Ćwiczenie 2.- mgr Paulina Jędrak A236 (czwartek 12-15)

Izolacja DNA plazmidowego i rozdział w żelu agarozowym

Istnieje kilkanaście metod oczyszczania plazmidowego DNA z komórek bakteryjnych. Wszystkie złożone są z podobnych etapów:

1. hodowli komórek bakteryjnych (i ewentualnej amplifikacji plazmidu)

2. lizy komórek bakteryjnych

3. oczyszczenia plazmidowego DNA (kluczowym momentem jest tu oddzielenie DNA plazmidowego od chromosomalnego)

Najbardziej popularnymi metodami jest liza alkaliczna i liza termiczna. Obecnie coraz częściej stosuje się gotowe zestawy do izolacji sprzedawane przez firmy biotechnologiczne, które zapewniają łatwy i wydajny proces izolacji.

1. Hodowla komórek bakteryjnych.

Do izolacji DNA plazmidowego z komórek bakteryjnych, najczęściej wykorzystuje się hodowle płynne, w których podłoże uzupełnione jest odpowiednim antybiotykiem – gen oporności na antybiotyk znajduje się na plazmidzie. Wysokokopijne wektory plazmidowe (np. z serii pUC) otrzymywane są z hodowli znajdującej się w późnej fazie logarytmicznej wzrostu, podczas gdy wektory nisko- i średniokopijne (np. pBR322) powinny być przed izolacją amplifikowane. W przypadku plazmidów serii ColE1, w tym celu do hodowli dodaje się chloramfenikol, który hamuje syntezę białek (m.in. białek koniecznych do replikacji chromosomalnego DNA, które jednak nie biorą udziału w replikacji DNA plazmidowego). Takie działanie skutkuje zwiększeniem puli składników i enzymów potrzebnych do syntezy cząsteczek plazmidowego DNA, a tym samym wzrostem ilości kopii plazmidu w komórce.

2. Liza komórek bakteryjnych.

Liza komórek bakteryjnych zachodzi pod wpływem działania takich czynników jak detergenty (dodecylosiarczan sodu - SDS, sarkozyl, Triton X-100), które niszczą błonę komórkową, rozpuszczalniki organiczne (fenol, chloroform), które powodują denaturację białek, roztwory alkaliczne lub wysoka temperatura. Często stosuje się też lizozym - enzym trawiący mureinę ściany komórkowej bakterii (nie działa w pH < 8.0).

Podczas oczyszczania DNA należy zapobiegać jego degradacji przez nukleazy. Osiąga się to poprzez dodanie związków chelatujących dwuwartościowe kationy (np. EDTA), będące kofaktorami nukleaz. Również praca w warunkach jałowych oraz używanie jednorazowych rękawiczek znacznie minimalizują niebezpieczeństwo degradacji DNA przez nukleazy.

3. Oczyszczanie plazmidowego DNA

Większość plazmidów bakteryjnych występuje w formie superzwinietej (CCC- ang. covalently closed circle). Wiele metod oczyszczania wykorzystuje właśnie tę cechę DNA plazmidowego podczas oddzielanie plazmidu od DNA chromosomalnego. Chromosom bakteryjny od DNA plazmidowego nie różni się pod względem składu chemicznego, stąd do oddzielenia ich od siebie wykorzystuje się różnice w topologii tych cząsteczek oraz ich rozmiarze.

W metodzie lizy alkalicznej bufor o wysokim pH (12.0- 12.5) zawierający NaOH powoduje całkowitą denaturację chromosomalnego DNA, natomiast plazmidowy DNA zostaje zdenaturowany jedynie na niewielkich odcinkach. Fragmenty chromosomalnego DNA po neutralizacji pH i w obecności wysokiego stężenia soli (np. octanu amonu) tworzą nierozpuszczalną sieć, dzięki czemu można usunąć je przez wirowanie; natomiast DNA plazmidowe ulega specyficznej renaturacji i pozostaje w supernatancie. W przypadku lizy termicznej, czynnikiem denaturującym jest wysoka temperatura, w której DNA chromosomalny i plazmidowy zachowują się podobnie jak w wysokim pH.

Następny etap polega na oddzieleniu DNA od białek. Zwykle stosuje się do tego celu roztwór fenolu lub jego mieszaninę z chloroformem. Białka można też usunąć poprzez trawienie proteazami (zwykle proteinazą K). Usunięcie RNA przeprowadza się enzymatycznie, inkubując próbki z RNazą (wolną od DNazy), bądź przez sączenie molekularne lub wirowanie w gradiencie gęstości chlorku cezu.

Z odbiałczonych próbek DNA jest precypitowany (wytrącany) alkoholem etylowym lub izopropanolem w obecności octanu potasowego, sodowego lub amonowego, następnie pozostałości soli usuwa się poprzez przemycie osadu 70% etanolem.

W celu ułatwienia prac związanych z badaniem kwasów nukleinowych, firmy biotechnologiczne sprzedają specjalne kolumny do izolacji i oczyszczania DNA i RNA. Systemy te na ogół oparte są na zdolności złóż krzemionkowych do wiązania kwasów nukleinowych w obecności wysokich stężeń soli chaotropowych, takich jak chlorowodorek guanidyny lub izotiocyjanian guanidyny. Sole chaotropowe, powodują również rozpad błon

komórkowych i denaturację białek, co sprzyja izolacji kwasów nukleinowych. Chaotropy (ang. chaotropes, czyli ,,czyniące chaos'') są to substancje, które w roztworach wodnych wprowadzają silne zaburzenia w sieci wiązań wodorowych. W oparciu o tę zasadę opracowano systemy wykorzystywane do następujących celów:

- izolacja plazmidowego DNA,

- izolacja całkowitego DNA

- izolacja całkowitego RNA

- elucja DNA z żeli agarozowych i poliakryloamidowych

-oczyszczanie kwasów nukleinowych po reakcjach enzymatycznych, takich jak: PCR, restrykcja, znakowanie.

Do sprzedawanych zestawów firmy dołączają szczegółowe opisy odpowiednich procedur. Zestaw używany na ćwiczeniach przeznaczony jest do izolacji plazmidowego DNA 1,5-3 ml hodowli bakteryjnej. W pierwszych etapach bakterie poddawane są lizie alkalicznej(L2) . Następnie lizat zobojętniany zostaje odpowiednim buforem (GL3), który powoduje precypitację DNA chromosomalnego oraz białek, pozostawiając plazmidowe DNA w roztworze. Po wirowaniu supernatant zawierający plazmidowe DNA nanoszony jest na kolumienkę. Zanieczyszczenia są wypłukiwane natomiast DNA pozostaje osadzone na złożu. Kolejne etapy przepłukiwania kolumienki służą wypłukaniu wszystkich zanieczyszczeń. Ostatnie przepłukiwanie roztworem TE wymywa DNA i pozwala na zawieszenie go w roztworze.

Szczepy i plazmidy:

• DH5α (fhuA2 Δ(argF-lacZ)U169 phoA glnV44 Φ80 Δ(lacZ)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17)

• pET30a(+)

Odczynniki:

• pożywka LB

• antybiotyk (kanamycyna)

• roztwór L1 ( NaOH, > 1% SDS)

• Bufor GL3 (> 3M CH3COOH, >3M CH3COOK, > chlorowodorku guanidyny)

• Roztwór A1 (izopropanol 70%)

• Bufor TE (1M Tris-HCl (pH 7,5), 0,5M EDTA (pH 8))

Odczynniki do elektroforezy agarozowej:

• 1% agaroza

• roztwór bromku etydyny (0,5 µg/ml)

• bufor TAE 0,5x stężony ( 20mM Tris-octan, 1mM EDTA pH 8.0)

• 6x stężony bufor obciążający ( 30% glicerol, 0,25% błękit bromofenolowy, 0,25% cyjanoksylen)

Aparatura:

wytrząsarka wodna, łaźnia wodna, worteks, mikrowirówka, aparat do poziomej elektroforezy agarozowej

IZOLACJA PLAZMIDOWEGO DNA– wykonanie:

1. Bakterie z wybranych kolonii bakteryjnych zaszczepić w 10 ml pożywki płynnej LB uzupełnionej odpowiednim antybiotykiem i hodować przez noc w z wytrząsaniem.

2. Hodowlę bakteryjną (1,5ml) wirować 5 minut przy 6000 RPM.

3. Odrzucić supernatant, osad zawiesić w 200 µl roztworu L1.

4. Dodać 200 µl roztworu lizującego L2 i po wymieszaniu przez 5-6-cio krotne odwracanie probówki (aby nie doprowadzić do fragmentacji chromosomalnego DNA) inkubować 3 min. w temperaturze pokojowej. Jeżeli po tej czynności lizat nie jest całkowicie klarowny należy ponownie odwrócić próbkę kilka razy i wydłużyć czas inkubacji o kolejne 3 min.

5. Dodać 400 µl roztworu zobojętniającego (GL3) i wymieszać kilkukrotnie odwracając próbkę.

6. Wirować10 minut przy 10-15 tys. RPM.

7. Ostrożnie wlać supernatant do kolumienki do oczyszczania plazmidowego DNA.

8. Wirować 1 minutę przy 10-15 tys. RPM.

9. Wyjąć kolumienkę z probówki, wylać przesącz i ponownie umieścić kolumienkę w probówce.

10. Nanieść na kolumienkę 500 µl pierwszego roztworu płuczącego (W).

11. Wirować 1 minutę przy 10-15 tys. RPM.

12. Wyjąć kolumienkę z probówki, wylać przesącz i ponownie umieścić kolumienkę w probówce.

13. Nanieść na kolumienkę 600 µl drugiego roztworu płuczącego A1.

14. Wirować 2 minuty przy 10-15 tys. RPM

15. Osuszoną kolumienkę umieścić w nowej probówce 1,5 ml, a na złoże nanieść 60 µl roztworu TE.

16. Inkubować 3 minuty w temperaturze pokojowej.

17. Wirować 1 minutę przy 10-12 tys. RPM

18. Kolumnę usunąć a oczyszczone plazmidowe DNA znajdujące się w probówce może być przechowywane krótkoterminowo w lodówce lub długoterminowo w temp.-20 °C do czasu dalszych analiz.

Elektroforeza agarozowa DNA:

Elektroforezą nazywamy ruch naładowanych cząsteczek w zewnętrznym polu elektrycznym. Ruchliwość elektroforetyczna liniowego dwuniciowego DNA jest w przybliżeniu odwrotnie proporcjonalna do logarytmu dziesiętnego z liczby par zasad. Należy jednak pamiętać, że cząsteczki DNA o tych samych masach, różniące się konformacją migrują w innym tempie. Szybkość wędrówki DNA w żelu zależy więc od:

• wielkości i kształtu cząsteczki DNA

• stężenia żelu

• przyłożonego napięcia

• wartości elektroendoosmotycznej (EEO) agarozy (jest to miara ilości związanych anionów siarczanowych i pirogronianowych, a jej wartość jest odwrotnie proporcjonalna do prędkości migracji ujemnie naładowanych cząsteczek w żelu).

DNA jest polianionem, zatem migruje w stronę dodatniej elektrody. Elektroforeza agarozowa, w zależności od stężenia żelu, pozwala na rozdział cząsteczek DNA o długości od 100 bp do 50 kbp.

Prędkość migracji różnych form topologicznych plazmidowego DNA w żelu agarozowym.

WYKONANIE

Przygotowanie żelu agarozowego:

• Zawiesić agarozy w 100ml buforu TAE 0,5 x stężonego. Agarozę rozpuścić przez zagotowanie mieszaniny w kuchence mikrofalowej.

• Po schłodzeniu płynnej agarozy do temp. ok. 45-, wylać ją na płytkę aparatu do elektroforezy na grubość 3-5mm. Po całkowitym zastygnięciu ostrożnie wyjąć grzebień.

• Do aparatu wlać 0,5x stężony bufor TAE tak, aby żel był nim przykryty na grubość ok. 1mm.

Elektroforeza agarozowa DNA:

• Roztwór zawierający DNA wymieszać z barwnikiem elektroforetycznym w proporcji: 2 µl barwnika na 10µl roztworu DNA.

• Przygotowane próby nanosić do studzienek żelu (10µl).

• Rozdział elektroforetyczny prowadzić w polu elektrycznym o napięciu 5V na długości żelu

• Po zakończeniu rozdziału barwić żel w roztworze bromku etydyny przez 15 min.

• Żel oglądać w świetle UV o długości fali 320nm. Dokumentacja w postaci zdjęcia.

Zagadnienia:

1. Budowa i cechy plazmidu oraz zastosowanie w inżynierii genetycznej.

2. Pojęcia: ori replikacji, marker selekcyjny, precypitacja, chelatacja jonów dwuwartościowych, denaturacja i renaturacja DNA, enzym, enzym restrykcyjny, kofaktor.

3. Rodzaje topologicznych form plazmidu i ich migracja w żelu agarozowym.

4. Metody izolacji plazmidowego DNA bakterii (liza alkaliczna, liza termiczna, izolacja z użyciem kolumienek - różnice).

Literatura:

1. Turner P.C., Mclennan A.G., „Krótkie wykłady- biologia molekularna”

2. Sęktas M., „Zastosowanie inżynierii genetycznej w biotechnologii”

3. Sambrock J., Russell D.W., „Molecular cloning”

4. Włodarczyk M.(2002), „Co to jest plasmid?” Kosmos 51:231-240

5. Włodarczyk M. (2002), „Różnorodność cech genotypowych bakterii kodowanych przez plazmidy”. Kosmos 51: 241-254

6. Kłyszejko-Stefanowicz L., „Ćwiczenia z biochemii”