4. Izolacja DNA i RNA

Jednym z niewielu truizmów, wartych ciągłego powtarzania jest stwierdzenie, że wszelka praca z materiałem genetycznym człowieka bezwzględnie wymaga przed jej rozpoczęciem... posiadania, a więc wyizolowania tego materiału. Od tego zdawałoby się mało istotnego, wstępnego etapu jakże często zależy końcowy spektakularny sukces eksperymentu. Wbrew pozorom, izolacja materiału genetycznego wysokiej jakości nie jest wcale prosta.
DNA występuje w ludzkich komórkach głównie w dwu organellach : jądrze i w mitochondriach. Do wyizolowania DNA mitochondrialnego wcale nie trzeba najpierw izolować mitochondriów, preparuje się on "przy okazji", jako spora, kilkuprocentowa domieszka w czasie izolacji DNA jądrowego /genomowego/.
DNA genomowe występuje w komórkach jądrzastych, bezskuteczna byłaby więc próba izolacji DNA np. z odpłukanej masy erytrocytarnej, aczkolwiek pewne niewielkie ilości DNA można uzyskać i z tego źródła, pochodzi on z mitochondriów oraz z niedojrzałych, jeszcze jądrzastych krwinek czerwonych /retikulocytów/, w świeżo pobranej krwi średnio co setny erytrocyt ma jeszcze przez pewien czas jądro komórkowe.
DNA można izolować z praktycznie każdej ludzkiej tkanki, aczkolwiek z niektórych tkanek nie warto tego robić, z różnych powodów. I tak na przykład z tkanki płucnej uzyskuje się "brudne", ciemne preparaty z zawiesiną koloidalnych cząsteczek kurzu. Tkanka tłuszczowa jest trudna do homogenizacji, ponieważ "maże się", natomiast tkanka kostna jest bardzo twarda. Wątroba zawiera nukleazy, które degradują DNA, a śledziona duże ilości hemu /inhibitora reakcji PCR/. Niektóre komórki /np. plemniki, niektóre guzy nowotworowe, tkanki z formaliny/ źle się trawią proteinazą K, trzeba dodawać jej bardzo dużo i aktywować odczynnikiem tiolowym /DTT/. Wybrane tkanki ciała ludzkiego jako źródło izolacji DNA są wymienione w poniższej tabeli.

Tkanka	g DNA/1 g tkanki	Tkanka	g DNA/1 g tkanki
Krew	30	Ślinianka	270
Mózg	125	Serce	270
Mięsień	200	Wątroba	750
Tarczyca	250	Gonada	1950

Z tabeli wynika, że najlepszym źródłem izolacji DNA ze zwłok ludzkich są bez wątpienia gonady /jajniki i jądra/, i to niezależnie od wieku zmarłej osoby. W przypadku osób żywych najwygodniejszym, a więc najczęściej używanym materiałem do izolacji jest krew lub ślina, a ściślej wymaz nabłonków z jamy ustnej z domieszką śliny, najczęściej pobierany specjalną bibułową „skrobaczką”.
Izolacja DNA może być przeprowadzona na bardzo wiele sposobów, a metody stosowane w laboratoriach prawie zawsze są kompilacją możliwie dużej liczby technik źródłowych. Wykaz technik źródłowych jest przedstawiony na poniższym schemacie.

KOMÓRKA


JĄDRO KOMÓRKOWE

BIAŁKO - strawienie proteazą - wysalanie - ekstrakcja fenolowa - wytrącanie chloroformem - jonowymiana - absorpcja - wiązanie z przeciwciałem

DNA - ultrawirowanie - jonowymiana - mikrosączenie - elektroforeza preparatywna - absorpcja na silikonie - formowanie potrójnej helisy - wiązanie z przeciwciałem - strącanie sperminą -wytrącanie alkoholem

W tej chwili najbardziej rozpowszechnione techniki izolacji DNA w laboratoriach biologii molekularnej to metoda fenolowa i metoda solna /"nietoksyczna"/. Jeszcze lepsze wyniki osiągnąć można łącząc elementy obu tych metod. Wschodzącą gwiazdą wśród technik preparacji DNA jest metoda opierająca się na wykorzystaniu wiązania DNA przez pył silikonowy (krzemowy lub szklany) i następnie elucję (poprzez zmianę składu buforu, jego stężenia lub pH) związanego z pyłem DNA. W zastosowaniach medyczno - sądowych często stosuje się technikę cheleksową Bardzo dobry preparat DNA powinien mieć dużą lepkość, stężenie około 1mg/1ml, czystość spektrofotometryczną (iloraz absorbancji mierzonej przy A_260nm/A_280nm) zawartą pomiędzy wartością 1,6 a 1,8 a ponadto brak inhibitorów reakcji PCR oraz dużą trwałość, która umożliwia wieloletnie przechowywanie takiego preparatu.
RNA izoluje się do badań wówczas, gdy organizm który badamy nie zawiera DNA (np. jest retrowirusem), względnie wtedy, gdy nie interesuje nas czy dany gen jest obecny w genomie badanego organizmu, lecz to, czy ten gen jest aktywny, co przejawia się poprzez wytwarzanie odpowiedniego mRNA. RNA można izolować całościowo (za pomocą kwaśnego odczynnika fenolowego zwanego Trizolem) lub w postaci mRNA, wykorzystuje się wówczas fakt, że każda cząsteczka mRNA posiada strukturę poliA. Do izolacji używa się oligonukleotydów poliT, związanych z nośnikiem (celulozą, kulkami magnetycznymi itp).

REPETYTORIUM
Jeżeli potrafisz odpowiedzieć na zadane pytania, opanowałeś materiał z powyższego wykładu. Jeżeli masz wątpliwości, zgłoś się do wykładowcy na konsultację.
1. Czym preparacja DNA mitochondrialnego różni się od preparacji DNA genomowego?
2. Czy z erytrocytów można wyizolować DNA? Z leukocytów? Z płytek krwi? A z surowicy?
3. Których tkanek nie warto /jeżeli mamy wybór/ brać do izolacji ludzkiego DNA?
4. Która tkanka ze zwłok człowieka jest najodpowiedniejsza do izolacji DNA?
5. Jak wypreparować DNA z tkanki, która źle się trawi proteinazą K?
6. Jakie drogi izolacji DNA są możliwe do zastosowania?
7. Jakie metody izolacji DNA są najbardziej rozpowszechnione?
8. Jakimi parametrami charakteryzuje się dobry preparat DNA?
9. Jak wyizolować całościowy RNA? A jak jego najważniejszą frakcję, mRNA?

---