Biblioteki DNA

Niniejszy artykuł ma na celu przybliżenie czytelnikowi tematyki związanej z bibliotekami DNA. Zawiera podstawowe informacje o samych bibliotekach genomowych, ich rodzajach, wektorach używanych do ich tworzenia, technikach ich przygotowania i przeszukiwania. W związku ze stale wzrastająca liczbą poznawanych genomów i doskonaleniem technik inżynierii genetycznej, coraz bardziej istotne stają się zagadnienia umożliwiające praktyczne i co ważniejsze efektywne wykorzystanie tych znanych sekwencji, na przykład ich klonowanie. Zastosowania te nie byłyby jednak możliwe gdyby nie metody przechowywania poznanych genomów bądź ich fragmentów, nie byłyby również efektywne gdyby nie możliwość odszukania konkretnych części danego genomu (każdorazowe powielanie go w całości jest, co oczywiste, dosyć kłopotliwe). Właśnie w tej i podobnych kwestiach, już od wielu lat z pomocą przychodzą biblioteki DNA.

Rodzaje bibliotek DNA

Popularnonaukowa definicja określa bibliotekę DNA jak "kolekcję" sklonowanych fragmentów DNA. Zasadniczo wyróżnia sie dwa rodzaje bibliotek genowych. Do pierwszego z nich należą tak zwane biblioteki cDNA, jak sugeruje nazwa zawierają one fragmenty cDNA, odzwierciedlają aktywne geny komórki tkanki etc., zwykle nie stanowią zatem reprezentacji wszystkich genów organizmu. Funkcję tę spełniają natomiast biblioteki genomowe(drugi rodzaj bibliotek DNA), które zawierają zarówno kodujące jak i niekodujące elementy kompletnego genomu danego organizmu.

Ogólnie rzecz biorąc przygotowanie biblioteki polega na wklonowaniu fragmentów DNA lub cDNA otrzymanych specyficzną dla danej biblioteki metodą do odpowiedniego wektora, a następnie transformacji komórek gospodarza tak przygotowanym wektorem. Przechowywanie biblioteki nie wymaga, zatem jak mogłaby sugerować nazwa dużej powierzchni, najczęściej biblioteka taka to płytka z łysinkami fagowymi, bądź probówki typu Eppendorf zawierające zawiesinę bakterii. Aby bardziej szczegółowo omawiać same biblioteki, metody ich konstrukcji i screeningu należy wspomnieć o typowych wektorach do klonowania.

Typowe wektory do klonowania

Wektor plazmidowy

Dla formalności należy przypomnieć podstawowe informacje dotyczące plazmidów. Plazmidy zatem to autonomiczne, pozachromosomowe elementy genetyczne występujące u wielu organizmów prokariotycznych, a także niektórych eukariontów. Najbardziej charakterystyczną cechą plazmidów jest ich fizyczna odrębność od chromosomu gospodarza oraz zdolność do trwałego utrzymywania się w komórce i kontrolowanej replikacji. Plazmid zasadniczo nie koduje funkcji niezbędnych dla przetrwania gospodarza, może jednak nadawać mu wiele przydatnych cech ( jak choćby nagminnie wykorzystywana do selekcji oporność na antybiotyki).Plazmidy są zwykle kolistymi cząsteczkami DNA (tzw. CCC-DNA, covalently closed circular), choć istnieją także plazmidy liniowe (np. Kluyveromyces lactis). Istotny jest także fakt, iż wyróżnia się plazmidy wysokokopiowe (co najmniej kilkaset) oraz niskokopiowe ( kilkadziesiąt) zależnie od liczby kopii przypadających na komórkę gospodarza.

Początkowo jako wektory używane były zwyczajne, zupełnie niezmodyfikowane plazmidy. W miarę rozwoju inżynierii genetycznej wektory takie nabywały coraz więcej cech, mających na celu uzyskanie maksymalnej wydajności podczas ich stosowania. Dzisiejsze wektory plazmidowe zawsze zawierają:

• Multiple Clonning Site (MCS), inaczej tzw. polilinker. Jest to sekwencja zawierająca miejsce cięcia dla wielu różnych enzymów restrykcyjnych, to właśnie w obrębie tego fragmentu integruje się obcy DNA.

• Gen reporterowy - w wielu plazmidach polilinker zlokalizowany jest w obrębie kodującego regionu jakiegoś genu. Poprzez insercję fragmentu DNA gen reporter traci swoją funkcję co zwykle objawia się zmiana morfologii kolonii bakteryjnych w warunkach selekcyjnych. Czasem gen zawierający polilinker jest dla komórki letalny, przeżyć mogą więc tylko te bakterie które otrzymały plazmid z insertem.

• Oprócz wspomnianych elementów każdy wektor plazmidowy zawiera elementy typowe dla plazmidu, chodzi tutaj zwłaszcza o miejsce inicjacji replikacji (origin).

Pojemność typowych wektorów plazmidowych wynosi około 10 kb.

Pojemność ta jest znacznie zwiększona w przypadku tak zwanych BACów (Bacterial Artificial Chromosome). Często wymienia się je właśnie przy okazji wektorów plazmidowych ponieważ posiadają elementy charakterystyczne dla bakteryjnego plazmidu F (tzw. czynnika płciowego). Krótko mówiąc są to koliste cząsteczki DNA o wielkości około 7 kb, zawierają replikon z czynnika F z E.coli. Ich pojemność wynosi około 80 - 350 kb.

Bakteriofag lambda

Pochodne faga lambda są zdecydowanie najczęściej stosowanymi wektorami fagowymi. W porównaniu z wektorami plazmidowymi pozwalają one na znacząco prostsze klonowanie większych fragmentów DNA, co więcej wydajność infekcji komórek bakteryjnych fagiem jest wyższa niż wydajność transformacji. Genom bakteriofaga lambda to dwuniciowa cząsteczka DNA (dsDNA) od długości 48502 bp, niosąca około 40 genów. Ważny z punktu widzenia inżynierii genetycznej jest fakt, że dojrzałe cząstki fagowe zawierają liniową cząsteczkę DNA, która jest zakończona tzw. odcinkami cos (cohesive ends)'Cos są ponadto niezbędne podczas umieszczania wirusowego genomu w białkowym kapsydzie. Ciekawy i nie mniej istotny w praktyce jest sposób namnażania wirusowego DNA w bakterii. Z wykorzystaniem enzymów gospodarza powstaje długa cząsteczka liniowego DNA nazywana konkaktomerem, składa się ona ze zwielokrotnionych genomów faga oddzielonych sekwencjami cos, właśnie w miejscu tych elementów, tuż przed "zapakowaniem" genomu do otoczki, białka NU1 i A przecinają konkaktomer, "pakowaniu" ulegają więc już tylko pojedyncze kopie genomów. Warto w tym miejscu zaznaczyć, że obcy DNA wklonowany do genomu faga jest powielany i pakowany (pod warunkiem, że całkowita długość DNA nie przekroczy 50 kb) w identyczny sposób.

Po infekcji komórki bakteryjnej fagiem lambda mogą zachodzić dwa modele wydarzeń. Cykl lityczny, prowadzący do lizy bakterii i uwolnienia namnożonych cząstek wirusowych, bądź cykl lizogenny, podczas którego materiał genetyczny faga wbudowuje się do genomu gospodarza, zakażenie wirusem przebiega więc niejako poprzez fazę utajenia. Przełączenie cyklu lizogennego w lityczny może nastąpić w każdym momencie pod wpływem różnych czynników, jak choćby zmiana temperatury czy składu pożywki w warunkach in vivo.

Jako wektor stosowany jest zmodyfikowany fag lambda, w którym do minimum ograniczono liczbę miejsc trawienia enzymami restrykcyjnymi. Wektory fagowe również zawierają polilinkery, geny markerowe, a niekiedy specyficzne silne promotory, ich pojemność wynosi ok. 20 kb.

Kosmidy

Powszechne zastosowanie jako wektory znajdują także tzw. kosmidy. Są to plazmidy zawierające omawiane już sekwencje cos z faga lambda, spełniające swoje naturalne funkcje. Ich pojemność oscyluje w okolicach 45 kb, całkowita ilość materiału genetycznego nie może zbytnio odbiegać od wielkości genomu "dzikiego" faga, w przeciwnym razie zrekombinowana cząsteczka nie zostanie zapakowana do kapsydu.

Yeast artificial chromosome

Popularne YACi czyli sztuczne chromosomy drożdżowe pozwalają na klonowanie fragmentów DNA o długości nieprzekraczającej 5 milionów par zasad. YAC jest liniową cząsteczką DNA zawierającą sekwencję niezbędną do replikacji w komórkach drożdży czyli tzw. ARS (Autonomously Replicating Sequence), polilinker, gen markerowy oraz elementy charakterystyczne dla typowego chromosomu eukariotycznego (centromer, telomery, origin replikacji). Dzięki dużej pojemności YACi często są wykorzystywane do tworzenia fizycznych map chromosomów wyższych eukariontów, oczywiście znajdują również zastosowanie podczas konstrukcji bibliotek DNA.

Inne typy wektorów

Wymienione powyżej typy wektorów są zdecydowanie najpowszechniej stosowane, inne rodzaje wektorów, których istnieje bardzo wiele, stosowane są w bardzo specyficznych sytuacjach, dlatego ich omawianie mija się z celem. Warto jednakże wspomnieć o sztucznych chromosomach ludzkich (HAC - Human Artificial Chromosome), które oprócz typowych wektorowych struktur zawierają centromery, telomery i co ważne informacje o mechanizmach formowania centromeru. Dosyć często spotykane są także tak zwane PACi (P1 Artificial Chromosome) zawierające dwa replikony: pochodzący z faga P1 oraz plazmidowy. PACi mogą być przenoszone do E.coli, ich pojemność waha się w granicach 60 - 300 kb.

Przytoczone powyżej informacje o stosowanych do klonowania wektorach powinno ułatwić poruszanie się w obrębie tematyki samych bibliotek genowych. Jako pierwsze omówione zostaną biblioteki genomowe.

Biblioteki genomowe

Jak wspomniano już wcześniej, biblioteki genomowe zawierają cały genom konkretnego organizmu. Wyspecjalizowane enzymy restrykcyjne trawią genom w wielu miejscach (zwykle stosuje się enzymy nazywane 4-cutter np. Sau3A1, wtedy genom jest cięty mniej więcej raz na 256bp, w przypadku enzymów 6-cutter stosunek ten przedstawia się jak 1/4000, a 8-cutter 1/65000). Najczęściej jednak prowadzi się tak zwane częściowe trawienia w wyniku których otrzymujemy ogromną liczbę fragmentów DNA o zróżnicowanej długości, które następnie mogą być wklonowane do wektorów. Taka metoda daje nam jednak tylko pewną liczbę sekwencji DNA reprezentujących kompletne geny, większość z nich zawiera tylko fragmenty genów oraz odcinki niekodujące. To jest zasadnicza wada bibliotek typu genomowego.

Kilku słów wyjaśnienia wymaga technika wspomnianego częściowego trawienia. Opisany wyżej wzór cięcia uzyskuje się przez zróżnicowanie czasu działania danego enzymu oraz jego ilości. W takich warunkach w niektórych cząsteczkach DNA enzym rozetnie wszystkie specyficzne dla siebie miejsca, a w innych nastąpi mniejsza liczba cięć, wskutek czego otrzymamy pełne spektrum długości fragmentów kwasu nukleinowego. Często podczas konstrukcji bibliotek DNA dokonuje się selekcji fragmentów właśnie ze względu na ich długość (co w wielu przypadkach wymuszone jest przez pojemność stosowanych wektorów).

Biblioteki genomowe konstruuje się przy użyciu fagów lambda. Regiony genomu które nie są dla faga niezbędne, zostają wycięte, co prowadzi do wyraź nego wzrostu pojemności wektora. Po takim zabiegu genom faga jest pozbawiony centralnej części, często dokonuje się tego za pomocą restryktazy BamH1,a całkowity (np. ludzki genom) jest częściowo trawiony enzymem Sau3A1. Te dwa enzymy wytwarzają fragmenty z komplementarnymi lepkimi końcami. Ramiona faga lambda i fragmenty ludzkiego DNA o długości około 20 kb są ze sobą mieszane, następuje ligacja i pakowanie do wirionów. Fagi wysiewane są na murawę bakterii (np. E.coli, w miejscach, w których namnażają się transfekowane fagi pojawiają się łysinki (plaques), z których póź niej może zostać wyizolowany potrzebny klon. Powstała w takie procedurze płytka z łysinkami to nic innego jak właśnie genomowa biblioteka DNA.

Dlaczego biblioteki genomowe konstruuje się akurat w fagach lambda? Uzasadnienie jest proste. Dla przykładu kompletny genom człowieka zawiera 3 x 10³ bp, bakteriofag lambda może zmieścić fragmenty o długości 20 kb, aby więc przenieść ludzki genom do fagów potrzebne jest ich 1,5 x 10⁵ (albo taka sama ilość plazmidów, przy założeniu że klonuje się do nich fragmenty o długości właśnie 20 kb). Na 3 calowej szalce Petriego może zmieścić się maksymalnie 200 koloni bakteryjnych, biblioteka genomowa zawierająca cały genom człowieka wklonowany do plazmidów (które wprowadzono do komórek bakteryjnych) zajmuje zatem 700 takich szalek. Dla porównania taka sama płytka pozwala na uwidocznienie aż 5 x 10⁴ łysinek spowodowanych obecnością fagów lambda (wysianych na murawę bakterii), daje to tylko 30 szalek na cały ludzki genom. Wartości te jednoznacznie wskazują przewagę jaką ma fag lambda nad wektorami plazmidowymi (przynajmniej w kwestii bibliotek genowych) i odpowiadają na postawione wyżej pytanie.

Biblioteki cDNA

Jak wspomniano już wcześniej, biblioteka cDNA daje nam dostęp do kompletnych genów. U wyższych Eucaryota wiele genów jest transkrybowanych do odpowiednich sobie mRNA tylko w konkretnych komórkach, w innych geny te są mówiąc potocznie "zablokowane". DNA powstały na matrycy mRNA, nazywany komplementarnym DNA (cDNA), reprezentuje więc tylko sekwencje ulegające w danej lokalizacji transkrypcji. Właśnie taka duża "kolekcja" kopii cDNA, odpowiadających wszystkim mRNA w rozpatrywanym typie komórki bądź tkanki jest nazywana biblioteką cDNA, już na pierwszy rzut oka widać zatem różnicę w stosunku do omawianych poprzedni bibliotek cDNA. Pierwszą czynnością prowadzącą do przygotowania takiej biblioteki jest izolacja całkowitego mRNA z miejsca docelowego, kolejną synteza na jego matrycy cDNA, po tych zabiegach pozostaje już tylko wprowadzenie cDNA do odpowiedniego wektora i transfekowanie nim bakterii. Poniżej, wspomniane etapy, zostaną omówione nieco bardziej szczegółowo.

RNA wyizolowany z cytoplazmy jakiejś komórki składa się głównie z rRNA i tRNA, interesujący nas mRNA stanowi znacznie mniejszą jego część. Żeby oddzielić go od pozostałych rodzajów RNA wykorzystuje się fakt, iż na końcu 3` mRNA zawsze znajduje się tzw. ogon poli(A). Jeżeli zatem posłużymy się kolumną wypełnioną złożem z kowalencyjnie związanym odcinkami oligo-dT, mRNA będzie z nimi hybrydyzował Pozostanie wtedy już tylko odmycie innych rodzajów RNA i elucja mRNA buforem o niskim stężeniu soli. Tym sposobem otrzymamy oczyszczoną frakcję mRNA. Schematyczną procedurę przedstawia Rysunek 1.

• 
  Rysunek 1.Izolacja mRNA spośród RNA całkowitego. ["Molecular cell biology" Lodish, Berk, Zipursky]. www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=mcb.figgrp.1620

Kolejną istotną czynnością jest synteza samego cDNA. Proces ten katalizowany jest przez odwrotne transkryptazy. Odwrotna transkryptaza, tak jak inne polimerazy DNA, może dodawać nowe nukleotydy tylko do końca 3` już istniejącego łańcucha. Do zapoczątkowania reakcji konieczne jest więc dodanie do mRNA jako primerów fragmentów oligo-dT (ok. 20 powtarząjących się nukleotydów, które zhybrydyzują z poli(A)). Produktem reakcji polimeryzacji będzie hybryda RNA-DNA, którą rozdziela się do pojedynczych nici w środowisku alkalicznym. Następnie konieczne jest przekształcenie jednoniciowego cDNA w formę dwuniciową. Aby tego dokonać każda nić cDNA jest nieznacznie wydłużana przez terminalną transferazę w obecności pojedynczych nukleotydów (np. dG). Po takim zabiegu stosując jako primer fragmenty oligo-DC polimeraza DNA dosyntetyzuje komplementarną nić do już istniejącej. Opisane zabiegi przedstawia Rysunek 2. Często wykorzystuje się w tym punkcie naturalną tendencję pojedynczczych nici cDNA

• 
  Rysunek 1.Synteza cDNA. ["Molecular cell biology" Lodish, Berk, Zipursky]. www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=mcb.figgrp.1621

Dysponując dwuniciowym odcinkiem cDNA można przystąpić do przygotowania go do procesu klonowania. W tym celu na obydwu jego końcach liguje się krótkie (ok. 12 nukleotydów) linkery, zawierające miejsca restrykcyjne. Tak sporządzony fragment oraz wektor, do którego zostanie on wklonowany (zwykle genom faga lambda), przecina się tymi samymi enzymami restrykcyjnymi, liguje powstałe lepkie końce, a zrekombinowane wektory wysiewa na murawę bakterii, na której pojawiają się łysinki, a w nich klony faga lambda. Każdy z nich zawiera cDNA wywodzący się z jednej cząsteczki mRNA. W ten właśnie sposób powstaje wzorcowa biblioteka cDNA.

Jeśli zachodzi potrzeba zmniejszenia ilości klonów tworzących bibliotekę można posłużyć się analizowanym wcześniej klonowaniem w kosmidach. Obydwa typy bibliotek mogą zostać skonstruowane także w BACach, proces ligacji DNA genomowego i wektorowego przebiega i w tym przypadku w podobny do wspominanych już sposobów, ale jako że ligowane fragmenty są znacznie większe, do transfekcji komórek bakteryjnych wykorzystuję się proces elektroporacji (z użyciem pola elektrycznego).

Przeszukiwanie (screening) bibliotek DNA

Uzyskane opisanym sposobami biblioteki byłyby zupełnie bezużyteczne gdyby nie istniały metody pozwalające na szybkie i precyzyjne odszukanie w nich konkretnego fragmentu DNA, a dokładniej klonu niosącego tenże fragment. Żeby efektywnie przeszukiwać bibliotekę genową trzeba dysponować odpowiednio sporządzoną sondą genową. Istnieją dwa podstawowe ich rodzaje:

• Sonda heterologiczna - w charakterze takiej sondy może zostać wykorzystany DNA pochodzący z organizmu spokrewnionego z gospodarzem poszukiwanej przez nas sekwencji. W tym przypadku warunki hybrydyzacji są mniej wymagające, dopuszczają znaczne niedopasowanie pomiędzy sondą a docelowym fragmentem, usprawiedliwiane naturalnymi różnicami pomiędzy sekwencjami.

• Sonda syntetyczna - sekwencja takich sond wywodzi się najczęściej z aminokwasowej sekwencji białka kodowanego przez docelowy gen. W związku z nadmiarowością kodu genetycznego istnieje wiele możliwości sekwencji DNA kodujących dany odcinek polipeptydowy. Sposób przygotowania sondy uwzględnia je wszystkie.

Dysponując odpowiednią sondą można przystąpić do screeningu biblioteki jednym z przedstawionych niżej sposobów:

Hybrydyzacja DNA

Przeszukiwanie biblioteki metodą hybrydyzacji DNA rozpoczyna się od transferu koloni albo łysinek (będących de facto samą biblioteką) na filtr, najczęściej nitrocelulozowy, na którym w rezultacie otrzymujemy dokładne odwzorowanie układy z płytki hodowlanej. Komórki (lub wirusy) przeniesione na filtr poddaje się lizie, uwolniony DNA denaturuje, deproteinizuje i nieodwracalnie wiąże do matrycy. Następnym krokiem jest dodanie znakowanej radioizotopowo próby (sondy), która hybrydyzuje z komplementarnym fragmentem DNA. Próby, które nie zostały związane są odmywane z filtra, a filtr poddaje się autoradiografii, która uwidacznia kolonie niosące poszukiwany fragment DNA, na podstawie ich umiejscowienia na nitrocelulozie można zlokalizować je także na pierwotnej szalce, a z niej wyizolować odpowiedni klon. W teorii metoda ta wygląda mało skomplikowanie, jednak prawidłowe jej przeprowadzenie wymaga długiego czasu i dokładności, a sukces końcowy w dużej mierze uwarunkowany jest szczęśliwą ręką eksperymentatora. Problem stanowi tutaj postępowanie z samymi błonami nitrocelulozowymi. Procedura wymaga ich przenoszenia pomiędzy naczyniami, zmian odczynników etc. tymczasem już najmniejszy pęcherz powietrza może przyczynić się do przeoczenia poszukiwanej kolonii.

Analiza immunologiczna

W swoich pierwszych etapach postępowanie wygląda analogicznie do metody poprzedniej. Mianowicie kolonie przenosimy na filtr i lizujemy bakterie, ale tym razem unieruchamiane na matrycy jest nie DNA, ale białka. W dalszej kolejności matrycę inkubuje się w obecności przeciwciała pierwszorzędowego, specyficznym wobec białka kodowanego przez poszukiwany gen. Nadmiar przeciwciała jest odmywany, a matryca pokrywana przeciwciałem skierowanym przeciwko temu pierwszemu, najczęściej sprzężonym z enzymem (np. peroksydazą chrzanową lub alkaliczną fosfatazą). Po tym etapie przeprowadzana jest reakcja kolorymetryczna, która może zachodzić tylko w obecności przeciwciała drugorzędowego i na jej podstawie identyfikuje się miejsce, w którym znajdują się poszukiwane klony.

Screening na podstawie aktywności białka

Metoda ta może zostać zastosowana w dwóch przypadkach. Po pierwsze gdy produkt poszukiwanego genu jest enzymem, który w normalnych warunkach nie występuje w komórkach gospodarza (wektora). Dla przykładu geny alfa-amylazy, beta-glukozydazy, endoglukanazy wyizolowano poprzez wysianie biblioteki genomowej w E.coli na medium zawierające specyficzne dla tych enzymów substraty, będące czynnikiem selekcyjnym dla koloni zdolnych do jego użycia. Po okresie inkubacji w naczyniach hodowlanych pojawią się tylko i wyłącznie te elementy biblioteki, które zawierają geny kodujące zastosowane enzymy, albo elementy te staną się łatwe do odróżnienia (np. na podstawie morfologii), zależnie od charakteru białka. Drugi przypadek zachodzi w sytuacji gdy produkt poszukiwanego genu jest niezbędny do życia zmutowanych komórek gospodarza. Stosuje się wtedy pożywkę minimalną, bez tego produktu. W hodowli pojawią się tylko klony zawierającą prawidłową formę szukanego genu, a tym samym zdolne do syntezy niezbędnego związku.

Przeszukiwanie z wykorzystaniem PCR

Reakcja PCR często używana jest do przeszukiwania bibliotek stworzonych w YACach. Taka biblioteka mieszcząca cały ludzki genom mieści się na 240 "96-dołkowych" płytkach. W celu screeningu tworzy się repliki tych płytek, łącząc np. po 4 na jednym filtrze. Następnie klony z każdych trzech kolejnych filtrów (podawane liczby stanowią tylko przykład, cała procedura może być przeprowadzona w różnych konfiguracjach) łączy się razem i prowadzi reakcję PCR w każdej z takich mieszanin (każda z nich zawiera teraz klony z 12 dołków) z użyciem odpowiednich primerów (specyficznych dla poszukiwanego fragmentu DNA). Jako próby pozytywnej używa się całkowitego ludzkiego DNA. W kolejnym kroku mieszaniny poreakcyjne analizuje się elektroforetycznie, lokalizuję prążek odpowiadający zamplifikowanemu produktowi (taki sam będzie obecny w kontroli). W tym momencie można stwierdzić w której części biblioteki znajduje się poszukiwany gen. Np. jeśli produkt amplifikacji znalazł się w mieszaninie z filtrów od 1-3 możemy do nich zawęzić pole poszukiwań. Prowadzi się wtedy PCR dla mieszaniny klonów z tych właśnie filtrów razem i dla każdego z nich z osobna (przy kontroli pozytywnej). W ten sposób można zidentyfikować pojedynczy filtr, hybrydyzować z nim produkt PCR co pozwoli na lokalizację pojedynczego klonu. Metoda, choć wygląda na skomplikowaną jest w wielu przypadkach mniej kłopotliwa i czasochłonna niż standardowa hybrydyzacja, przede wszystkim dlatego, że opiera się na prostym, bardzo logicznym schemacie.

Wędrówka po chromosomie

Zdecydowana większość wektorów do klonowania oferuje stosunkowo małą pojemność. Wyjątkiem są tutaj YACi i kosmidy. Zdarzają się doświadczenia, w których klonuje się fragmenty o długości do milionów par zasad. W takich przypadkach stosuje się technikę wędrówki po chromosomie (ang. chromosome walking). Żeby móc korzystać z tej metody trzeba dysponować sondą przynajmniej do fragmentu szukanego genu, albo genu leżącego w bliskim jego sąsiedztwie, W skrócie technika wędrówki po chromosomie opiera się na wyszukiwaniu w bibliotece DNA klonu zawierającego fragment DNA hybrydyzujący z naszą sondą i użyciu skrajnej części znalezionego odcinka jako sondy do zidentyfikowania następnego w kolejności. Procedurę powtarza się do uzyskania fragmentów, które w sumie dają cały szukany odcinek. Schemat wędrówki po chromosomie przedstawia Rysunek 3.

• 
  Rysunek 3.Wędrówka po chromosomie ["Molecular cell biology" Lodish, Berk, Zipursky]. www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=mcb.figgrp.1947

W podsumowaniu należy stwierdzić, że znaczenie bibliotek DNA, ich tworzenia, utrzymywania i przeszukiwania we współczesnej nauce jest nie do przecenienia, co mam nadzieje udowadnia powyższy tekst. Techniki te są pracochłonne i raczej kosztowne, ale obecnie liczy się głównie ich aspekt utylitarny, choć oczywiście stosowane metody ulegają ciągłym udoskonaleniom. Biblioteki genomowe jeszcze przez długi czas będą wielce użytecznym narzędziem, stąd podstawowa wiedza na ich temat może okazać się bardzo przydatna.

Literatura

• Lodish, Berk, Zipursky "Molecular cell biology"

• Piotr Węgleński "Genetyka molekularna"; PWN

• He CF, Takao K. - "PCR-based screening BAC library and direct end sequencing of BAC clones." PMID: 15651679

• "Genomic and cDNA Libraries" - http://www.web-books.com/MoBio/Free/Ch9B.htm

• Prof. Peter Chantler, "Recombinant DNA - course: Molecular biology of the cell" http://www.rvc.ac.uk/Extranet/DNA_1/0_intro.htm

• FURMAN Dr. L. K. Thompson, Biology Department, course: "Biology 21:Genetics/Recombinant DNA Technology" http://alpha.furman.edu/~lthompso/bgy30/30index.htm

• Fred Hutchinson Cancer Research Center - http://www.fhcrc.org/education/courses/cancer_course/basic/approaches/libraries.html

• German Human Genome Project - "Establishment of DNA libraries" http://www.dhgp.de/intro/strategies/methoden03.html

Kategorie: Biotechnologia | Genetyka

ostatnio modyfikowane 2006-01-17 08:27:59 About :: Contact us :: FindPage

---