP
using Pichia pastoris vectors with zeocin or G-418 sulphate as the pri-
mary selectable marker. Yeast 26: 311-321
33. Nett JH, Hodel N, Raush S, Wildt S (2005) Cloning and disruption of
the Pichia pastoris ARG1, ARG2, ARG3, HIS1, HIS2, HIS5, HIS6 genes
and their use as auxotrophic markers. Yeast 22: 295-304
34. Agaphonov M, Romanova N, Choi E-S, Ter-Avanesyan M (2010) A
novel kanamycin/G418 resistance marker for direct selection of trans-
formants in Escherichia coli and different yeast species. Yeast 27: 189-
195
35. Mattanovich D, Graf A, Stadlmann J, Dragosits M, Redl A, Maurer M,
Kleinheinz M, Sauer M, Altmann F, Gasser B (2009) Genome, secre-
tome and glucose transport highlight unique features of the protein
production host Pichia pastoris. Microb Cell Fact 8: 29-41
36. Raemaekers RJM, de Muro L, Gatehouse JA, Fordham-Skelton AP
(1999) Functional phytohemagglutinin (PHA) and Galanthus niva-
lis agglutinin (GNA) expressed in Pichia pastoris Correct N-terminal
processing and secretion of heterologous proteins expressed using the
PHA-E signal peptide. Eur J Biochem 265: 394-403
37. Kato S, Ishibashi M, Daisuke T, Tokunaga H, Tokunaga M (2001) Ef-
ficient expression, purification and characterization of mouse salivary
α-amylase secreted from methylotrophic yeast, Pichia pastoris. Yeast
18: 643-655
38. Khasa YP, Conrad S, Sengul M, Plautz S, Meagher MM, Inan M (2011)
Isolation of Pichia pastoris PIR genes and their utilization for cell surfa-
ce display and recombinant protein secretion. Yeast 28: 213-226
39. Jahic M, Gustavsson M, Jansen A-K, Martinelle M, Enfors S-O (2003)
Analysis and control of proteolysis of a fusion protein in Pichia pastoris
fed-batch processes. J Biotechnol 102: 45-53
40. Choi B-K, Bobrowicz P, Davidson RC, Hamilton SH, Kung DH, Li H,
Miele RG, Nett JH, Wildt S, Gerngross TU (2003) Use of combinatorial
genetic libraries to humanize N-linked glycosylation in the yeast Pichia
pastoris. Proc Natl Acad Sci USA 100: 5022-5027
41. Hamilton SR, Bobrowicz P, Bobrowicz B, Davidson RC, Li H, Mitchell
T, Nett JH, Rausch S, Stadheim TA, Wischnewski H, Wildt S, Gern-
gross TU (2003) Production of complex human glycoproteins in yeast.
Science 301: 1244-1246
42. Hamilton SR, Davidson RC, Sethuraman N, Nett JH, Jiang Y, Rios S,
Bobrowicz P, Stadheim TA, Li H, Choi B-K, Hopkins D, Wischnewski
H, Roser J, Mitchell T, Strawbridge RR, Hoopes J, Wildt S, Gerngross
TU (2006) Humanization of yeast to produce complex terminally sia-
lylated glycoproteins. Science 313: 1441-1443
43. Rotticci-Mulder JC, Gustavsson M, Holmquist M, Hult K, Martinelle
M (2001) Expression in Pichia pastoris of Candida antarctica lipase B and
lipase B fused to a cellulose-binding domain. Protein Expression Purif
21: 386-392
44. Xiong A-S, Yao Q-H, Peng R-H, Han P-L, Cheng Z-M, Li Y (2005) High
level expression of a recombinant acid phytase gene in Pichia pastoris. J
Appl Microbiol 98: 418-428
Postępy Biochemii 59 (3) 2013
321
Pichia pastoris as an expression system for recombinant protein production
Anna Ciarkowska
*
, Anna Jakubowska
Department of Biochemistry, Nicolaus Copernicus University, 1 Lwowska St., 87-100 Toruń, Poland
*
e-mail: annaciar@doktorant.umk.pl
Key words: recombinant protein production, expression system, methylotrophic yeast, Pichia pastoris
ABSTRACT
Pichia pastoris has become increasingly popular as a host for recombinant protein production in recent years. P. pastoris is more cost effec-
tive and allows achieving higher expression levels than insect and mammalian cells. It also offers some significant advantages over
E. coli
expression systems, such as avoiding problems with proper protein folding. Also,
P. pastoris as an eukaryotic organism can carry out post-
translational modifications of produced proteins. Additionally,
P. pastoris can produce high levels of recombinant proteins in extracellular
medium which simplifies protein purification. Having many advantages over other expression systems makes
P. pastoris an organism of
choice for industrial protein production.
45. Wolff AM, Hansen OC, Poulsen U, Madrid S, Stougaard P (2001) Opti-
mization of the production of Chondrus crispus hexose oxidase in Pichia
pastoris. Protein Expression Purif 22: 189-199
46. Nourizad N, Ehn M, Gharizadeh B, Hober S, Nyrén P (2003) Methy-
lotrophic yeast Pichia pastoris as a host for production of ATP-dipho-
sphohydrolase (apyrase) from potato tubers (Solanum tuberosum). Pro-
tein Expression Purif 27: 229-237
47. Mochizuki S, Hamato N, Hirose M, Miyano K, Ohtani W, Kameyama
S, Kuwae S, Tokuyama T, Ohi H (2001) Expression and characteriza-
tion of recombinant human antithrombin III in Pichia pastoris. Protein
Expression Purif 23: 55-65
48. Goodrick JC, Xu M, Finnegan R, Schilling BM, Schiavi S, Hoppe H,
Wan NC (2001) High-level expression and stabilization of recombi-
nant human chitinase produced in a continuous constitutive Pichia
pastoris expression system. Biotechnol Bioeng 74: 492-497
49. Files D, Ogawa M, Scaman CH, Baldwin SA (2001) A Pichia pastoris fer-
mentation process for producing high-levels of recombinant human
cystatin-C. Enzyme Microb Technol 29: 335-340
50. Nokelainen M, Tu H, Vuorela A, Notbohm H, Kivirikko KI, Myllyhar-
ju J (2001) High-level production of human type I collagen in the yeast
Pichia pastoris. Yeast 18: 797-806