Izolacja DNA

Zestaw do izolacji Genomic Mini AX (A&A BIOTECHNOLOGY, POLSKA)

1. Zwirować 1 mL hodowli bakteryjnej i zawiesić w 100µL buforu do zawieszania bakterii BS. dodać 10µL lizozymu i inkubować 15 min w 37^oC.

2. Całość zawiesić w 0,9 mL zawiesiny lizującej LS - Lysis Buffer

3. Do zawiesiny dodać 15 μL proteazy, całość wytrząsać 10-15 s na Vorteksie.

4. Inkubować w temp. 56^oC przez 30 (powtarzając wstrząsanie co 10 min).

5. Próbę intensywnie wytrząsać przez 20 s. i wirować 12000 obr/min przez 5 min.

6. W trakcie wirowania przygotować kolumnę i nanieść na nią 0,8 ml roztworu K1. Poczekać aż roztwór wypłynie z kolumny.

7. Powstały supernatant ostrożnie (aby nie naruszyć peletu) przenieść na kolumnę.

8. Po przejściu lizatu przez złoże kolumnę przepłukać przez dwukrotnie dodanie 1,5 mL roztworu płuczącego K2.

9. Dodać do kolumny 0,25 mL roztworu elucyjnego K3 i poczekać aż wypłynie z kolumny.

10. Przesącz odrzucić, kolumnę umieścić w nowych probówkach i dodać 1 mL roztworu elucyjnego K3.

11. Do uzyskanego eluatu zawierającego DNA, dodać 800 μL mieszaniny precypitacyjnej PM.

12. Całość wymieszać i wirować przez 10 min przy 12000 obr/min.

13. Zlać supernatant nie naruszając osadu DNA.

14. Wyekstrahowane DNA przemyć 500 μL 70% etanolu, wymieszać i wirować przez 3 min przy 12000 obr/min. Po odwirowaniu zlać alkohol, DNA osuszyć w temp. pokojowej przez ok. 10 min.

15. Osuszony osad DNA zawiesić w 40 μL buforu TE.

---