1

Ćwiczenie 1: Biotechnologia żywności

Temat: Izolacja, oczyszczanie oraz detekcja genomowego DNA w żywności.

Cześć A

Izolacja i oczyszczanie kwasów nukleinowych jest pierwszym etapem większości procedur

stosowanych w biologii molekularnej, jak też we wszystkich technikach inżynierii genetycznej.

Podstawowym celem tego etapu prac jest uzyskanie czystego materiału, bez względu na źródło

jego pochodzenia, z przeznaczeniem na przeprowadzenie specyficznych analiz metodą

łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR), w celu wykrycia genetycznych modyfikacji (GM).

Jakość i czystość kwasów nukleinowych jest czynnikiem silnie wpływającym na wynik reakcji

PCR. Aby ograniczyć obecność inhibitorów reakcji PCR, należy użyć właściwą metodę izolacji

kwasów nukleinowych.

Istnieje wiele technik izolacji i oczyszczania kwasów nukleinowych. Wybór najwłaściwszej i

najbardziej odpowiedniej metody dla konkretnych wymagań zależy od:

• Analizowanego kwasu nukleinowego

• Organizmu z jakiego przeprowadzamy izolację kwasu nukleinowego

• Rodzaju materiału z jakiego przeprowadzamy izolację (rodzaj tkanki, organ, stopień

przetworzenia, itd.)

• Oczekiwanych rezultatów (plon, czystość, czas przeznaczony na oczyszczanie)

• Docelowego przeznaczenia materiału (PCR, klonowanie, znakowanie, blotowanie, Real Time-

PCR, synteza cDNA)

Izolacja kwasów nukleinowych z materiału biologicznego wymaga, przeprowadzenia lizy

komórek, inaktywacji komórkowych nukleaz oraz oddzielenia izolowanego kwasu

nukleinowego od pozostałości komórkowych. Typowe procedury lizy komórkowej składają się

z etapów zawierających:

• Mechaniczne uszkodzenia (np. ucieranie, liza hipotoniczna)

• Traktowanie chemiczne (np. liza detergentem, sole chaotropowe, redukcja tiolowa)

• Trawienie enzymatyczne (np. proteinaza K)

Procedura wykorzystywana na ćwiczeniach pozwala na szybką izolacje DNA ze świeżej i

przetworzonej żywności pochodzenia roślinnego, zwierzęcego i mieszanego. W trakcie izolacji

DNA próbka zostaje dokładnie rozdrobniona, a następnie pozostałości struktur tkankowych i

2

komórkowych są solubilizowane poprzez lizę w specjalnym buforze, który zapewnia

integralność i ilościowy odzysk DNA. Proteinaza K degraduje białka komórkowe, w tym białka

wiążące DNA i nukleazy. Dodanie specjalnego roztworu umożliwia precypitację organicznych i

nieorganicznych substancji, m.in.: białek, pozostałości komórkowych, inhibitorów

enzymatycznych. Następnie DNA zawarte w lizacie jest wiązane do minikolumny w obecności

buforu zawierającego sole chaotropowe i etanolu. Zanieczyszczenia związane do złoża są

skutecznie usuwane w trakcie dwóch etapów płukania.

Oznaczanie ilości DNA metodą spektrofotometryczną

Ilość DNA, RNA, oligonukleotydów, a nawet mononukleotydów może być mierzona

bezpośrednio w roztworze wodnym w formie rozcieńczonej lub nierozcieńczonej. Wykonuje się

to poprzez pomiar absorpcji w świetle ultrafioletowym Stężenie kwasów nukleinowych

mierzone jest poprzez porównanie pomiaru dla próby ślepej i adsorpcji przy długości fali 260

nm. Interferencja wynikająca z zanieczyszczeń próbki może być określana poprzez wyznaczenie

współczynnika A260/A280- Adsorpcja przy długości fali 280 nm jest typowa dla białek, tak

więc stosunek A260/A280 mówi o czystości analizowanej próbki. W przypadku czystego DNA

stosunek ten powinien wynosić około 1.8, podczas gdy dla czystego RNA wahać się powinien w

okolicach 2.0. Absorpcja przy długości fali 230 nm odzwierciedla zanieczyszczenia pochodzące

od węglowodanów, białek, fenoli, czy komponentów aromatycznych. W przypadku czystych

próbek stosunek A280/A230 powinien wynosić około 2,2.

Część praktyczna

Materiał badawczy: kukurydza, soja, pomidor, sos sojowy, płatki kukurydziane, ketchup,

pasztet sojowy.

Protokół

1. Dodać 40 µl buforu aktywacyjnego do minikolumny (nie wirować). Pozostawić w

temperaturze pokojowej do momentu naniesienia lizatu na minikolumnę.

Uwaga 1: Dodanie buforu aktywacyjnego centralnie na powierzchnię membran zapewnia

kompletne nasączenie membran buforem aktywacyjnym i uzyskanie maksymalnej wydajności

wiązania DNA.

Uwaga 2: Aktywację należy wykonać przed rozpoczęciem procedury izolacji DNA.

2. Homogenizacja materiału.

3

Rozdrobnić fragment materiału badawczego ręcznie przy użyciu moździerza. Następnie

przenieść (maksymalnie 300 mg) próbki do probówki typu Eppendorf i zawiesić w 750 µl

buforu do zawieszania próbki.

Uwaga 1: Procedura homogenizacji zależy od typu materiału. W niektórych przypadkach

homogenizacja nie jest potrzebna i wystarcza dokładne zawieszenie próbki w buforze do lizy

(np. mąka, pasztety, koncentraty, sosy, ketchup).

Uwaga 2: Zestaw pozwala na oczyszczenie DNA z maksymalnie 300 mg próbki. W przypadku

suchego, higroskopijnego materiału (np. mąka, płatki kukurydziane, rośliny suszone) należy

zmniejszyć wielkość próbki poniżej 100 mg, aby umożliwić kompletne zawieszenie próbki w

buforze do lizy.

Uwaga 3: W przypadku próbek płynnych (sos sojowy, mleko sojowe, itp.) umieścić 300 μl

próbki w probówce 2 ml typu Eppendorf.

3. Dodać 60 μl buforu litycznego i 10 μl Proteinazy K.

4. Wymieszać przez kilkukrotne odwrócenie probówki i inkubować 30 min w 65

o

C (podczas

inkubacji wymieszać dwukrotnie przez odwracanie).

5. Wirować przez 5 min z prędkością 14 000 rpm.

6. Przenieść 400 μl supernatantu do nowej probówki

Uwaga 1: W pewnych przypadkach materiał silnie chłonie bufor, co powoduje, że niemożliwe

jest wybranie znad osadu 400 µl supernatantu. Należy wówczas zmniejszyć wielkość

początkową próbki lub przenieść jak najwięcej supernatantu i dopełnić buforem do zawieszania

próbki do całkowitej objętości 400 μl.

7. Dodać 400 μl buforu precypitacyjnego. Worteksować przez 5 sekund i inkubować przez 5

min. w lodzie (0-4

o

C).

Uwaga 1: Bufor umożliwia precypitację organicznych i nieorganicznych substancji, m.in.:

białek, pozostałości komórkowych, inhibitorów enzymatycznych.

8. Wirować przez 1 min z prędkością 14000 rpm.

9. Przenieść 600 μl supernatantu do nowej probówki typu Eppendorf 2 ml

10. Dodać 600 μl buforu do solubilizacji.

11. Dodać 600 μl 96% etanolu i dokładnie wymieszać przez kilkukrotne odwrócenie probówki.

12. Zwirować przez kilka sekund z prędkością 12000 rpm.

13. Przenieść 600 μl supernatantu do minikolumny, znajdującej się w probówce odbierającej.

14. Wirować przez 30 sekund z prędkością 12 000 rpm.

15. Wyjąć minikolumnę, wylać przesącz i umieścić minikolumnę z powrotem w probówce

odbierającej.

16. Powtórzyć kroki 13-15 procedury izolacji DNA.

4

17. Przenieść pozostałość supernatantu do minikolumny, znajdującej się w probówce

odbierającej.

Wirować przez 1 min z prędkością 12 000 rpm celem przefiltrowania pozostałości lizatu przez

złoże.

Uwaga 1: W przypadku niecałkowitego przefiltrowania lizatu przez złoże wirowanie należy

kontynuować.

18. Wyjąć minikolumnę, wylać przesącz i umieścić minikolumnę z powrotem w probówce

odbierającej.

19. Dodać 500 μl buforu płuczącego do minikolumny i wirować przez 1 min z prędkością 12

000 rpm.

20. Wyjąć minikolumnę, wylać przesącz i umieścić minikolumnę z powrotem w probówce

odbierającej.

21. Dodać 500 μl buforu płuczącego do minikolumny i wirować przez 2 min z prędkością 12

000 rpm.

22. Minikolumnę umieścić w nowej probówce typu Eppendorf 1.5-2 ml. Dodać 50-100 μl

buforu elucyjnego (10 mM Tris-HCl, pH 8.5) ogrzanego do temperatury 70

o

C.

Uwaga 1: Dodanie buforu eluującego centralnie na powierzchnię membrany zapewnia

uzyskanie maksymalnej wydajności odzysku DNA. Należy unikać dotykania ścianek

minikolumn mikropipetą, aby nie przenosić śladów DNA pomiędzy kolejnymi minikolumnami.

23. Minikolumnę pozostawić na 5 min w temperaturze pokojowej.

24. Wirować minikolumnę przez 30 sekund z prędkością 12 000 rpm. Usunąć minikolumnę,

zamknąć probówkę. DNA jest gotowe do dalszych analiz/manipulacji, może być

przechowywane w 2÷8

o

C lub zamrożone w -20

o

C.

Po izolacji zmierzyć stężenie uzyskanego izolatu DNA na aparacie NanoDrop

®

(postępowanie przy pomiarze podobne jak w pkt B, wybieramy program do analizy kwasów

nukleinowych), określić jego czystość oraz ilość otrzymanego preparatu. Część próbki

wykorzystać do rozdziału elektroforetycznego DNA w celu oceny homogenności

uzyskanego preparatu kwasu nukleinowego.

Rozdział elektroforetyczny DNA

Bufor TAE 1 x stężony (roztwór roboczy)

Bufor o składzie: 40 mM Tris (pH 7,6), 20 mM kwas octowego, 1 mM EDTA

Żel agarozowy

5

Żel agarozowy sporządzano w stężeniu 1% dla rozdziału próbek po izolacji DNA. Odważyć 1,0

g agarozy do kolby stożkowej o pojemności 250 ml, zalać 100 ml buforu TAE 1x stężonego i

gotować w łaźni wodnej przez około 10 min do całkowitego rozpuszczenia agarozy. Po

ochłodzeniu wprowadzić 45 μl bromku etydyny.

Elektroforezę przeprowadzić w aparacie do elektroforezy poziomej (Cleaver Scientific Ltd.). Po

zmontowaniu foremki, wylać na nią wystudzony żel tak, aby uniknąć powstania pęcherzy

powietrza. Zamontować grzebień i pozostawić do zastygnięcia. Następnie grzebień usunąć,

foremkę z żelem umieścić w aparacie do elektroforezy i zalać buforem TAE 1 x stężonym.

Poziom buforu powinien sięgać nieco powyżej powierzchni żelu, około 1 cm. Do studzienek

wprowadzić za pomocą pipety próbki wraz z buforem obciążającym w ilości 3 μl buforu i 7 μl

próbki DNA. Na aparat nałożyć pokrywę i podłączyć elektrody. Rozdział prowadzić przy

napięciu 100 V, przez 45 min. Równolegle, w celu określenia wielkości fragmentów DNA,

rozdzielić marker mas molekularnych firmy FERMENTAS i/lub INVITROGEN. Po rozdziale

prążki są obserwowane przy użyciu transiluminatora. Żel może być sfotografowany w celu

uzyskania wyniku eksperymentu w formie obrazu (system do dokumentacji żeli Cleaver Sct.).

B. Oznaczanie zawartości kwasów nukleinowych oraz białka rozpuszczonego metodą

pomiaru absorbancji w nadfiolecie.

Zasada: Większość białek dzięki obecności tyrozyny i tryptofanu wykazuje maksimum

absorbancji przy 280 nm. Związkami wielkocząsteczkowymi, które mogą wpływać na wartość

absorbancji przy 280 nm są kwasy nukleinowe, których maksimum pochłaniania występuje przy



= 260 nm. Stężenie białka w mg/ml oblicza się ze wzoru:

C

białka

= 1,55



A

280 nm

1 cm



0,76



A

260 nm

1 cm

Metoda obarczona jest znacznym błędem wynikającym z tego, że zarówno różne białka, jak

i kwasy nukleinowe, w jednakowych stężeniach nie dają identycznych wartości absorbancji

maksymalnej. Poza tym wiele związków małocząsteczkowych (puryny, pirymidyny, fenole)

wykazuje dużą absorbancję przy 260 i 280 nm. Niemniej jednak metoda spektrofotometryczna

z uwagi na możliwość szybkiego oznaczenia białka w małej ilości materiału w obecności

dużych stężeń soli -(NH

4

)

2

SO

4

, NaCl -jest szeroko stosowana. Metoda nie nadaje się do

oznaczeń białka w mieszaninie zawierającej więcej niż 20% kwasów nukleinowych.

6

Postępowanie

Pomiary absorbancji w nadfiolecie zostaną wykonane przy użyciu spektrofotometru NanoDrop

1000, który nie wymaga stosowania kuwet i wykorzystuje bardzo niewielkie objętości próbki: 1

– 2 μl. Na postument nałożyć 2 μl wody destylowanej i włączyć program ‘Protein A280’. W

menu programu wybrać typ próbki (‘sample type’): BSA oraz wcisnąć przycisk ‘Blank’ aby

wyzerować przyrząd. Następnie zetrzeć bibułą wodę i umieścić 2 μl badanej próbki, wpisać jej

nazwę w polu ‘Sample ID’ i wcisnąć przycisk ‘Measure’ aby dokonać odczytu absorbancji.

Pomiar absorbancji próbki powtórzyć w programie ‘UV-Vis’ ustawiając dł. fali na 260 oraz 280

nm. Wiedząc, że ścieżka optyczna w aparacie NanoDrop ma długość 1 mm, obliczyć stężenie

białka w próbce.

Opracowanie wyników

Porównać wydajności izolacji DNA w badanych próbkach, skonfrontować je z oznaczeniami

białka na poszczególnych etapach oczyszczania kwasów nukleinowych. Przedyskutować wpływ

stopnia przetworzenia materiału na ilościowy uzysk DNA z próbki żywności.

Literatura:

1. Instrukcja do GeneMATRIX Food-Extract DNA Purification Kit (Blirt Gdańsk).

2. Nowak Z., Gruszyńska J., Wybrane Techniki i Metody Analizy DNA, Wydawnictwo SGGW, Warszawa

2007.

3. Polak J., Metody analizy żywności modyfikowanej genetycznie. Metody pomiarowe i kontroli jakości w

przemyśle spożywczym i biotechnologii, Wydawnictwo Akademii Rolniczej w Poznaniu, Poznań 2003,

413-431.

4. NanoDrop

®

Technologies, Inc., V3.5 User’s Manual, 2007.

5. http://www.irmm.jrc.be.html.