Etapy izolacji DNA
Etapy izolacji DNA
• Izolacja DNA jest wstępnym i
podstawowym etapem w wielu
procedurach stosowanych w biologii
molekularnej, mającym zawsze
krytyczne znaczenie dla ich dalszego
przebiegu.
• Podstawowym celem jest uzyskanie
preparatu DNA o wysokiej czystości i
niskim stopniu degradacji.
• Wybór najwłaściwszej metody izolacji zależy
od:
1. Rodzaju analizowanego kwasu nukleinowego.
2. Organizmu z jakiego przeprowadzamy
izolację( zwierzęta, rośliny, bakterie, wirusy).
3. Rodzaju materiału z jakiego przeprowadzamy
izolację ( rodzaj tkanki, stopień przetworzenia,
organ).
4. Oczekiwanych rezultatów ( plon, czystość,
czas przeznaczony na oczyszczanie).
5. Docelowego przeznaczenia materiału ( PCR,
klonowanie, znakowanie, blotowanie, Real
Time- PCR, synteza cDNA).
Pierwszy etap izolacji DNA
• Pierwszym etapem jest fizyczne
zniszczenie struktury tkankowej i
komórkowej materiału biologicznego
tzw. homogenizacja. Często wykonuje
się to poprzez rozcieranie materiału
biologicznego w ciekłym azocie
( kryształki lodu niszczą ściany
komórkowe i inne struktury).
Drugi etap izolacji DNA
• Drugim etapem izolacji DNA jest
otworzenie komórek, z których otrzymuje
się DNA. Często idealna procedura lizy
komórek jest kompromisem między
metodą na tyle inwazyjną, by uszkodzić
materiał z którego dokonujemy izolacji i
jednocześnie na tyle delikatną by nie
zniszczyć materiału genetycznego
komórki.
• DNA w komórce występuje w różnych strukturach
otoczonych błoną ( jądro komórkowe,
mitochondria, chloroplasty). Ponadto jest
związane z różnymi białkami histonowymi i
niehistonowymi.
• Aby zniszczyć błony komórkowe i białka do
buforów ekstrakcyjnych dodaje się różne
detergenty: np. SDS (dodecylosiarczan sodu),
CTAB ( bromek heksadecylotrimetyloamoniowy),
izotiocyjanian guanidyny.
• Te detergenty umożliwiają też eliminację
enzymów nukleolitycznych, które mogłyby
zniszczyć uwolniony DNA.
Typowe procedury lizy komórkowej
składają się z etapów zawierających:
• Mechaniczne uszkodzenia (np.
ucieranie, liza hipotoniczna)
• Traktowanie chemiczne (np.. Liza
detergentem, sole chaotropowe,
redukcja tiolowa)
• Trawienie enzymatyczne (np.
proteinaza K)
• Z pewnego typu materiałem etap ten
jest łatwy: homogenizowaną próbkę
komórek zwierzęcych otwiera się po
prostu przez dodanie detergentu
takiego jak SDS czyli dodecylosiarczan
sodu, który rozbija błony komórkowe,
uwalniając zawartość komórki.
• Wszystkie błony biologiczne mają
podobną ogólną budowę i zawierają
cząsteczki tłuszczów i białek
utrzymujących się razem przez
oddziaływania niekowalencyjne.
• Cząsteczki
tłuszczów są
zorganizowane
w ciągłą,
podwójną
warstwę, w
której
„zawieszone”
są cząsteczki
białek.
Cząsteczki
tłuszczów
składają się z
hydrofilowych
głów i
hydrofobowyc
h końcówek-
ogonów.
• Detergent ma podobną budowę co warstwa
lipidowa, dzięki temu możliwe jest
wychwytywanie przez niego tłuszczów
wchodzących w skład błony komórkowej i
błony jądrowej.
• Komórki roślinne mają mocne ściany i
dlatego wymagają ostrzejszego
traktowania. Komórki te zwykle
najpierw zamraża się, a następnie
rozciera w moździerzu, co jest
najefektywniejszym sposobem
zniszczenia ich celulozowych ścian.
• Komórki bakteryjne np. Escherichia coli
można poddać lizie przez połączone
działanie enzymatyczne i chemiczne.
Używanym enzymem jest lizozym,
otrzymywany z białka jaja, który
rozrywa
Związki polimerowe bakteryjnej
ściany komórkowej, a składnikiem
chemicznym jest kwas
etylenodiaminotetraoctowy-EDTA.
Jest to związek chelatujący jony
magnezu i przez to zmniejsza
integralność błony komórkowej.
Rozerwanie błony komórkowej przez
dodanie następnie detergentu
powoduje rozpad komórki.
• Detergent zawarty jest w tzw. buforze
ekstrakcyjnym, w skład którego wchodzi
EDTA, który dzięki wiązaniu jonów
magnezu obniża aktywność DNazy, której
kofaktorem jest magnez. Oraz Tris/HCl,
który zapewnia roztworowi odpowiednią
pojemnosć buforową ( niskie lub wysokie
pH uszkadza DNA).
• Często w jednym etapie procedury rozrywa
się błony komórkowe i inaktywuje
wewnątrzkomórkowe nukleazy (jeden
roztwór zawiera detergent i silnie
chaotropowe sole inaktywujące enzymy).
• Detergent wiążąc tłuszcze i białka błony
komórkowej, umożliwia uwolnienie genomowego
DNA (rys 3). Od momentu rozerwania błony
komórkowej i błon otaczających organelle
rozpoczyna się etap OCZYSZCZANIA DNA.
Trzeci etap izolacji DNA
•
Kolejnym etapem jest usunięcie zdegradowanych
wcześniej elementów komórkowych. Do usunięcia:
1.
Białek stosuje się trawienie proteinazą K, oraz ekstrakcję
fenolem i chloroformem
2.
Lipidów wykorzystuje się ekstrakcję chloroformem,
wykonywaną bezpośrednio po działaniu fenolem, gdyż
chloroform oprócz białek i lipidów usuwa również resztki
fenolu.
3.
Polisacharydów wytrąca się DNA metodą CTAB.
4.
Polifenoli, które w postaci utlenionej tworzą wiązania
kowalencyjne z DNA, stosuje się PVP (poliwinylopirolidon)
5.
RNA stosuje się trawienie RNazą, lub wytrącanie z
wykorzystaniem LiCl.
Czwarty etap izolacji DNA
• Przedostatnim etapem jest oddzielenie
DNA od związków użytych w poprzednich
działaniach. Składniki takie jak detergenty,
sole czy inhibitory po spełnieniu swojej
funkcji muszą być dokładnie usunięte aby
DNA mógł być użyty później do badań np.
z enzymami restrykcyjnymi, kinazami czy
polimerazami.
• Aby to osiągnąć wytrąca się DNA w etanolu
lub izopropanolu dodając octan amonu lub
sodu by zwiększyć wydajność wytrącania.
Piąty etap izolacji DNA
• Ostatnim etapem jest przygotowanie
wyekstrahowanego DNA do przechowywania.
• DNA przechowywany jest w postaci roztworu
wodnego lub w buforach typu TE, zawierających Tris-
HCl odpowiadający za utrzymanie stałego pH
roztworu, EDTA wiążący kationy dwuwartościowe
magnezu, cynku, manganu, wapnia- chroni DNA przed
działaniem enzymów których jony te są kofaktorami.
• DNA w buforach TE należy przechowywać w
temperaturze +4°C lub -20°C.
• DNA można również przechowywać w 70% roztworze
etanolu w temperaturze pokojowej i dopiero przed
użyciem np. do PCR zalać go buforem.
Automatyczna izolacja DNA
• Skonstruowano również wiele
urządzeń do automatycznej
izolacji DNA tzw. ekstraktorów
DNA, które zawierają kilka
naczyń ekstrakcyjnych
umieszczonych na
wytrząsarce z kontrolowaną
temperaturą. Naczynia do
ekstrakcji zawierają otwór do
podawania odczynników
organicznych i alkoholu oraz
otwór spustowy na zużyte
odczynniki. DNA zbierany jest
na filtrach membranowych.
Rys. 5 Easy MAG aparat do
automatycznej izolacji kwasów
nukleinowych.
Zalety stosowania
ekstraktorów
• Zapewnienie jałowych warunków
pracy i sterowanie urządzenia
komputerem
• Znaczne skrócenie czasu trwania
izolacji
• Eliminacja konieczności pracy z
substancjami szkodliwymi (fenol,
chloroform)
Bibliografia
• R. Słomski „Przykłady analiz DNA”
• T. A. Brown „Genomy”
• J. Bradley „Genetyka medyczna”
• M. Somma „Analiza próbek
spożywczych na zawartość Genetycznie
Modyfikowanych Organizmów”
• www.molcell.amu.edu.pl