1

Cz.2_ GENETYKA_Laboratorium_2013/14

1. IZOLACJA DNA PLAZMIDOWEGO BAKTERII

Opracowano szereg metod oczyszczania plazmidowego DNA bakterii, z których ka

ż

da obejmuje

trzy etapy: - hodowl

ę

bakterii (namna

ż

anie plazmidów)

- liz

ę

bakterii, (rozpuszczenie)

- oczyszczanie plazmidowego DNA.

Plazmidy izoluje si

ę

najcz

ęś

ciej z hodowli płynnych, w których podło

ż

e uzupełnione jest

odpowiednim antybiotykiem, którego gen oporno

ś

ci znajduje si

ę

na plazmidzie. We wszystkich

metodach izolacji plazmidowego DNA wykorzystuje si

ę

dwie istotne ró

ż

nice pomi

ę

dzy DNA

genomowym a DNA plazmidowym bakterii: - DNA genomowy jest wielokrotnie wi

ę

kszy od DNA

plazmidu, - podczas procedury izolacji DNA plazmidowego DNA genomowy zostaje trwale

zniszczony, podczas gdy DNA plazmidowy pozostaje w postaci form CCC (ang. covalently closed

circle).

Odwirowane komórki bakteryjne poddawane s

ą

lizie. Bakterie ulegaj

ą

lizie pod wpływem

detergentów (SDS, Sarkozyl, Triton X-100), rozpuszczalników organicznych, roztworów

alkalicznych (liza alkaliczna) lub wysokiej temperatury (liza termiczna). Stosowany mo

ż

e by

ć

równie

ż

lizozym - enzym trawi

ą

cy

ś

cian

ę

komórkow

ą

bakterii (nie działa w pH<8.0). W metodzie lizy

alkalicznej bufor o wysokim pH zawieraj

ą

cy NaOH i SDS powoduje całkowit

ą

liz

ę

komórki jak

równie

ż

denaturacj

ę

genomowego DNA, natomiast plazmidowy DNA w formie CCC zostaje

zdenaturowany jedynie na niewielkich odcinkach. W przypadku otrzymywania plazmidowego DNA

metod

ą

termiczn

ą

, czynnikiem denaturuj

ą

cym jest wysoka temperatura, w której DNA genomowy i

plazmidowy zachowuj

ą

si

ę

podobnie jak w wysokim pH.

Nast

ę

pny etap oczyszczania DNA polega na oddzieleniu DNA od zwi

ą

zanych z nim białek.

Zwykle stosuje si

ę

do tego celu nasycony buforem roztwór fenolu lub jego mieszanin

ę

z

chloroformem i alkoholem izoamylowym. Białka mo

ż

na równie

ż

usun

ąć

przez trawienie ich

proteinazami (zwykle proteinaz

ą

K). Usuni

ę

cie kwasu RNA przeprowadza si

ę

enzymatycznie,

inkubuj

ą

c próbki z RNaz

ą

(woln

ą

od DNazy), przez s

ą

czenie molekularne lub wirowanie w

gradiencie g

ę

sto

ś

ci. W metodzie lizy alkalicznej, kiedy liniowe cz

ą

steczki DNA ulegaj

ą

denaturacji,

natomiast superzwini

ę

te formy CCC plazmidu s

ą

po denaturacji nadal splecione, neutralizacja pH

roztworami o wysokim st

ęż

eniu soli (np. octan amonu) prowadzi do renaturacji jedynie DNA

plazmidowego, podczas gdy DNA genomowy wraz z RNA i białkami wytr

ą

ca si

ę

w postaci

serowatego osadu. Z odbiałczonych próbek DNA wytr

ą

cany jest alkoholem etylowym lub

izopropanolem w obecno

ś

ci octanu potasowego, sodowego lub amonowego.

Wszystkie metody otrzymywania plazmidowego DNA, z wyj

ą

tkiem lizy alkalicznej, wymagaj

ą

oddzielenia tego DNA od DNA genomowego w gradiencie chlorku cezu w obecno

ś

ci bromku

etydyny. Wykorzystuje si

ę

tu fakt,

ż

e bromek etydyny intensywniej interkaluje do zdenaturowanego

DNA genomowego ni

ż

do DNA plazmidowego, powoduj

ą

c cz

ęś

ciowe rozwini

ę

cie helisy DNA i

2

wydłu

ż

enie cz

ą

steczki, co powoduje zmniejszenie jej g

ę

sto

ś

ci pławnej. Ró

ż

nica w g

ę

sto

ś

ci

pomi

ę

dzy form

ą

CCC a liniow

ą

i kolist

ą

OC (ang. open circle) wynosi około 0.04 g/ml i jest

wystarczaj

ą

ca do oddzielenia superzwini

ę

tego DNA podczas wirowania w gradiencie g

ę

sto

ś

ci

chlorku cezu w obecno

ś

ci bromku etydyny. Pasmo superzwini

ę

tego DNA układa si

ę

poni

ż

ej pasma

utworzonego przez liniowe fragmenty chromosomowego DNA oraz formy liniowej i OC plazmidu.

Cz

ą

steczki RNA maj

ą

najwi

ę

ksz

ą

g

ę

sto

ść

i zbieraj

ą

si

ę

na dnie probówki wirowniczej, za

ś

białka

pozostaj

ą

w górnej warstwie roztworu.

Oczyszczanie plazmidowego DNA przeprowadzi

ć

mo

ż

na równie

ż

metod

ą

wirowania lizatów

komórkowych w gradiencie alkalicznej sacharozy (w

ś

rodowisku alkalicznym formy liniowe i OC

ulegaj

ą

rozdzieleniu na pojedyncze nici i sedymentuj

ą

3-4 razy wolniej ni

ż

niezdenaturowana

superzwini

ę

ta forma CCC), stosuj

ą

c wymieniacze jonowe (np. kolumienki Qiagen) lub filtracj

ę

na

ż

elach.

PYTANIA

1. Jakie s

ą

etapy izolacji plazmidowego DNA bakterii

2. Jakie s

ą

ró

ż

nice miedzy DNA genomowym a plazmidowym bakterii?

3. Jak usuwa si

ę

białka, genomowe DNA i RNa z próby

4. Narysuj wynik wirowania gradiencie chlorku cezu w obecno

ś

ci bromku etydyny w trakcie lizy

alkalicznej

ENZYMY RESTRYKCYJNE. MAPY RESTRYKCYJNE

Enzymy restrykcyjne (ang. restriction enzymes) s

ą

enzymami izolowanymi z bakterii, zdolnymi do

rozpoznawania specyficznych sekwencji w DNA i przecinania dwuniciowej cz

ą

steczki DNA. Enzymy

restrykcyjne typu II wymagaj

ą

jako substratu dwuniciowej cz

ą

steczki DNA, zawieraj

ą

cej co najmniej

jedn

ą

sekwencj

ę

rozpoznawan

ą

przez dany enzym, oraz jonów magnezu. DNA zostaje przeci

ę

te w

obr

ę

bie lub w okolicy palindromowej sekwencji rozpoznawanej. Sekwencja palindromowa w

genetyce oznacza tak

ą

sekwencj

ę

DNA, dla której sekwencja komplementarna jest identyczna (przy

zało

ż

eniu,

ż

e obie sekwencje czytamy z uwzgl

ę

dnieniem polarno

ś

ci nici; zgodnie z przyj

ę

tym

obyczajem - od ko

ń

ca 5' do 3'):

5' A A T T 3'
3' T T A A 5'

5' A G G C C T 3'
3' T C C G G A 5'

Niektóre enzymy produkuj

ą

"lepkie ko

ń

ce" 3'. Wszystkie natomiast pozostawiaj

ą

grup

ę

fosforanow

ą

na ko

ń

cu 5', a grup

ę

hydroksylow

ą

na ko

ń

cu 3'. "Lepkie ko

ń

ce" maj

ą

du

ż

e znaczenie przy

klonowaniu genów: sekwencje "lepkich ko

ń

ców" powstałych w wyniku działania tego samego

enzymu s

ą

komplementarne. W obecno

ś

ci enzymu ligazy mo

ż

na takie cz

ą

steczki ponownie

poł

ą

czy

ć

ze sob

ą

kowalencyjnie. Nazewnictwo enzymów restrykcyjnych opiera si

ę

na literowych

skrótach, w których pierwsza litera pochodzi od rodzaju bakterii, a druga i trzecia od gatunku.

Nast

ę

pna litera oznacza szczep lub typ, a kolejne enzymy z danego typu lub szczepu otrzymuj

ą

liczby rzymskie.

Enzymy pochodz

ą

ce z ró

ż

nych szczepów, ale rozpoznaj

ą

ce te same sekwencje DNA, nazywaj

ą

si

ę

izoschizomerami.

3

Zdarza si

ę

,

ż

e dwa enzymy wytwarzaj

ą

takie same "lepkie ko

ń

ce", mino

ż

e rozpoznaj

ą

ró

ż

ne

sekwencje DNA. Enzym BamHI produkuje ko

ń

ce GATCC (rozpoznaje sekwencj

ę

GGATCC), za

ś

enzym Bgl II, wytwarzaj

ą

cy takie same "lepkie ko

ń

ce", rozpoznaje sekwencj

ę

AGATCT. Umo

ż

liwia

to klonowanie DNA strawionego BamHI w wektorze strawionym BglII, ale nie ka

ż

dy sklonowany

odcinek DNA b

ę

dzie mógł by

ć

wycinany enzymem Bgl II.

Do pojedynczej reakcji trawienia u

ż

ywa si

ę

zwykle 0,2 - 1 ug DNA w roztworze o obj

ę

to

ś

ci 20 ul lub

mniejszej. Bufory do trawie

ń

przygotowuje si

ę

w postaci 10-krotnie st

ęż

onych roztworów ró

ż

ni

ą

cych

si

ę

mi

ę

dzy sob

ą

zawarto

ś

ci

ą

soli. Je

ż

eli DNA ma by

ć

strawiony dwoma enzymami wymagaj

ą

cymi

ró

ż

nych buforów, najpierw przeprowadza si

ę

trawienie w buforze o ni

ż

szej soli, a nast

ę

pnie

podwy

ż

sza si

ę

st

ęż

enie soli w mieszaninie przez dodanie odpowiedniej obj

ę

to

ś

ci st

ęż

onego NaCl.

Inkubacj

ę

preparatów DNA z enzymami restrykcyjnymi prowadzi si

ę

w temperaturze 37

o

C w czasie

1 godziny lub dłu

ż

ej. Przerwanie reakcji (zwykle niekonieczne) mo

ż

na przeprowadzi

ć

przez

termiczn

ą

inaktywacj

ę

enzymu (15 minut, 65

o

C) lub dodaj

ą

c EDTA pH 8.0 do ko

ń

cowego st

ęż

enia

10 mM (chelatacja jonów magnezu).

Ź

ródłem informacji o enzymach restrykcyjnych (ich

termostabilno

ś

ci i wymaganiach co do st

ęż

enia soli) s

ą

katalogi firm produkuj

ą

cych te enzymy (np.

New England Biolabs, Promega). Jednostka enzymu restrykcyjnego to taka jego ilo

ść

, która trawi

kompletnie 1 ug DNA faga l (ok. 50 kb) w czasie 1 godziny w 37

o

C.

Podstawow

ą

cech

ą

produktów trawienia DNA enzymami restrykcyjnymi jest to,

ż

e otrzymywane

fragmenty DNA daj

ą

si

ę

rozdzieli

ć

na

ż

elach w taki sposób,

ż

e w ka

ż

dym pr

ąż

ku na

ż

elu znajduj

ą

si

ę

cz

ą

steczki DNA o identycznej sekwencji nukleotydowej. Fakt ten pozwala na precyzyjn

ą

obróbk

ę

DNA, m.in. konstruowanie map restrykcyjnych badanego DNA (mapa restrykcyjna

wskazuje miejsca ci

ę

te przez enzymy restrykcyjne). Analizuj

ą

c na

ż

elach produkty trawienia danego

DNA ró

ż

nymi enzymami restrykcyjnymi, stosowanymi pojedynczo i w kombinacjach, mo

ż

na ustali

ć

wzajemne poło

ż

enie i odległo

ś

ci pomi

ę

dzy sekwencjami rozpoznawanymi przez te enzymy. Oprócz

tego, DNA poci

ę

ty enzymami restrykcyjnymi mo

ż

na poddawa

ć

ligacji z wektorem i tworzy

ć

zrekombinowane (zawieraj

ą

ce sklonowany DNA) plazmidy. Aby wyznaczy

ć

wielko

ść

nieznanych

fragmentów DNA, stosuje si

ę

standardy wielko

ś

ci (cz

ą

steczki DNA o znanej wielko

ś

ci, poddawane

elektroforezie w tym samym

ż

elu co cz

ą

steczki badane).

PYTANIA

1. Narysuj wymy

ś

lon

ą

sekwencje DNA palindromowe i nie palindromowe

2. Czy ró

ż

ne enzymy restrykcyjne mog

ą

produkowa

ć

takie same lepkie ko

ń

ce

3. Co oznacza jedna jednostka enzymu restrykcyjnego?
4. Czy w jednej reakcji mo

ż

na u

ż

ywa

ć

wi

ę

cej ni

ż

jednego enzymu

4

Ć

wiczenia praktyczne

1. Otrzymywanie DNA plazmidowego na mał

ą

skal

ę

(minilizaty) za pomoc

ą

zastawu do

izolacji Plazmid Mini

Przed przyst

ą

pieniem do

ć

wicze

ń

przeczytaj ze zrozumieniem cał

ą

instrukcje do zestawu (plik

PDF).

Odczynniki i aparatura:

- pipety automatyczne i jednorazowe ko

ń

cówki

- probówki szklane (10 ml) zawieraj

ą

ce

całonocna kultur

ę

bakteryjn

ą

(LB Amp+)

- woda
- probówki Eppendorfa,

- mikrowirówka,
- pisaki do probówek/ r

ę

czniki

papierow/stojaki/alkohol do sterylizacji miejsca
pracy, r

ę

kawiczki

Wykonanie: post

ę

puj zgodnie z protokołem izolacji z uwzgl

ę

dnieniem dwóch pierwszych kroków

(nie opisanych w protokole)

1. rozla

ć

hodowle bakteryjn

ą

do probówek Eppendorfa i zwirowa

ć

bakterie w mikrowirówce przez 1

minut

ę

(2 x 1.5 ml),

2. ods

ą

czy

ć

pipet

ą

po

ż

ywk

ę

do sucha,

Podpisz swoje próby (tak

ż

eby je rozpozna

ć

do trawienia za tydzie

ń

)

2. Trawienie plazmidu pRS 416 enzymami restrykcyjnymi i sporz

ą

dzanie mapy restrykcyjnej

(planowanie na lab.II, przeprowadzanie reakcji na lab.III)

Odczynniki i aparatura:

Mapa plazmidu

- enzymy - dostepna z ZGE (ApaI; BamHI; Bsp68I (NruI); Bsu15I (ClaI); Eco147I (StuI);

Eco321 (EcoRV); EcoRI; HindIII; NcoI; NdeI; NotI; NsbI (MstI); PaeI (SphI); PvuI; PvuII;

SacI; Sali; ScaI; SmaI; SmiI (SwaI); XbaI; XhoI)

- bufory,

- katalogi enzymów restrykcyjnych (podane temperatury inkubaji, bufory i dezaktywacje)

1. Zaplanuj ciecie restrykcyjne wybranymi dwoma enzymami restrykcyjnymi pojedynczo i

oboma na raz.

2. Na podstawie katalogów dobierz bufory, temperatur

ę

inkubacji i dezaktywacji.

Dostosuj do wybranych enzymów podany poni

ż

ej typowy protokół:

Zmieszaj w eppendorfie w podanej kolejno

ś

ci:

1µl 10x Buffer
6.5µl H2O
2µl DNA
0.5µl Enzyme
Inkubuj przez 1h w 37oC

3. Na postawie mapy oszacuj wielko

ść

powstałych po ci

ę

ciu fragmentów plazmidu.

4. Narysuj jak b

ę

dzie wygl

ą

dał

ż

el po elektroforezie

5

Ź

ródło:http://www.snapgene.com/resources/plasmid_files/yeast_plasmids/pRS416/

3.

Reakcja trawienia enzymami restrykcyjnymi (lab.III)

Odczynniki i aparatura:

- plazmid pRS416 (4898 bp) o st

ęż

eniu ok. 3 ug/ul, (po izolacji)

- probówki Eppendorfa,

- pipety, ko

ń

cówki do pipet

- bufory i enzymy restrykcyjne

Wykonaj reakcj

ę

zgodnie z protokołem opracowanym na Lab.II (dostosuj go do własnych

enzymów i buforów).

Reakcj

ę

przygotowuje si

ę

na lodzie!!!!!

6

4. Eektroforeza agarozowa - sprawdzenie ci

ę

cia restrykcyjnego (Lab.IV)

Odczynniki i aparatura:

- plazmid nie poci

ę

ty

- plazmid poci

ę

ty

- standard wielko

ś

ci DNA,

- obci

ąż

nik do prób (niebieski)

- probówki Eppendorfa,
- aparat do elektroforezy (laboratoria 3)
Gotowy zel agarozowy zawieraj

ą

cy barwnik

DNARed

- do strawionych próbek oraz do markera wielko

ś

ci DNA doda

ć

1/10 obj

ę

to

ś

ci barwnika do

elektroforezy,

- nanie

ść

próbki do studzienek na

ż

elu przy pomocy pipety automatycznej (Uwaga! Minimalna ilo

ść

DNA, któr

ą

wida

ć

na

ż

elu w postaci pr

ąż

ka, wynosi około 10 ng. Nie nale

ż

y przekracza

ć

200 ng

DNA w pr

ąż

ku),

- prowadzi

ć

elektroforez

ę

w buforze TBE przy napi

ę

ciu nie przekraczaj

ą

cym 5 V/cm,

- sfotografowa

ć

ż

el na transiluminatorze w

ś

wietle UV,

- oszacowa

ć

na podstawie krzywej wielko

ś

ci trawionych fragmentów DNA i porówna

ć

z planowan

ą

przez siebie.

Przygotowanie dr Dominika Włoch-Salamon na podstawie: http://arete.ibb.waw.pl/docs/Skrypt-dla-fakultetu-99.html

RAPORT - nale

ż

y odda

ć

pod koniec zaj

ęć

(

ż

eby prowadz

ą

cy wiedział jakie enzymy

przygotowa

ć

na kolejne zaj

ę

cia)

Zaplanuj ciecie restrykcyjne wybranymi dwoma enzymami restrykcyjnymi pojedynczo i oboma na

raz. Na podstawie katalogów dobierz bufory, temperatur

ę

inkubacji i dezaktywacji.

1. Wypisz dostosowany do wybranych enzymów podany poni

ż

ej typowy protokół:

Zmieszaj w eppendorfie w podanej kolejno

ś

ci:

1µl 10x Buffer
6.5µl H2O
2µl DNA
0.5µl Enzyme
Inkubuj przez 1h w 37oC

2. Podaj wielko

ś

ci fragmentów DNA powstałych po ci

ę

ciach zaplanowanych przez Ciebie

3. Narysuj jak b

ę

dzie wygl

ą

dał

ż

el po elektroforezie